CN112280899A - 猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用 - Google Patents

猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测猪星状病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反应液，所述的PCR反应液包括引物对、TaqMan探针、2×PrimDirect Probe RT‑Qpcr Mix with UNG等。所述的试剂盒还包括标准品。本发明还公开了一种所用所述试剂盒检测猪星状病毒2型的方法以及该试剂盒在猪星状病毒2型诊断中的应用。本发明所述的试剂盒特异性好、灵敏度高、重复性好。可以为PAstV2的流行病学调查以及检测诊断PAstV2提供准确、可靠的技术工具。

Description

猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR及其应用，属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。
背景技术
星状病毒是一种无囊膜包被的单股正链RNA病毒，其基因组全长约6.4kb～7.3kb。星状病毒的宿主范围极广，可感染人、猪、牛、犬、猫等多种哺乳动物，以及鸡、鸭、火鸡等禽类动物。猪在感染星状病毒后常常表现为无症状或轻微腹泻等临床症状，因而被认为是一种腹泻相关病原。猪星状病毒目前可分为5个基因型(PAstV1～PAstV5)，遗传进化分析结果显示，各基因型可能存在不同的进化祖先。流行病学调查结果显示，PAstV在我国猪群内的流行率较高，且5个基因型均有发现。因此，建立一种快速、准确的PAstV2实验室诊断方法，对于了解PAstV2在我国猪群中的流行情况具有重要意义。本发明旨在建立一种可以快速、准确地检测PAstV2的TaqMan荧光定量PCR方法，并以此为基础制备试剂盒，为PAstV2的流行病学调查以及检测诊断PAstV2提供准确、可靠的技术工具。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、准确地检测PAstV2的TaqMan荧光定量PCR的试剂盒。
因此，本发明一方面提供了一种猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测猪星状病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反应液，所述的PCR反应液包括引物对和Taqman探针，所述引物对和TaqMan探针的序列如下：
PAstV2-F：5’-CTGCGCCTACCACCGCGCAGGAGG-3’；
PAstV2-R：5’-CGAGAGTCCTCVAGGAAGTTGTA-3’；
PAstV2-probe：5’-FAM-TACCACCATGTGACCCAGACCTNCCYTTC-3’BHQ1。
优选地，本发明所述的猪星状病毒2型Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。
优选地，本发明所述的PCR反应液还包括2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mixwith UNG
优选地，本发明所述的试剂盒的反应体系为2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mixwith UNG 12.5μL，PAstV2-F、PAstV2-R各0.5μL，PAstV2-probe 0.5μL，处理后样本2μL，灭菌水补齐至25μL。
优选地，本发明所述的试剂盒还包括标准品，所述标准品为猪星状病毒2型阳性样品cDNA扩增片段回收纯化后克隆至pMD18-T中所得，所述标准品浓度为1.4×107copies/μL、1.4×106copies/μL、1.4×105copies/μL、1.4×104copies/μL、1.4×103copies/μL、1.4×102copies/μL。
优选地，本发明所述的标准品中目的片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，本发明所述的试剂盒的反应条件为：90℃3min，56℃5min，为第一步循环；95℃5s，56℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
另一方面，本发明还提供了一种使用所述的试剂盒检测猪星状病毒2型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：1)样品的处理；2)将上述步骤所得样品作为模板，加到试剂盒的反应体系中，进行荧光定量PCR反应，并同时以标准品作为样品进行荧光定量PCR反应；3)以标准品Ct值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标做标准曲线，将样品的Ct值代入标准曲线中计算样品的拷贝数。
优选地，本发明所述的试剂盒检测猪星状病毒2型的方法中的步骤1)中的样品为粪便。
再一方面，本发明还提供了一种所述的猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒在猪星状病毒2型诊断中的应用。
本发明根据NCBI数据库上公布的PAstV2的ORF1ab基因序列进行比较分析，在保守区域设计1对特异性引物和探针，建立检测PAstV2的TaqMan实时定量PCR的方法，并在此基础上形成了一种检测猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒。该试剂盒的重复性试验得到的平均变异系数结果较好(＜2％)；运用该试剂盒建立的标准曲线有良好的线性关系，相关系数可达0.9971。与其他病毒同时检测无交叉反应，能特异性检测PAstV2，并具有较好的稳定性和重复性。目前，针对PAstV2的研究尚处于初级阶段，PAstV2尚未被分离到，PAstV2单独感染以及与其他PAstV基因型混合感染的致病力均有待于进一步研究。本发明所建立的PAstV2 TaqMan荧光定量检测试剂盒，为PAstV2的快速检测及其流行病学调查提供了快速、简便、可靠的检测手段。
相比于传统的SYBR Green法，本发明所使用的的TaqMan探针法具有如下优点：(1)本发明无需提取样品内RNA，收集的粪便等样品经处理后可直接加入反应液中进行RT-qPCR反应，节约了大量的时间成本。(2)本发明根据保守性特异序列设计并合成特异性引物及Taqman探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测猪星状病毒2型，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测样本的快速、有效检测。(3)由于采用定量检测技术-Taqman-荧光定量PCR(Real-time PCR)，该方法(Real-time PCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。(4)由于探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。(5)Taqman探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。
附图说明
图1为本发明中标准品重组质粒的PCR扩增结果。
图2为本发明中PAstV2 TaqMan PCR扩增曲线(A)和标准曲线(B)。
图3为本发明中PAstV2 qPCR扩增引物的熔解曲线，其中1～7：猪星状病毒2型1.4×101copies/μL～1.4×107copies/μL的DNA；8：阴性对照。
图4为本发明中PAstV2 Taqman荧光定量qPCR的特异性分析图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。
实施例1材料与方法
1.1阳性样品材料
猪星状病毒2型(PAstV2)、猪肠道病毒(porcine enteric virus，PEV)、猪塞内卡病毒(Senecavirus，SVV)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory virus，PRRSV)的阳性核酸样本，均由本实验室鉴定保存。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪轮状病毒(porcinerotavirus，RV)三联活疫苗购自哈尔滨维科生物技术开发公司。猪乙脑病毒(Japanenseencephalitis virus，JEV)购于武汉科前生物股份有限公司。
1.2主要试剂
pMD18-T载体、E.coli DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。Premix TaqTM、DL2000DNA Marker、RNAiso Plus、2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mix with UNG均为宝日医生物技术公司产品。
1.3主要仪器
NanoDrop OneC超微量紫外分光光度计购自美国赛默飞世尔科技公司。LightCycler 96实时荧光定量PCR仪购自德国罗氏诊断有限公司。核酸水平电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。PCR仪购自美国伯乐Bio-Rad公司。
1.4引物、探针的设计与合成
收集GenBank上登录的PAstV2 ORF1ab基因序列，并进行比对分析，在其保守区域设计特异性引物(PAstV2-F/R)和荧光探针(PAstV2-Probe)，序列见表1，探针及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并用ddH2O稀释至浓度为10μmol/L，-20℃保存备用。
表1引物序列
Figure BDA0002743880310000041
1.5样品处理
用PBS将粪便样品进行10倍漩涡震荡稀释，8 000×g，4℃离心，取上清，-80℃保存。
1.6标准品的制备
以阳性PAstV2样品cDNA作为模板，利用以上qPCR引物PCR扩增相应片段，经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收纯化目的片段并克隆至pMD18-T载体。将所得重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，取单克隆菌落，LB培养基增菌培养16h后提取质粒。提取的重组质粒经双酶切鉴定和测序鉴定为阳性后命名为pMD19-T-PAstV2，利用分光光度计测定质粒的浓度，根据公式：DNA拷贝数＝质粒浓度(ng/μL)×10-9/(660×标准质粒碱基数)计算质粒的拷贝数，标准质粒碱基数为2899。重组质粒以10倍稀释后作为标准品，-20℃保存备用。
1.7标准曲线的建立
在不同退火温度下(52℃、55℃、58℃、60℃、62℃和65℃)进行PCR反应，以确定引物的最适退火温度，采用矩阵法对探针浓度(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L)和引物浓度(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L)进行优化，最终获得最适合的探针引物浓度配比，确定反应体系。将1.6中制备的标准品进行荧光定量PCR反应，以获得标准曲线和熔解曲线。
1.8荧光定量PCR方法的特异性试验
利用建立的TaqMan qPCR方法对本实验室保存的PEV、PRRSV、SVV、CSFV、JEV及猪三联活疫苗(PEDV、RV、TGEV)阳性样本的cDNA及PRV阳性样本的DNA模板进行扩增，以PAstV2的重组质粒为阳性对照，设ddH2O为阴性对照，以验证该方法的特异性。
实施例2试验结果
2.1标准质粒的制备
以提取的PAstV2阳性样品的cDNA为模板进行PCR扩增，结果显示，目的条带为299bp(图1和SEQ ID NO.1)，与预期相符。目的片段回收纯化后克隆至载体pMD18-T中，构建的重组质粒标准品，经PCR和测序鉴定，结果显示目的片段与预期插入片段相同，表明重组质粒标准品正确构建。
2.2反应条件的优化
优化后的荧光定量反应体系：2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mix with UNG12.5μL，PAstV2-F、PAstV2-R各0.5μL，PAstV2-probe 0.5μL，处理后样本2μL，灭菌水补齐至25μL。优化后的反应条件：90℃3min，56℃5min，为第一步循环；95℃5s，56℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
2.3荧光标准曲线的建立
测定的标准质粒后换算拷贝数为1.4×1010copies/μL，10倍稀释后，取1.4×102～1.4×107copies/μL的标准品质粒进行荧光定量PCR反应，获得标准曲线(图2)，结果显示，标准曲线线性关系良好，相关系数R2为0.9932，可作为后续试验的参照。
2.3熔解曲线分析
熔解曲线(图3)显示，质粒标准品均出现了单峰，熔解温度在85℃±0.5℃，说明建立的PAstV2 qPCR检测方法无非特异性扩增。
2.4特异性试验
利用建立的TaqMan qPCR方法对本实验室保存的PEV、PRRSV、SVV、CSFV、JEV、猪3联活疫苗(PEDV、RV、TGEV)阳性样本的cDNA及PRV阳性样本的DNA模板进行特异性检测。结果显示，除PAstV2阳性对照扩增得到目的片段以外，其他病原的检测结果均为阴性，该方法与其他主要猪病病原无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性(图4)。
上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西中医药大学第一附属医院
<120> 猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 标准品目的片段序列()
<400> 1
ctgcgcctac caccgcgcag gaggttagtg ccagacaact atccagttgt ctgcaatctt 60
ccaataaata ggcccatttt tgataccaag ttagctgatg accctttgct tggcctctta 120
ccaccatgtg acccagacct tcccttcgga ccagccgtgt ggggacctga ggcttatacc 180
aaatcatttg aaaagtttta ctacgcagag ccatcaaaat tttgggaact ataccccgag 240
gagtgtgcct tcgccgacaa gcagtggcgc aaacactaca acttccttga ggactctcg 299

Claims (10)

1.一种猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测猪星状病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反应液，所述的PCR反应液包括引物对和Taqman探针，所述引物对和TaqMan探针的序列如下：
PAstV2-F：5’-CTGCGCCTACCACCGCGCAGGAGG-3’；
PAstV2-R：5’-CGAGAGTCCTCVAGGAAGTTGTA-3’；
PAstV2-probe：5’-FAM-TACCACCATGTGACCCAGACCTNCCYTTC-3’BHQ1。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的猪星状病毒2型Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液还包括2×PrimDirectProbe RT-Qpcr Mix with UNG。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的反应体系为2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mix with UNG 12.5μL，PAstV2-F、PAstV2-R各0.5μL，PAstV2-probe 0.5μL，处理后样本2μL，灭菌水补齐至25μL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括标准品，所述标准品为猪星状病毒2型阳性样品cDNA扩增片段回收纯化后克隆至pMD18-T中所得，所述标准品浓度为1.4×107copies/μL、1.4×106copies/μL、1.4×105copies/μL、1.4×104copies/μL、1.4×103copies/μL、1.4×102copies/μL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的标准品中目的片段的序列如SEQID NO.1所示。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的反应条件为：90℃3min，56℃5min，为第一步循环；95℃5s，56℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
8.一种使用权利要求1所述的试剂盒检测猪星状病毒2型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
1)样品处理；
2)将上述步骤所得处理后样品直接加到试剂盒的反应体系中，进行荧光定量PCR反应，并同时以标准品作为样品进行荧光定量PCR反应；
3)以标准品Ct值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标做标准曲线，将样品的Ct值代入标准曲线中计算样品的拷贝数。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的样品为粪便。
10.一种如权利要求1所述的猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒在猪星状病毒2型诊断中的应用。
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