CN111500774B - 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT‑PCR试剂盒，属于兽医传染病检测技术领域。本试剂盒包括：（1）检测流行性出血病病毒的特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示；（2）8对检测不同血清型流行性出血病病毒的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.18所示；（3）反应试剂与阳性、阴性核酸对照。本发明具有灵敏度高、特异性好、快速简便、成本低廉的优势，一方面不仅可准确的对EHDV及其血清型进行鉴定，另一方面通过对扩增病毒的核酸序列测序，获取流行性出血病病毒的关键遗传特征，为分析病毒的进化特征提供数据。

Description

一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，具体涉及采用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测流行性出血病病毒核酸并对病毒的血清型进行鉴定的试剂盒。

背景技术

流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)感染引起的流行性出血病(Epizootic haemorrhagic disease,EHD)是一种严重侵害反刍动物的虫媒病毒病。EHDV主要通过吸血库蠓(Culicoides.spp)对动物叮咬进行传播，可感染包括绵羊、山羊、黄牛、水牛、鹿以及美洲羊驼在内的多种反刍动物。本病对鹿和牛的危害最为严重，可引起感染动物体温升高、口腔与皱胃黏膜发生出血与糜烂、蹄冠出血和跛行，妊娠期动物出现流产或死胎，奶牛或哺乳期动物的产奶量急剧减少。EHDV主要流行于北纬49度至南纬35度之间的热带、亚热带及温带地区，疫病的爆发给牛羊养殖业带来严重的经济损失，阻碍畜产品的正常国际贸易。近年来随着全球气候变暖，媒介昆虫活动日益频繁，EHDV-1型、EHDV-2型、EHDV-6型与EHDV-7型病毒多次在中东地区、亚洲、北美洲与南美洲的牛群中引起EHD疫情的爆发，表明EHDV的分布范围与致病性呈逐步增加趋势，引起了世界动物卫生组织(OIE)的高度关注，2008年本病被OIE列为法定报告的跨境动物疫病。

EHDV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，基因组由10个双链RNA节段(Seg-1至Seg-10的)构成。Seg-3编码的VP3是构成环状病毒属的内层衣壳的主要蛋白，EHDV的Seg-3/VP3的核苷酸和氨基酸序列在不同血清型EHDV毒株之间高度保守，核酸序列相似度>80.1％，氨基酸序列相似度>94.5％，是通过分子方法鉴定EHDV群特异性的重要靶序列。Seg-2编码的病毒外层衣壳蛋白VP2，是诱导感染动物产生异性中和抗体的主要蛋白，决定着EHDV的血清型，是通过分子方法确定EHDV血清型的唯一靶基因。EHDV的Seg-2/VP2具有高度变异的特性，不同血清型EHDV毒株之间Seg-2核酸序列的相似度在43.8％～70.1％之间，VP2氨基酸序列相似度在29.4％～72.2％之间。值得注意的是，同一种血清型的不同地域毒株间Seg-2核酸序列的差异度可达29.5％，据此可将同一种血清型EHDV毒株进一步分为两种地域型，Eastern型与Western型。澳大利亚、日本和中国的分离的EHDV均属Eastern型，而分离自美洲、非洲、中东的EHDV毒株为Western型。

目前世界范围已发现了9种血清型的EHDV，分别为EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8、EHDV-9与EHDV-10型。早期发现EHDV-3型经血清中和试验与测序分析，最终确定为EHDV-1型。EHDV-9型毒株分离于南美洲羊驼，但其序列信息尚未在GeneBank中公布。不同血清型EHDV在世界范围的分布不同：北美洲主要分布有EHDV-1、-2、-6型；EHDV-1、-4、-6型分布于非洲；南美洲分布有EHDV-1、-2型；澳大利亚分布有EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8型；地中海地区分布有EHDV-1、-6与-7型，日本分布有EHDV-1、-2、-7与-10等4种血清型。根据我国EHDV的血清学调查与病毒分离结果表明，我国存在多种血清型EHDV的流行，其中广西主要存在EHDV-5、-6、-7、-8血清型，广东有EHDV-1与-5型，内蒙古存在EHDV-6型，云南省主要流行EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-10型。

血清中和实验是进行EHDV血清型鉴定的传统方法，但存在以下不足：(1)成本高，准备工作繁琐：进行中和试验需准备BHK-21细胞、细胞培养基、胎牛血清、细胞瓶和细胞培养96孔板等。(2)耗时周期长：完成一轮中和实验一般需要2周的时间，十分不利于病毒血清型的快速鉴定。(3)需血清型完整的EHDV标准阳性血清以及标准参考病毒：一方面标准阳性血清的制备耗时、费力，另一方面活病毒的使用也存在病毒扩散的风险。(4)自然界中，多种血清型EHDV感染同一个宿主动物的情况十分普遍，通过中和实验进行感染病毒的血清型鉴定，往往存在对其它血清型EHDV漏检的可能。

RT-PCR技术以其特异性强、灵敏度高、速度快和检测样本量大等优点，已成为当前病毒核酸快速检测的主要方法之一。多种血清型EHDV在我国的广泛流行，不同血清型毒株之间缺乏有效的交叉免疫保护，给我国EHD的防控带来了严峻的挑战。鉴定EHDV及其血清型，是开展我国EHDV流行病学研究，制定EHD科学防控策略的关键。目前国内未见EHDV及其血清型诊断试剂盒的报道，建立快速、准确鉴定EHDV及不同血清型的诊断试剂盒，不仅有助于开展我国EHDV流行病学调查，也可为我们科学地制定EHDV防控方案提供技术保障。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒。本发明根据国内外EHDV毒株的Seg-3核酸序列保守区，设计了EHDV的血清群特异性RT-PCR扩增鉴定引物；根据国内外不同血清型EHDV毒株的Seg-2核酸序列(SEQID NO.19～SEQ ID NO.26)的保守区，设计出8种血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)的血清型特异性RT-PCR扩增鉴定引物。在此基础上，将各引物、RT-PCR试剂、EHDV各个血清型的阳性核酸对照、EHDV阴性对照等进行整合，组装为EHDV血清群特异性与血清型特异性RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒克服了EHDV传统血清中和实验耗时长、费力、实验成本高等方面的不足，具有操作简便、花费时间少、成本低廉、检测结果准确等优势，同时弥补了国内尚无检测EHDV及鉴定血清型的RT-PCR方法及试剂盒的空白，具有良好的实际应用价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒，包括检测EHDV血清群特异性引物和检测EHDV血清型的特异性引物；

所述的检测EHDV血清群特异性引物核苷酸序列如下：

上游引物EHDV-S3-F：5′-ataccaactagrgatcatagagg-3′(SEQ ID NO.1)；

下游引物EHDV-S3-R：5′-cggttctccygttggaccat-3′(SEQ ID NO.2)；

所述的检测EHDV血清型的特异性引物包括8对用于检测不同血清型EHDV的引物对，其核苷酸序列如表1所示；

表1

进一步，优选的是，还包括RT-PCR试剂、各血清型EHDV阳性核酸对照和阴性对照。

进一步，优选的是，所述的RT-PCR试剂包括dNTPs 0.5mmol/L、RNA逆转录酶2～4U/反应、RNase抑制剂2～3U/反应、Taq DNA聚合酶4～8U/反应、Mg²⁺2.0mmol/L、RT-PCR反应缓冲液。

进一步，优选的是，阳性核酸对照共8管，分别为EHDV-1型、EHDV-2型、EHDV-4型、EHDV-5型、EHDV-6型、EHDV-7型、EHDV-8型和EHDV-10型病毒标准阳性核酸模板。

进一步，优选的是，阳性对照中核酸模板浓度见表2；阴性对照为无EHDV感染牛血液提取的RNA。

表2

进一步，优选的是，首先应用EHDV血清群引物(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2)对待测样品进行EHDV血清群特异性检测，结果若为阳性，再分别用EHDV的8种血清型引物(SEQID NO.3～SEQ ID NO.18)对待测样品进行血清型特异性检测。

进一步，优选的是，EHDV血清群与血清型RT-PCR反应体系均为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix 2μL；2×1Step Buffer 25μL；上游引物20μmol/L 1μL；下游引物20μmol/L 1μL；模版RNA 4μL；RNase free H₂O 17μL，总计50μL。

进一步，优选的是，EHDV血清群与血清型RT-PCR反应程序均为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸1min。

本发明还提供所述的检测流行性出血病病毒的血清群特异性引物。

本发明并提供所述的检测流行性出血病病毒的血清群特异性引物的试剂盒。

本发明另外提供所述的检测流行性出血病病毒血清型的特异性引物。

本发明同时提供所述的检测流行性出血病病毒血清型的特异性引物的试剂盒。

本发明选择EHDV的Seg-3为靶基因，设计一对EHDV血清群特异性引物用于RT-PCR扩增检测待测毒株，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明根据8种血清型EHDV毒株(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)的Seg-2序列特征(SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.26)，设计EHDV血清型特异性鉴定引物，通过RT-PCR方法对EHDV的血清型进行鉴定，所述引物分别由8对引物构成：

第一对引物对以流行性出血病病毒血清1型(EHDV-1)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.19)为待检靶基因，所述第一对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第一对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

第二对引物对以流行性出血病病毒血清2型(EHDV-2)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.20)为待检靶基因，所述第二对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

第三对引物对以流行性出血病病毒血清4型(EHDV-4)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.21)为待检靶基因，所述第三对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述第三对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

第四对引物对以流行性出血病病毒血清5型(EHDV-5)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.22)为待检靶基因，所述第四对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所的第四对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

第五对引物对以流行性出血病病毒血清6型(EHDV-6)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.23)为待检靶基因，所述第五对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所第五对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

第六对引物对以流行性出血病病毒血清7型(EHDV-7)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.24)为待检靶基因，所述的第六对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述第六对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

第七对引物对以流行性出血病病毒血清8型(EHDV-8)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.25)为待检靶基因，所述第七对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述第七对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

第八对引物对以流行性出血病病毒血清10型(EHDV-10)毒株的Seg-2基因(SEQ IDNO.26)为待检靶基因，所述第八对上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述第八对下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

采用本发明试剂盒用RT-PCR方法对待测样品进行EHDV及其血清型检测，包括如下步骤：

(1)培养病毒核酸的提取；

(2)对步骤(1)中提取的RNA进行95℃加热5min后迅速冰水中冷却的变性处理，将EHDV基因组的双链RNA(dsRNAS)变性为单链RNA(ssRNA)；

(3)以步骤(2)中变性处理的RNA为模板，进行一步法RT-PCR扩增反应；

(4)对步骤(3)中RT-PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；

(5)对扩增的RT-PCR产物进行测序分析。

本发明主要构思为：

Seg-3基因编码的VP3蛋白构成环状病毒属的内层衣壳，Seg-3在环状病毒属的不同种病毒之间存在较大的变异，而在环状病毒属的同种病毒之间高度保守。EHDV的Seg-3/VP3的核苷酸和氨基酸序列在不同血清型EHDV毒株之间高度保守，可作为通过分子方法鉴定EHDV的靶基因序列，因此针对EHDV Seg-3基因的高度保守区域设计EHDV的群特异性RT-PCR引物，建立的EHDV群特异性RT-PCR检测方法，用于不同血清型EHDV毒株的群特异性检测。

EHDV的Seg-2基因编码病毒的外层衣壳蛋白VP2介导病毒对细胞表面受体的特异吸附，参与病毒粒子从感染细胞中的释放，诱导EHDV特异性中和抗体的产生，决定病毒的血清型，是通过分子方法确定EHDV血清型的唯一靶基因。Seg-2/VP2的核酸与氨基酸序列在不同血清型毒株之间具有高度变异的特性，因此根据不同血清型EHDV毒株Seg-2基因的差异，设计EHDV血清型特异性RT-PCR扩增引物，建立EHDV血清型特异性RT-PCR检测方法，用于鉴定EHDV毒株的血清型。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明试剂盒通过RT-PCR方法对EHDV血清群及其血清型进行鉴定，具有操作简便、特异性强、灵敏度高的特点。试剂盒首先对待检核酸样品进行EHDV血清群特异性RT-PCR扩增检测；同时，试剂盒提供了8种血清型EHDV阳性核酸对照和检测引物对，可同步进行8种血清型EHDV的鉴定，并可通过对RT-PCR产物的测序获取EHDV的Seg-2与Seg-3的序列特征。

1.试剂盒在设计上的有益特点：

(1)具有高度的特异性：开发设计的EHDV血清群特异性引物能特异性扩增EHDV的Seg-3基因，对感染牛羊的其它病毒，如蓝舌病病毒、中山病病毒以及阿卡斑病毒的核酸等均无扩增反应(结果见图1)，能准确鉴定出待测病毒样品是否为EHDV。设计的EHDV血清型特异性引物只针对相应血清型EHDV的Seg-2基因进行特异性的扩增，不同血清型EHDV毒株之间不发生扩增反应，可对EHDV的血清型进行准确定型(结果见图3)。

(2)具有高度的灵敏度：不同血清型EHDV在细胞上进行分离培养时，病毒在细胞上的增殖水平存在较大差异，导致细胞培养物中病毒的含量高低参差不齐，本发明对8种不同血清型EHDV病毒核酸检出的拷贝数均达到10²拷贝级别(结果见图4)，有较高的灵敏度；对细胞上增殖能力较弱的EHDV毒株同样具有很好的检测效果。

(3)涵盖的EHDV血清型广：在南美洲发现的EHDV-9型至今无序列报道，尚无法开发对应的RT-PCR引物。本发明试剂盒涵盖了目前世界范围已报道序列的8种血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)，特别是涵盖了新发现的EHDV-10型，可对世界范围流行的EHDV血清型进行检测。

(4)本发明还可以将检测中扩增获得的EHDV群特异Seg-3基因及血清型Seg-2基因的阳性PCR扩增产物进行送样测序，进一步了解病毒的遗传特性，所属地域型及亚型等信息。

(5)试剂盒配有阳性核酸对照和阴性对照，利于对检测结果进行判定，可用于检查试剂是否变质失效或反应条件是否适当，使试验过程具有可参照的质控标准，也使得试验具有可重复性。

2.与传统血清中和实验相比较的有益效果

本发明提供的血清型特异性RT-PCR检测试剂盒与传统的血清中和试验相比，具有快速、准确、成本低廉、安全和可获取病毒关键遗传信息等明显优势。表3展示了血清型特异性RT-PCR检测试剂盒与血清中和试验的比较。

表3

3.与现有的EHDV血清型RT-PCR鉴定技术相比较的有益效果

Pbright实验室的Narender S主要根据北美洲与中东流行EHDV毒株的Seg-2序列特征建立EHDV血清型鉴定方法(RT-PCR Assays for Seven Serotypes of EpizooticHaemorrhagic Disease Virus&Their Use to Type Strains from the MediterraneanRegion and North America)。与国外的EHDV血清型RT-PCR鉴定方法比较，本发明开发的试剂盒在鉴定我国分离的不同血清型EHDV毒株时有更高的准确性。对比试验结果显示，采用Narender S报道的方法对我国分离的70株EHDV进行血清型鉴定，结果显示对不同血清型EHDV毒株鉴定的吻合率在53.33％至71.43％之间，分别为53.33％(EHDV-1)、71.43％(EHDV-5)、70.59％(EHDV-6)和53.85％(EHDV-7)，由于国内外尚未报道EHDV-10型的检测方法，导致该血清型的检测存在空白。使用本发明开发的试剂盒对我国分离的不同血清型EHDV进行RT-PCR鉴定，相比之下具有更高的检测灵敏度，对70株EHDV血清型的鉴定的吻合率均达到100％(结果见实施例5中表7)，而且覆盖了新血清型EHDV-10的检测。

附图说明

图1为本发明实施例2中利用EHDV群特异性引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2)对8种血清型EHDV、蓝舌病病毒、阿卡斑病毒及中山病病毒标准样品进行RT-PCR检测结果：其中，从左至右依次为：泳道1表示检测EHDV-1型病毒阳性核酸对照；泳道2表示检测EHDV-2型病毒阳性核酸对照；泳道4表示检测EHDV-4型病毒阳性核酸对照；泳道5表示检测EHDV-5型病毒阳性核酸对照；泳道6表示检测EHDV-6型病毒阳性核酸对照；泳道7表示检测EHDV-7型病毒阳性核酸对照；泳道8表示检测EHDV-8型病毒阳性核酸对照；泳道10表示检测EHDV-10型病毒阳性核酸对照；泳道11表示检测蓝舌病病毒阳性核酸对照；泳道12表示检测阿卡斑病毒阳性核酸对照；泳道13表示检测中山病病毒阳性核酸对照；泳道N表示阴性对照；泳道M表示DNA Marker DL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图2为本发明实施例2中利用8对EHDV血清型特异性引物(SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.18)检测8种对应的血清型EHDV阳性核酸对照的RT-PCR检测结果：泳道1表示EHDV-1型引物检测EHDV-1型病毒阳性核酸对照；泳道2表示EHDV-2型引物检测EHDV-2型病毒阳性核酸对照；泳道4表示EHDV-4型引物检测EHDV-4型病毒阳性核酸对照；泳道5表示EHDV-5型引物检测EHDV-5型病毒阳性核酸对照；泳道6表示EHDV-6型引物检测EHDV-6型病毒阳性核酸对照；泳道7表示EHDV-7型引物检测EHDV-7型病毒阳性核酸对照；泳道8表示EHDV-8型引物检测EHDV-8型病毒阳性核酸对照；泳道10表示EHDV-10型引物检测EHDV-10型病毒阳性核酸对照；泳道(N1、N2、N4、N5、N6、N7、N8、N10)分别表示EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10血清型特异性引物检测阴性对照结果；泳道M表示DNA MarkerDL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图3为本发明实施例3中利用8对EHDV血清型特异性引物(SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.18)分别对8种血清型EHDV样品、蓝舌病病毒样品、阿卡斑病毒样品和中山病病毒样品进行RT-PCR扩增，检测引物特异性。其中：左边由上往下，电泳图P1表示EHDV-1血清型鉴别引物(SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4)检测结果；电泳图P2表示EHDV-2血清型鉴别引物(SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.6)检测结果；电泳图P4表示EHDV-4血清型鉴别引物(SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.8)检测结果；电泳图P5表示EHDV-5血清型鉴别引物(SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10)检测结果；电泳图P6表示EHDV-6血清型鉴别引物(SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12)检测结果；电泳图P7表示EHDV-7血清型鉴别引物(SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14)检测结果；电泳图P8表示EHDV-8血清型鉴别引物(SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16)检测结果；电泳图P10表示EHDV-10血清型鉴别引物(SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18)检测结果。顶部由左到右：泳道1表示EHDV-1血清型病毒样品；泳道2表示EHDV-2血清型病毒样品；泳道5表示EHDV-5血清型病毒样品；泳道6表示EHDV-6血清型病毒样品；泳道7表示EHDV-7血清型病毒样品；泳道8表示EHDV-8血清型病毒样品；泳道10表示EHDV-10血清型病毒样品；泳道11表示蓝舌病病毒样品；泳道12表示阿卡斑病毒样品；泳道13表示中山病病毒样品；泳道N表示阴性对照；泳道M表示DNAMark DL5000(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图4为本发明实施例3中利用8对EHDV血清型特异性引物(SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.18)分别对不同浓度的8种血清型EHDV阳性核酸对照进行RT-PCR扩增的灵敏度检测结果；其中右下角，电泳图P1表示EHDV-1血清型引物灵敏度实验结果；电泳图P2表示EHDV-2血清型引物灵敏度实验结果；电泳图P4表示EHDV-4血清型引物灵敏度实验结果；电泳图P5表示EHDV-5血清型引物灵敏度实验结果；电泳图P6表示EHDV-6血清型引物灵敏度实验结果；电泳图P7表示EHDV-7血清型引物灵敏度实验结果；电泳图P8表示EHDV-8血清型引物灵敏度实验结果；电泳图P10表示EHDV-10血清型引物灵敏度实验结果；从左到右泳道1～10表示对应血清型病毒阳性核酸10¹～10¹⁰倍稀释后的RT-PCR检测结果；泳道N表示阴性对照；泳道M表示DL 5000Mark(Marker条带的大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图5为本发明实施例4中利用本试剂盒取对2012年～2017年分离自我国云南省、广西壮族自治区与广东省分离的EHDV毒株进行RT-PCR检测，对部分阳性样品胶回收后进行测序，并使用MEGA7.0进行系统发生树的构建，建树选择的模型为：Neighbor-joining(邻近法)，P-distance)(遗传距离模式)，Bootstrap(自举检验)取值1000。系统发生树中其它国家分离的EHDV毒株序列以“GenBank序列号_EHDV-血清型_分离国家_病毒分离时间”表示。不同血清型EHDV参考毒株以方框表示，经检测鉴定的我国分离EHDV毒株以黑色圆点表示。构建的系统发生树显示，我国分离EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10等五种血清型与对应血清型参考毒株聚为一簇，进一步表明血清型RT-PCR扩增的正确型。我国流行的EHDV-1型毒株的Seg-2属Western型，与分离自美国、尼日尼亚的EHDV-1型毒株具有共同的起源，而我国流行的EHDV-5、-6、-7与-10型等毒株的Seg-2与分离自日本、澳大利亚的对应血清型毒株聚为一簇，均属Eastern型，有着最近的亲缘关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，如Sambrook分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明实验过程中除非另有说明，否则百分号为质量百分数，比例为质量比。

实施例1不同血型EHDV阳性核酸的制备

一、EHDV-4型阳性核酸对照的制备

1、试验材料

由于无法获得EHDV-4型毒株，本发明中的EHDV-4阳性核酸对照，参照尼日利亚EHDV-4型毒株(毒株号：NIG1968/01)的Seg-3和Seg-2基因序列进行相应DNA节段的合成。合成的Seg-3 DNA长度为865bp，位于Seg-3序列全长的437-1295位；合成的Seg-2 DNA长度为496bp，位于Seg-2全长序列的2506-2776位，以上DNA序列均由金斯瑞生物科技股份有限公司代理合成。

2、试剂与仪器

pLB零背景快速连接试剂盒、质粒小提试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、Universal DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；Xba I限制性内切酶、HiScribe^TMT7 High Yield RNA Synthesis Kit和Monarch RNA Cleanup Kit购自NEB公司；EasyPureVrial DNA/RNA Kit购自全式金公司。

梯度PCR仪Veriti 96 Well Thermal Cycler(ABI)；电泳仪Power Pac Basic(BIO-RAD)；水平电泳系统DYCP-32B(北京六一)；紫外凝胶成像系统Gel Doc XR+(BIO-RAD)；紫外分光光度计Nano Vue Plus(GE)；干式恒温金属浴OSE-96(天根生化科技有限公司)；台式离心机1-14(Sigma)。

3、阳性核酸对照的制备

将体外合成的EHDV-4型Seg-2和Seg-3的DNA片段按照“pLB零背景快速连接试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书与pLB平末端克隆载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)，筛选阳性克隆菌进行测序鉴定，将阳性克隆质粒分别命名为pLB_EHDV-4_S3和pLB_EHDV-4_S2

按照“质粒小提试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书提取pLB_EHDV-4_S3和pLB_EHDV-4_S2质粒，使用Xba I限制性内切酶(NEB)对质粒进行酶切线性化，按照“Universal DNA纯化回收试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书对酶切产物进行电泳胶回收纯化。以纯化后的线性化质粒DNA作为模板，按照“HiScribe^TMT7 High Yield RNASynthesis Kit”(NEB)说明书进行EHDV-4Seg-2和Seg-3ssRNA的体外转录。使用RNA纯化试剂盒“Monarch RNA Cleanup Kit”(NEB)进行转录产物的纯化，测定纯化后的核酸浓度。根据EHDV-4Seg-2和Seg-3ssRNA的分子量计算拷贝数，RNA拷贝数计算公式为：拷贝数(拷贝/μL)＝RNA浓度(ng/μL)×6.02×10²³(拷贝/mol)×10^-9/(340×RNA碱基数)。

体外转录的EHDV-4Seg-2和Seg-3的ssRNA拷贝数分别为2.4×10¹¹拷贝/μL和3.12×10¹¹拷贝/μL，并将两份Seg-2和Seg-3的ssRNA进行等体积合后作为EHDV-4型病毒的阳性核酸对照(100μL/管)。

二、EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10型阳性核酸对照的制备

1、实验材料

EHDV-1、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株由云南省畜牧兽医科学院的云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供(病毒于2012年～2018年在我国云南省、广东省与广西壮族自治区等地的哨兵牛上分离获得)，EHDV-2(毒株号：AUS1979/01)和EHDV-8(毒株号：AUS1982/06)型毒株由澳大利亚麦克阿瑟.伊丽莎白农业研究所(ElizabethMacarthur Agricultural Institute,EMAI)提供。

2、试剂与仪器

NaOH、二乙烯亚胺(BEI)购自重庆亚翔龙生物医药有限公司，病毒RNA提取试剂盒MagMAXTM Viral RNA Isolation Kit和核酸自动提取仪KingFisher Flex购自赛默飞世尔科技有限公司，实时荧光定量PCR仪7500Fast购自ABI公司，干式恒温金属浴OSE-96购自天根生化科技有限公司。

3、阳性核酸对照的制备

取保存的EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型病毒液，用0.2mol/L NaOH配制的浓度为1.5mmol/L二乙烯亚胺(BEI)，在病毒液中加入1.5mmol/L BEI使其终浓度为0.5％，充分混匀，置37℃下作用24h对病毒进行灭活。取200μL灭活的病毒液，使用核酸提取试剂盒按说明书操作，提取的各血清型病毒总RNA，参照已经文献(2019年，中国兽医科学，第9期，蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用)，对提取的病毒核酸进行绝对定量。实验结果显示，提取的不同血清型EHDV毒株的核酸拷贝数在2.1×10⁸拷贝/μL～1.2×10¹¹拷贝/μL之间，表2给出了不同血清型EHDV核酸对照测定的拷贝数。将EHDV血清型病毒核酸按100μL每管分装后作为阳性核酸对照。

实施例2EHDV血清群和血清型特异性引物的设计及一步法RT-PCR方法的建立

以下实施例中涉及蓝舌病病毒、阿卡斑病毒及中山病病毒由云南省畜牧兽医科学院的云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供，参照实施例1中病毒灭活方法进行病毒的灭活处理。

一，本发明的试剂盒包括以下成分

阳性对照核酸：EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型病毒阳性核酸照参实施例1中准备(100μL/管)；

阴性对照：未被EHDV感染的牛血液提取的RNA(100μL/管)；

EHDV群特异性引物1对(20μmol/L，50μL/管)，EHDV血清型特异性引物8对(20μmol/L，50μL/管)；

针对在我国流行的和GenBank上登录的不同血清型EHDV毒株的血清群特异性Seg-3基因序列特征及血清型群特异性Seg-2基因序列(SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.26)特征，应用MEGA 6.0软件进行比对分析，选择不同血清型EHDV的Seg-3保守区，选择每种EHDV血清型的Seg-2的保守区，用引物设计软件Primer 5.0，分别设计1对EHDV的群特异性和8对EHDV血清型特异性引物，引物序列的方向均为5’-3’，引物序列具体如表4。

表4

二，本发明的试剂盒的使用方法

1、病毒RNA的提取

取待鉴定的病毒液200μL，进行核酸的提取。可以使用赛默飞世尔科技有限公司的PureLink^TMViral RNA/DNA Mini Kit、MagMAX^TM Viral RNA Isolation Kit或天根生化科技有限公司的TIANamp Virus DNA/RNA Kit等市售的病毒基因组提取试剂盒，按试剂盒说明书提取病毒RNA。

2、核酸变性

将样品提取的病毒RNA于95℃加热5分钟，迅速放入冰水浴中冷却进行变性处理。

3、EHDV血清群及其血清型特异性RT-PCR检测

(1)取变性后的病毒核酸为模板，以EHDV群特异性引物(SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2)，对变性后的RNA进行一步法RT-PCR扩增，反应同时设立阴性和阳性对照(阳性对照可选择试剂盒中提供的任意一种血清型EHDV阳性核酸作为对照)。

(2)若提取的病毒核酸的RT-PCR鉴定结果为EHDV阳性，可进行EHDV血清型的RT-PCR扩增鉴定。以变性后的病毒核酸为模板，使用EHDV的8种血清型特异性引物(SEQ IDNO.3-SEQ ID NO.18)分别进行一步法RT-PCR扩增，反应同时设立阴性和8种血清EHDV的阳性对照。以上RT-PCR反应均使用TaKaRa One Step RNA PCR Kit(TaKaRa公司)进行扩增。

EHDV血清群和血清型鉴定的RT-PCR均以50μL体系进行反应，体系如下：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL；2×1 Step Buffer 25μL；上游引物(20μmol/L)1μL；下游引物(20μmol/L)1μL；模版RNA 4μL；不含RNase的H₂O 17μL，总计50μL。

EHDV血清群和血清型鉴定的RT-PCR的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

取5μL RT-PCR反应产物，以1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。EHDV群特异性检测结果见图1，EHDV血清型特异性检测结果见图2。

从图1中可以看出，本发明试剂盒中的EHDV群特异性引物具有高度的特异性，与EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8、EHDV-10这8种不同血清型EHDV的核酸进行RT-PCR反应，均可产生出大小约800bp的特异性扩增条带；与蓝舌病病毒、阿卡斑病毒、中山病病毒的核酸进行RT-PCR反应，均无任何扩增条带出现。

从图2中可以看出本试剂盒的8种血清型EHDV特异性引物可以特异性的分别与EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10对应的8种不同血清型EHDV核酸进行RT-PCR反应，均可产生出符合相应扩增片段大小的特异性扩增条带。

实施例3EHDV血清型RT-PCR鉴定引物的特异性和灵敏度分析

一、一步法RT-PCR的特异性试验

1、病毒RNA的提取和一步法RT-PCR反应：

分别提取8种血清型的EHDV、蓝舌病病毒、中山病病毒和阿卡斑病毒的核酸，变性处理后，分别应用8对特异性引物，按照实施例2中的一步法RT-PCR方法的反应体系和条件进行反应，反应产物以1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2、特异性结果分析：

RT-PCR产物的电泳结果显示，本试剂盒任意一种EHDV血清型特异性引物，仅与对应EHDV血清型病毒的核酸之间产生符合预期大小的DNA扩增条带，与其它血清型EHDV的核酸之间均无扩增条带出现，与蓝舌病病毒、中山病病毒和阿卡斑病毒的核酸进行RT-PCR反应，无扩增条带出现(图3)。以上结果表明本发明试剂盒的8种血清型特异性引物有较好的特异性，

二、一步法RT-PCR的灵敏度试验

1、8种血清型EHDV阳性核酸对照的稀释及检测

取实施例1中制备的不同血清型EHDV阳性对照核酸，进行10倍梯度稀释，分别使用对应的8种血清型EHDV特异性引物，按照实施例2中的一步法RT-PCR方法的反应体系和条件进行反应。

2、检测结果

电泳图4显示，不同EDHV血清型特异性引物可检测EHDV核酸的最低拷贝数在1.1×10²拷贝/μL至8.7×10²拷贝/μL，表5列出了各EHDV血清特异性型引物能检出的最低核酸拷贝数。

表5

实施例4对病毒进行EHDV血清群和血清型检测的应用

1、样品的准备

取2012年～2017年分离自我国云南省、广西壮族自治区与广东省分离的70株EHDV毒株病毒液各50μL，参照实施例1或实施例2中病毒核酸的提取方法提取待测病毒核酸，取5μL变性后的核酸作为模板进行一步法RT-PCR扩增。

2、一步法RT-PCR鉴定与测序

对上述70份EHDV毒株按照实施例2中所示方法，应用EHDV血清群及血清型特异性引物进行RT-PCR扩增检测。将扩增产物进行电泳、胶回收与测序分析。将测序结果进行BLAST比对分析，确认EHDV毒株的血清型。从表6中可以看出，本发明的EHDV血清群和血清型鉴定试剂盒，对70份EHDV毒株核酸的血清型RT-PCR鉴定结果与病毒中和试验血清型鉴定的结果吻合率为100％。

3、系统发生树的构建

图5构建的系统发生树显示，我国分离EHDV分属EHDV-1、-5、-6、-7与-10等五种血清型与对应血清型参考毒株聚为一簇(以黑点表示)，进一步表明血清型RT-PCR扩增的正确型。我国流行的EHDV-1型毒株的属Western型，与分离自美国、尼日尼亚的EHDV-1型毒株具有共同的起源，而我国流行的EHDV-5、-6、-7与-10型等毒株的与分离自日本、澳大利亚的对应血清型毒株聚为一簇，均属Eastern型，有着最近的亲缘关系。

表6

实施例5本发明试剂盒和国外EHDV血清型RT-PCR检测方法的对比测试

1、样品的准备

取2012年～2017年分离自我国云南省、广西壮族自治区与广东省分离的70株EHDV毒株病毒液各50μL，提取病毒核酸RNA后进行变性处理，取5μL作变性后的核酸为模板。

2、一步法RT-PCR检测结果

使用本发明的EHDV血清群和血清型鉴定RT-PCR试剂盒，按照实施例2中的EHDV的检测方法，和按照英国Narender S报道的EHDV血清型鉴定方法(RT-PCR Assays for SevenSerotypes of Epizootic Haemorrhagic Disease Virus&Their Use to Type Strainsfrom the Mediterranean Region and North America)对上述70份EHDV毒株核酸进行血清型鉴定。结果见表7，本试剂盒能准确鉴定国内70株EHDV的血清型，国外EHDV血清型鉴定RT-PCR方法对中国毒株进行扩增时，出现检测灵敏度降低，甚至出现某些血清型无法扩增的现象。同时目前国内外暂未报道过新发现血清型EHDV-10型的RT-PCR鉴定方法，本试剂盒填补了这项空白。本发明试剂盒同国外EHDV血清型鉴定方法对检测和鉴定我国流行和分离的EHDV血清型对比试验结果如表7所示。

表7

注：表7中“-”表示由于目前国外暂未报道过血清型EHDV-10型的RT-PCR鉴定方法，因此导致国外方法无法进行EHDV-10的鉴定及和本试剂盒进行比较。

本试剂盒对比国外方法在检测我国分离的EHDV毒株时有更高的灵敏度，原因为不同血清型EHDV毒株之间的核酸序列差异可达56.2％，同一种血清型不同地域分离毒株的Seg-2基因序列差异也可达29.4％，据此可将同一种血清型EHDV毒株进一步分为两种地域型，东方型与西方型。澳大利亚、日本和中国的分离的EHDV均属东方型，而分离自美洲、非洲、中东的EHDV毒株为西方型。英国Narender S等学者是以分离自美国、非洲等的西方型EHDV毒株的Seg-2基因序列为目标靶基因，设计开发了血清型鉴定RT-PCR方法，但中国毒株属于东方型，东西方型毒株间Seg-2基因序列存在较大的差异(最高可达29.4％)，导致国外设计的引物与中国不同血清型EHDV的Seg-2基因序列的匹配度较低，存在较多的碱基错配，从而造成国外方法用于检测鉴定我国分离的EHDV毒株时灵敏度降低，甚至出现某些血清型无法检测的现象。

上述试验证明本发明所建立的EHDV血清群特异性和血清型特异性鉴定RT-PCR试剂盒能用于检测EHDV及其血清型的鉴定，同时具有敏感性高、特异性强、实验设备简单和操作容易等特点，适用于实验室对EHDV的快速检测及血清型的鉴定和分型。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表：

SEQ ID NO.19

SEQ ID NO.20

SEQ ID NO.21

SEQ ID NO.22

SEQ ID NO.23

/>

SEQ ID NO.24

SEQ ID NO.25

SEQ ID NO.26

/>

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ataccaacta grgatcatag agg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cggttctccy gttggaccat 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gcatacagca tagcaacggt ag 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggagatacta tttataaatg gga 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gccctattca cattctcata g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

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<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gtaagttgat gtcgccagta gc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

aaggagacaa cttcggaaga gg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ccagcggaat caagtcttct ac 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

agttgcccaa gagtatgtga 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

catcattctg taaagatagg tcg 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

aagtgcggaa cataagagat a 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

aagagtttgt agtacctcat tcc 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

atatacgagg agtgagtggt gag 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

tgccatcagg atcattgaga ca 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

ggagatacta tttataaatg gga 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

gccctattca cattctcata g 21

<210> 19

<211> 1280

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

agaaaatgat agcgtttata aatggatcat atcagaatgg aataaagata acgtaattat 60

ccccgcaaag gatggttatc tctattcgaa atattcaggt gatgatgagg atgacatact 120

agtacatgac attgatgaaa gactgtatac cgaaatgatt gaccgtactc taacaaatgg 180

ctggattgag aaagagggat tatcacagat aataaaggaa gaggttcgat tggaatcctt 240

tgattttaca aaggacgcgc atataaacga atcggggttt ttagtgttac cggaatatta 300

caataagacg atagcatcaa acatctatga ttgtaaattc aagatatcta gagtgagcat 360

aacatccgca ggaagtgatg atccatgggg aaagaagaca gcagacgaca taattaatga 420

gcggtattta tggaaaatcc cactaccgaa tatcatcgat gtgaggcctt gtttaaaggg 480

tgatttatta acctcgaatg accaagaata tagtggaagg tttgccgagg ttatcaaaga 540

attaaaggag gataaaaata tttatgagga gttcatacca atacaggatg acgtacggcc 600

ctgtatacaa gggcatatat gccgttatgc gttttacaga caaaagatca tgattttttc 660

attgctgaag cgttactatc ctatagagcg gatcttcgat ctagtagacg aagatgactt 720

tgaatacaat ctgtacttag ataaagaatg ttaccaaaaa gagttatcga ttctggactt 780

acgaagcatt tttgcattaa tttgtttttt gattgatttt gggtacgaag gaagagaaac 840

aatacgaaga gaagatgaat acttgagaat ctttaatgaa atcaattata cgaagcacac 900

acgaaaggaa gccataaatc gacatttccc gcgattttat caaaagctaa tgagagtaag 960

gagcccagaa gatattgagg atcttctacc attagttttc ttacaagctc tactgttatc 1020

tgatccatgt acggataata cagaaaagaa ctcgcatcca tttctcttat tttgtcaaga 1080

taaaattaga gtagtaccaa tacgcacggc gacacaagag cgaggactac cgttgctatg 1140

ctgtatgcac atacttaagt tccatcccgg gttacagatg agaaagaaag gaatagagga 1200

cgacataaag aaaatattac cagctgtgtt tgattattgg atcgggatgg aagtgaaccg 1260

attagatacg ggcgatagat 1280

<210> 20

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tttctttaaa ccacgaaaca ggagatacta tttataaatg ggatgtcaaa aaatttatgt 60

cggataaaaa gacgacgaga agagagggtt ggatgtataa aacgattgaa gaagaggttg 120

aggaggaaga agcgctaatc cacgacttcg atgagggcaa gtatacagaa tacatgcaaa 180

gagttataca gggaccctgg atcgagaagg acgggattgg tattctaatg aaagctgatg 240

ctgcaatcga gttattcgac ttcaccaaag atgcatatgt ggatgaatca ggttttttaa 300

aactacctcc ttattataat agatcaataa aatcggcact atatgaagct acatttaaga 360

tacgacgagt tgaaattact cagagtaaga gacctgatcc gtggactcaa agaacgacgg 420

atgaattaaa gaaggagaat gaaatgtggc tgctaccttt acattcagta atggatcggg 480

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ctgaagaaga tgaagaatat gatccgcatg attatacaga ttgtataggt agagaagaag 780

agctcatgag aatggggtcg atatttgaaa cgatattata cctaattcag ataggctatg 840

agaatcaagt gcaaagattg agcgaagaag aagtatgtgt ggtaaagcac agaatggttg 900

gaaaggatcg gcgggatgaa atcatgtgcg ccttagtacc aaacttctac aaaatcctaa 960

agaagggagg aaagatgcta ggaacggaaa aaatcgagga tctattacca atgtatttat 1020

atcaggctct ggttctttca aacgacttaa tctatgagaa tgtgaatagg g 1071

<210> 21

<211> 496

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

aagcggattt attaagtgtg attaagaaag tatgggagta ctgggagaga ttatcaagcg 60

acccagtcgc attagatgac gcgcggcgga tacgcaaaga acttataaag gctcacatct 120

acggatactg tggcatcatt caaactgctg caacatttgt tttaccaatt accagtccaa 180

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atgtcatacg cgcgcaatat cacgatattg ctaactatat tattggcata tgcggggtaa 300

ctttgggaag acaaggtcat atggaagcaa taatgtgtga gaatatacag ggaaggcaac 360

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<210> 22

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

agacaacttc ggaagagggg tatccctact cgaaatacga aggggcagaa gaagatgatg 60

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aagttttttc gattttaaaa tggtatatgc ctgtgagtcg catagaggaa tacatcggaa 660

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ctttaatcat gtcaatctat ccacgagcgg caaatcaaaa tcgatcacat cctttccttt 1020

tatttg 1026

<210> 23

<211> 1036

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

ttgatagttg cccaagggta tgcgatcgcc gacaaacatt catgacccga attccatatt 60

ttgatttaaa tcaagaggaa ggagactcaa tatacaaatg gaacttggag ccaatactac 120

gagacgtaaa aaccactagg atggatggat acccatatga agcatatgat ggtgatgatg 180

aagacgcggg tttagtgcat gacatagacc aacggaaata tcgcgagatg atccaacgta 240

taatcgacaa cgaatggcaa gagaaggatg ggatcgcgac gataatatta gatgtaggtg 300

gtatagagaa atacgatttc acgaaagatg catatataga tgaggcggga tttataaagc 360

tgccagatta ctacggaaaa caaattaggt cgaaattata tgggtatagc tttgaaatta 420

ctagagtgtc gattacagct tcaaaaacag aggatccttg gcaccaaaaa accggaggaa 480

agctaataaa tgagggtgag ttatggagag ttcctttgga taacattatt gatgtaacac 540

aatgtctaag cggaagagcg ataagcgatg ctaaacaaaa gaggagcgta aggtttgatg 600

aattattgga agaagatgaa gatggtgaga atggtgaatg tgtccaaaag tatgtcctag 660

gaaaaataag aaagaaatta tttacccgag ttttctcaat attgaaatgg tatttcccaa 720

cagaatatat tgacagttta attggggagg atgagtacgt atatgacaca gagatgttta 780

atgatatttt caatgaggac gaatttataa acgagcaaca aagtttgagt tctatggttt 840

tatccatgat catcagagca tataaggatg agcaggtgga tgaacttcgg aacagtacga 900

cctatctcta cagaatgaca gaacgtcggg gcaaagaacg agaggcgttc ttgaaaaagt 960

cgatgccgaa gttctacgca aaaattctaa aggttcggga agctgaaaaa gttgaggaca 1020

ttctaccatt catttt 1036

<210> 24

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

aacataagag ataatcaacg gcaaggaaaa ccaaaacgct tagcgaccgt tctaatgata 60

acgatgtgcg acgtattaaa gcgagctata tgggcgaacg ataggtttga gttagtgagg 120

ggaacgtata cttacgcaag atgcagatta ggttcggtgt ataacgctat gtggaaagat 180

atggcctggc aattacgtcc ggcttataaa gattcgtgtc cacgcatctg tgataggcgg 240

aaatatataa tgcaacgcta tgattatttt tctctgaata gggaagtagg agacacgata 300

tataagtggg atgtaaagat tttgcgggag gacgggaaaa cgaatagaga gatgggatgg 360

ctgtataaga ctgaagaaga tgaagctgaa gacgaagaca cgataataca tgattttgat 420

gaagataagt acactgaata tatgcaaagg gtaattcaag gaccatggat agaaaaagat 480

gggatcgaaa ttttaatgaa agaagggact gcgattgaga agtttgactt tgcacaggat 540

gcatacgtcg atgaggcagg gttcctaagg ttacctcctt attacaataa gctaataaaa 600

tcttcacttt atgaatcatc ttttcgaatc agacgaatag atattagaaa gaataaagga 660

acggacccat ggatccagaa gacggaagat gaggtcaaga aagagaatga aatgtggctt 720

ttacctttac gttcaatatt agaccgaact ttatgtttca cagggaatat attaagcacg 780

gcaagacaag aacaaagtgc acgatttacc gcaataatcg acgcattgaa aaaagatgaa 840

gatgttgtaa gaaagaaata ttcccgtaat gataattata cttgtccgac tctcaatgct 900

ctaggttaca caggatatag gcaacggaga tttgtattct ctatcttgaa gaatcattta 960

ccgaaggatg tattaatgga tatgtatcct gaggaagagg cagagtacga ccctcgtgat 1020

tatacggatt gcaacggaag agaacaagta ttaacgagaa tgaattcgat atttgacgtt 1080

atactttatc taattcagat gggcttcgaa agacagatct caacactaag cgaggaagac 1140

atacgtataa ttaaacaaag gatggtagga ggagagagtc ggaatgaggt actacaaact 1200

cttgcgccta atttcctccg aatcataaag gcgggagaga agacggcgga tacgatgaag 1260

aatgaagatt tgttaccgat gtatttttat caagcg 1296

<210> 25

<211> 1081

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

aagaccactg atgaaattcg gaatatacga ggagtgagtg gtgagagagc aggaagtata 60

ttagcggcag tgcttctagt cagtgcatgt gattcgaaaa agagagcgat ttggtatgat 120

gatgatagtc caatttatag aggcgtgatg ctttatgcta tagaaaaatt ggggtgtgtc 180

tactatggtt tacggaaaag attcacctgg tccatacggt caacttacgt tgatggatgc 240

cgtagagtat gtgatagacg acaaacattt atgacccgta taccatattt cgatctcaat 300

caagaggaag gcgatagcat atacaaatgg aatctggtgg ctataggtcg agaagtaaaa 360

acgaacagaa tggatggata tccttatgaa gcttacactg gagatgatga agatcaggtc 420

ttggttcatg atatcgatcc caggaaatat agtacaatga tacaacgtgt tatagatcat 480

ggctggagcg agaaagatgg catatcaacg attatatcag atgtgggtgg gattgagaaa 540

tatgacttta caaaagacgc ttatatagat gaagcgggct ttgttaaact accagattat 600

tatgaaaggt tgattaagtc aaatttatac ggtttcagtt tcagaattac tagagtttca 660

gtaacatcgt caaaaacgaa tgatccctgg cataaaaaaa cctctgatga tttgatcaat 720

gaaacagagc tgtggagagc gccgctggat aatgtcatcg atgttactca atgcttaagt 780

ggagagtcga taagcaacac aaagcagcgg agaagcgcgc gatttaatga actaatacca 840

gaagatgagg aagaaaaata ctgtattcaa aaacatgtgc tgacaaaaat caagaatgag 900

ttattcacgc gcgtatattc gattctgaaa tggtattatc ccgcaaattt gatcgatgaa 960

ttgatcgggg aagacgagta tgaatatcat gcagaggaat acaacgatac gttcggagag 1020

gagaatttga taatgaagtc gcaaacttta agctctttaa ttgtctcaat gatcctgatg 1080

g 1081

<210> 26

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

atgggatgtc aaaaaattta tgtcggataa aaagacgacg agaagagaag gttggatgta 60

taaaacgatt gaggaagaag ttgaggagga agaagcgcta gtccacgact tcgatgaggg 120

caagtataca gaatacatgc aaagagtcat acagggaccc tgggtcgaga aggatggaat 180

tggtattcta atgaaagctg atgctgcaat cgagttattc gacttcacca aagatgcata 240

tgtggatgaa tcaggctttt taagactacc tccttattat aatagatcaa taaaatcggc 300

actgtacgaa gctacattta agatacgacg agttgaaatt actcagagca agagacctga 360

tccgtggact caaagaacga cggatgaatt aaagaaggag aatgaaatgt ggctgctacc 420

cttgcattca gtaatggatc gggcgcactg cctaactggg aagatcctaa gcacaaggaa 480

acaagatcat agtgcgcgct ttgagatgat agtcgaggct ttaaagaaag agaaaaagga 540

agtgagagaa aaatacgtac gtaacgatac gtataaatgt ccaacattga atatccttgg 600

atatacgggg tataggcagc gaagattcgt gttctcgata ctcaaaaatc atcttcccaa 660

agatttccta atggaactgt atcctgaaga agatgaagaa tatgatccgc atgattatac 720

agactgtata ggtagagaag aagagctcat gagaatgggg tcgatatttg aaacgatatt 780

atacctaatc cagataggct atgaaaatca agtgcaaaga ttgagcgaag aagaagtatg 840

tgtggtgaag cacagaatgg ttggaaagga tcggcgggat gaaatcatgt gcaccttagt 900

gccaaacttc tataaaatcc taaagaaggg agcaaagatg ctaggaacgg aaaaaatcga 960

ggatctatta ccaatgtatt tatatcaggc tttggttctt tcaaacgact taatctatga 1020

gaatgtgaat agggctcatc ccatgttaat gctatgtgaa aaacgattga gaatcgtacc 1080

aatccagacg aattcatggc ataaaaaggt gccattgttg tcaactcttt t 1131

Claims (8)

1.一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括检测流行性出血病病毒的血清群和血清型的特异性引物；

所述的检测流行性出血病病毒的血清群特异性引物核苷酸序列如下：

上游引物EHDV-S3-F：5′-ataccaactagrgatcatagagg-3′(SEQ ID NO.1)；

下游引物EHDV-S3-R：5′-cggttctccygttggaccat-3′(SEQ ID NO.2)；

所述的检测流行性出血病病毒血清型的特异性引物包括8对检测不同血清型流行性出血病病毒的引物对，其核苷酸序列如表1所示；

表1

2.根据权利要求1所述的流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒，其特征在于，还包括RT-PCR试剂、各血清型EHDV阳性核酸对照和阴性对照。

3.根据权利要求2所述的流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR试剂包括dNTPs 0.5mmol/L、RNA逆转录酶2～4U/反应、RNase抑制剂2～3U/反应、Taq DNA聚合酶4～8U/反应、Mg²⁺2.0mmol/L、RT-PCR反应缓冲液。

4.根据权利要求2所述的流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒，其特征在于，各血清型阳性核酸对照共8管，分别为EHDV-1型、EHDV-2型、EHDV-4型、EHDV-5型、EHDV-6型、EHDV-7型、EHDV-8型和EHDV-10型病毒提取的标准阳性核酸模板。

5.根据权利要求4所述的流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒，其特征在于，阳性核酸对照中核酸模板浓度见表2；阴性对照为无EHDV感染牛血液提取的RNA；

表2

6.根据权利要求2所述的流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒，其特征在于，用于检测流行性出血病病毒血清群与血清型的RT-PCR反应体系均为：PrimeScript 1StepEnzyme Mix 2μL；2×1Step Buffer 25μL；上游引物20μmol/L 1μL；下游引物20μmol/L 1μL；模版RNA 4μL；RNase fr ee H₂O 17μL，总计50μL；

用于检测流行性出血病病毒血清群与血清型的RT-PCR反应程序均为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸1min。

7.权利要求1中所述的检测流行性出血病病毒的血清群特异性引物。

8.含有权利要求1中所述的检测流行性出血病病毒的血清群特异性引物的试剂盒。