CN103789456A - 一种用于检测鹿流行性出血病病毒的引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鹿流行性出血病病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；还公开了一种包含上述引物对的鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒及其检测方法。本发明一种用于鹿流行性出血病病毒的引物对，在特异引物对的基础上，优化了PCR条件，扩增出了鹿流行性出血病病毒的核苷酸序列，并优化了检测条件和检测体系制备了检测该病毒的试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达6pg，可以快速准确检测鹿流行性出血病病毒。

Description

一种用于检测鹿流行性出血病病毒的引物对及其应用
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种用于检测鹿流行性出血病病毒的引物对及其应用。
背景技术
鹿流行性出血病（epizootic haemorrhagic disease of deer，EHD）是一种季节性、非接触性的病毒性传染病。鹿流行性出血病病毒（EHDV）也是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的成员，是通过节肢动物（主要是库蠓）传播的双股RNA病毒。在自然条件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染。临床特征为体温短暂升高，呈休克症状，粘膜和浆膜出血，于昏迷状态下死亡。病变呈广泛性充血、出血、严重水肿和血管坏死，有时出现腹膜水肿。目前EHD共发现8个血清型，分别是EHDV-1、EHDV-2、EHDV-3、EHDV-4，EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等。EHDV在形态结构上与蓝舌病病毒极为相似，血清学上与蓝舌病有明显交叉，其VP7蛋白是病毒可溶性群特异性抗原，VP7基因也是EHDV群特异性分子检测的靶基因。本病目前尚无有效疫苗和治疗措施，控制和消灭EHD必须花费大量的人力物力，出口贸易也因此受限，给EHDV流行的国家带来很大的经济损失。EHDV的快速检测方法和试剂是动物检疫中急需解决的关键技术问题。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是一种用于鹿流行性出血病病毒的引物对。本发明还要解决的技术问题是提供一种鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒。
技术方案：为实现上述目的，本发明的一种用于检测鹿流行性出血病病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
一种鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒，它包含所述的引物对。
上述的鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒，包括：
1）预混剂A：由核苷酸序列如SEQ ID NO：1的上游引物P120μL，核苷酸序列如SEQ ID NO：2的下游引物P220μL，2×PCR pre-mix200μL，ddH2O100μL组成；
2）阴性对照：非鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μL；
3）阳性对照：鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μL。
上述的鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1）抽提鹿流行性出血病病毒的质粒；
2）PCR扩增：PCR反应体系为50μL体系，反应体系中含PCR pre-mix 12μL，上下游Primer各1μL，上述病毒质粒 2μL，H2O 34μL，瞬时离心混匀；PCR工作程序为：94℃预变性3min；94℃变性30 s，58℃退火1min30 s，72℃延伸1min，15个循环；72℃再延伸10 min。
3） PCR扩增产物分析。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明一种用于鹿流行性出血病病毒的引物对，在特异引物对的基础上，优化了PCR条件，扩增出了鹿流行性出血病病毒的核苷酸序列，并优化了检测条件和检测体系制备了检测该病毒的试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达6pg，可以快速准确检测鹿流行性出血病病毒。
附图说明
图1：PCR方法特异性实验的电泳图；其中，泳道1为DNAmaker，泳道2和3分别为猪和鸡相关病毒的质粒扩增后产物，泳道3为本发明的鹿流行性出血病病毒的DNA扩增产物。
具体实施方式
实施例1：试剂盒的制备。
1、病毒及病料的来源和处理
鹿流行性出血临床病料于2009年10月采自河南鹿内脏器官。取0.6g 内脏组织于无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻溶3次后6000 rmp 离心4min，取上清于-20℃保存。
2、试剂
PCR pre-mix、蛋白酶K购自大连Takara公司；DNA Marker、GoldView购自南京上高生物公司；引物由Sigma公司合成。其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1、 引物的设计与合成
根据GenBank中EHD的全基因序列，使用引物设计软件Primer5.0设计一对检测引物。EHD VP7上游引物P1为: 5'-GGCAGCGCCAGAAGTTACC-3'；
下游引物P2(5’ -CCGCTGCATTCGAAAAA GTC-3')，预期扩增片段大小约为536bp。
2、 阳性对照：即含有鹿流行性出血病病毒的DNA片段
3、 阴性对照：非鹿流行性出血病病毒的DNA片段
实施例2： 检测方法
按照以下步骤进行检测：
（1）样品处理：取鹿流行性出血临床病料于2009年10月采自河南鹿内脏器官。取0.6g内脏组织于无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻溶3次后6000rmp离心4min，取上清于-20℃保存。
（2）病毒DNA的提取：将可疑病料组织悬浮液冻融3次，离心取上清450μL，加入蛋白酶K至终浓度500μg/mL，加入SDS至终浓度10g/L，55℃水浴30min，用苯酚、苯酚-氯仿(体积比1∶1)混合液及氯仿各抽提1次，吸取水相，加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇沉淀，12000r/min4℃离心15min，沉淀悬浮于超纯水中，-20℃保存备用。
（3）PCR扩增：PCR反应体系为50μL体系，反应体系中含PCR pre-mix12μL，上下游Primer各1μL，上述病毒质粒2μL，H2O34μL，瞬时离心混匀；PCR工作程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火1min30s，72℃延伸1min，15个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。
（4）PCR扩增产物分析：结束后取6μL PCR扩增产物加于1%琼脂糖凝胶孔中放于电压为150V的电泳槽里电泳15min，于紫外投射仪中观察结果。
从图1可以看出：鹿流行性出血病病毒扩增出了一条约536bp的片段。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0000472083400000011

Claims (4)

1.一种用于检测鹿流行性出血病病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
2.一种鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒，其特征在于包括：
1）预混剂A：由核苷酸序列如SEQ ID NO：1的上游引物P1 20μL，核苷酸序列如SEQ ID NO：2的下游引物P2 20μL，2×PCR pre-mix 200μL，ddH2O 100μL组成；
2）阴性对照：非鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μL；
3）阳性对照：鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μL。
4.权利要求3所述的鹿流行性出血病病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）抽提鹿流行性出血病病毒的质粒；
2）PCR扩增：PCR反应体系为50μL体系，反应体系中含PCR pre-mix 12μL，上下游Primer各1μL，上述病毒质粒 2μL，H2O 34μL，瞬时离心混匀；PCR工作程序为：94℃预变性3min；94℃变性30 s，58℃退火1min30 s，72℃延伸1min，15个循环；72℃再延伸10 min。
3） PCR扩增产物分析。
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CN110257561A (zh) * 2019-07-23 2019-09-20 深圳海关动植物检验检疫技术中心 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN111500774A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 云南省畜牧兽医科学院 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒

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