CN113215154B - TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用。本发明以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒为检测对象，建立了三重PCR检测方法。通过利用Snapgene、DNAMAN、Primer5等软件，寻找到了一段三者具有较高同源性的片段来设计简并引物，具有重要现实意义和临床应用价值。

Description

TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR 检测的引物组合、试剂盒及其应用。
背景技术
长期以来，养猪业被三座大山困扰：生殖系统疾病、消化系统疾病和呼吸系统疾病，其中消化系统疾病的症状是“死得多”。自2010年中国和2013年美国暴发流行性腹泻病毒以来，特别是猪冠状病毒，给全球养猪业造成了严重经济损失。由于致猪腹泻病毒常常侵害幼猪尤其刚出生仔猪，而对成年猪可以带毒但不易感，导致猪群中常年带毒。
1致猪腹泻的冠状病毒
急性感染性腹泻是全世界仔猪发病率和死亡率高涨的主要原因之一，其中冠状病毒扮演着重要并且主要的角色。2012年，通过宏基因组学分析中国猪腹泻和健康样本发现，77％的腹泻样本中有猪冠状病毒，健康样本中只有7％。迄今为止，全球范围内共发现7种猪冠状病毒，包括猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PorcineRespiratory Coronavirus Virus,PRCV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine epidemicdiarrhea Virus, PDCoV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine Hemagglutinatingencephalomyelitis Virus,PHEV)，以及曾在意大利流行的猪重组冠状病毒(Swineenteric coronavirus,SECoV)和前不久在中国南方爆发的猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndrome,SADS)，除PRCV和PHEV外，其他五种猪冠状病毒均以腹泻为主要症状，以TGEV、PEDV和PDCoV流行最为广泛、最为严重。在这些病毒中，TGEV、PRCV和PHEV已经在猪群中流行了几十年，而PEDV、PDCoV和SADS则被认为是新发突发冠状病毒，尽管PEDV 在20世纪70年代已被发现。
冠状病毒是目前已知包含最大RNA基因组的RNA病毒，由长度为 25～30kb的正链RNA组成，含有9个开放阅读框，编码4个结构蛋白即S蛋白(刺突蛋白)、E蛋白(囊膜蛋白)、M蛋白(膜蛋白)、N蛋白(核衣壳蛋白)，ORF1a和ORF1b经翻译和加工后形成16种非结构蛋白。TGEV 与PEDV均属于甲型冠状病毒，TGEV的发现时间久远，自1946年报道以来，已蔓延至全世界，迄今为止只发现两类毒株：Purdue株和Miller株，不久前在中国安徽发现了Purdue株与Miller株的天然重组毒株AHHF株。TGEV具有消化道趋向性与呼吸道趋向性，其变异毒株PRDC与TGEV高度同源，是猪呼吸道疾病综合征的病因之一。随着不断的变异、重组，人们已经在意大利发现了TGEV与PEDV的重组毒株猪肠道冠状病毒。PEDV于1971年发现，起初发现于欧洲，后传至亚洲，造成了比亚洲更加严重的影响。虽然PEDV 在欧洲和亚洲对养猪业造成了严重的影响，但直到2013年PEDV才在美国出现，并迅速蔓延，此后，PEDV再次在亚洲多地复发，成为在全球范围内最具破坏性的猪冠状病毒。PDCoV首次在2009年发现，该病在2014年于美国暴发，蔓延到美国的数个州，此后，在韩国、中国、泰国也接连发现。
三种猪肠道冠状病毒TGEV、PEDV和PDCoV主要感染小肠绒毛上皮细胞，引起急性坏死和绒毛萎缩。吸收不良的结果是严重的营养不良，此外，腹泻常伴有呕吐，导致更加严重的脱水、厌食和食欲不振，最终可能导致动物死亡。通常来说，PEDV和TGEV被认为比PDCoV更具杀伤力，尽管在接种无菌仔猪后PDCoV会导致一种严重的疾病，但是还需进一步分析，以确定毒株、动物年龄或其他因素是否影响PDCoV的发病机制。PEDV和TGEV引起临床症状的严重程度与动物的年龄成反比。两周以下哺乳仔猪的症状非常严重，死亡率高达95％。育肥猪和妊娠母猪的临床症状相对较轻。症状在疾病发作后5至10天内缓解或自我限制。与年龄较大的动物相比，年龄较小的仔猪更高的易感性与新生仔猪肠上皮细胞更新较慢有关。
2PCR技术
PCR技术由Mullis等人于1985年发明，经过三十余年的发展，该技术所需的设备、试剂已经十分成熟。根据不同的实验目的，PCR技术已经发展出多种类型，如实时荧光定量PCR(real time PCR)、反转录PCR(reverse transcription PCR)、巢式PCR(nested PCR)等三十多种PCR技术。
PCR主要包括三个过程：首先是DNA双链在95℃左右发生热变性，解链为单链；之后降温至一定温度，使引物与模板结合，这个温度与引物的Tm值有关，一般来说，引物合成公司推荐的退火温度是Tm值减5℃，但最佳温度需要摸索；此后是延伸，此阶段的时间长度与目的片段的大小、DNA聚合酶的种类有关。
普通PCR结果的成功与引物特异性、退火温度、引物浓度、延伸时间等因素有关。设计引物时，要尽量避免引物自身形成发卡结构、引物之间非特异性结合、引物与模板非特异结合等情况的出现；退火温度需要适当。随着温度的升高，底物结合的特异性增加，底物结合的难度也增加。在探索PCR 退火温度时，可以使用梯度PCR仪设置温度梯度。当引物浓度过大时，非特异性结合和引物二聚体出现的可能性增大，当引物浓度过小时，则较难扩增出目的片段；延伸时间与DNA酶的种类及活性有关，为了避免因时间过短而延伸不足的问题出现，可适当延长延伸时间。
PCR技术广泛应用于生产实践，具有经济、方便、灵敏的特点，在临床检测的初步筛查中具有明显的优势。
3多重PCR
多重PCR是指同一个PCR系统中有多对引物和模板。通过电泳可以获得不同大小的条带，这是Chamberian等人首先提出的。由于该技术能同时放大多个目标片段，具有节省样品、节省时间、经济方便、提高效率等优点，因此一经提出，就得到了广泛的应用。然而，与普通的单项PCR相比，多重PCR 在技术上更为困难。多重PCR并不是简单地混合几个单一的PCR系统，而是需要全面的分析和不断的探索。该技术的关键点在以下几个方面：
第一是目的片段的选取：多重PCR是以电泳条带的大小为指标来判断结果的，所以各目的片段的大小应有一定的差异，电泳之后应易于用肉眼区分并判断大小。同时，最短的目的片段最好大于100bp，以防与可能出现的引物二聚体混淆。最小和最大片段的大小差异也不应过大，因为当大片段的延伸时间过长时，可能会使其他片段的非特异性增加。
第二是引物的设计：随着引物数量的增加，非特异性结合的概率会增加，因此在设计引物时应考虑以下几点：各引物是否会和各目的片段发生非特异结合、各引物之间是否会发生非特异性结合、各引物的Tm值是否相差过大。
第三是引物体系的确定：这里主要指的是引物浓度的确定，应摸索一个合适的引物浓度，以使电泳时条带清晰、易于区分。
第四是反应条件的确定：这里指的主要是退火温度的确定。在能够获得清晰且容易区分的条带的条件下，应该选择更高的退火温度来提高反应的特异性。
4多重PCR在猪腹泻病毒检测中的应用
由于不同冠状病毒感染引起的临床症状、病理变化和流行病学非常相似，难以区分，并且这些病毒的混合感染非常常见，因此需要实验室检测来诊断和识别它们。
多重PCR由于其快速、经济、准确的特性，在致猪腹泻病毒的诊断鉴别方面扮演着重要的角色。2019年4月，基于华中农大张坤硕士论文的猪传染性胃肠炎-流行性腹泻-A型轮状病毒的三重PCR检测方法的国标已经发布和实施。该方法以PEDV M基因序列、TGEV N基因序列和A型轮状病毒VP7 基因序列为靶序列建立了三重逆转录PCR方法。由于A型轮状病毒在轮状病毒种群中流行最为广泛，影响最为严重，所以该国标以A型轮状病毒的有无判定轮状病毒的有无。然而，除了A型轮状病毒外，C型轮状病毒的影响也相对较大。刘高鹏建立了TGEV、PEDV、PCV2、A型和C型轮状病毒多重 PCR检测方法，并在2013～2014年间从天津、浙江、湖北等地的猪场中检测了172份临床样本，其中5份患病组织样本、22份健康猪血清样品和145份健康猪粪样品。结果表明，C型轮状病毒的检出率高于A型轮状病毒。目前，已经有多重种针对猪病毒性腹泻的多重PCR方法建立起来，检测的对象包括猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪星状病毒、猪德尔塔冠状病毒、二型圆环病毒、猪萨佩罗病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪嵴病毒、猪捷申病毒、猪札幌病毒等，检测的方法包括多重反转录PCR、多重实时荧光定量PCR。
但是目前的检测方法存在如下问题：
①、引物的特异性不高；
②、需要用3对6条引物，引物数量较多。
因此，提供能够同时检测TGEV、PEDV、PDCoV的三重PCR方法，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用。TGEV、PEDV、PDCoV具有较高的同源性，本试验选取了这三者同源性较高的一段序列设计下游引物，并分别设计上游引物。三种冠状病毒的目的片段大小分别是：PEDV为763bp，TGEV为528bp， PDCoV为361bp。本发明采用阳性质粒测定三重PCR系统及各种反应条件，并对该方法的特异性和重复性进行了检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物组合，包括：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1～3中的一个或多个所示的核苷酸序列；和
(2)、共用下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(4)、与(1)、(2)或(3)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的5个或6个。
本发明还提供了所述的引物组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为冠状病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TransmissibleGastroenteritis Virus,TGEV)或猪德尔塔冠状病毒(Porcine epidemic diarrheaVirus,PDCoV)中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒检测的扩增程序为：
Figure BDA0003119227840000051
Figure BDA0003119227840000061
所述病毒检测的反应体系为：
⑧模板
⑨TGEV上游引物(如SEQ ID No.1所示，4μM)：1μL
PEDV上游引物(如SEQ ID No.2所示，4μM)：1μL
PDCoV上游引物(如SEQ ID No.3所示，4μM)：1μL
⑩冠状病毒共用下游引物(如SEQ ID No.4所示，4μM)：3μL
Figure BDA0003119227840000062
5×buffer：5μL
Figure BDA0003119227840000063
dNTP(2.5μM)：2μL
Figure BDA0003119227840000064
酶：0.5μL
Figure BDA0003119227840000065
水：加至25μL。
更重要的是，本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括所述的引物组合以及常用的制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为冠状病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TransmissibleGastroenteritis Virus,TGEV)或猪德尔塔冠状病毒(Porcine epidemic diarrheaVirus,PDCoV)中的一种或多种。
本发明以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒为检测对象，建立了三重PCR检测方法。此前，王睿敏等人对这四种病毒建立了多重PCR检测方法，但本实验的设计思路不同。由于上述三种猪冠状病毒具有较高的同源性，所以思考是否可以利用这三种冠状病毒一段具有较高同源性的片段设计引物，从而减少引物的使用量。通过利用Snapgene、 DNAMAN、Primer5等软件，寻找到了一段三者具有较高同源性的片段来设计简并下游引物，从而突破了传统检测每种病毒都需要2对引物的限制，本检测方法使用4条引物就可以达到检测目的，相对于使用6条引物，成本更低，具有重要的现实意义和临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示PEDV、TGEV、PDCoV阳性质粒PCR鉴定结果；其中，M：DL2000 DNA Marker；1：PEDV PCR鉴定结果；2：TGEV PCR鉴定结果；3：PDCoV PCR鉴定结果；4：阴性对照；
图2示单一PCR引物浓度的摸索；其中，A-C：分别代表PDCoV、PEDV、TGEV在不同引物溶液浓度情况下的扩增结果；M：DL2000DNA Marker 1. 阴性对照；上下游引物溶液浓度分别为,2：2μM；3：4μM；4:6μM；5:8μM； 6:10μM；
图3示三重PCR引物浓度的摸索；其中，M：DL2000DNA Marker 1.阴性对照；各上下游引物溶液浓度分别为2：2μM；3：4μM；4:6μM；5:8μM； 6:10μM；
图4示三重PCR反应体系特异性和重复性检验；其中，A-E：分别代表1～ 5批PCR预混液；M：DL2000DNA Marker 1.阴性对照；模板分别为2:PEDV 阳性质粒；3：TGEV阳性质粒；4：PDCoV阳性质粒；5：PEDV、TGEV和PDCoV 阳性质粒混合物
具体实施方式
本发明公开了TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
材料
1毒株、菌株及质粒
TGEV、PEDV毒株由军事医学研究院军事兽医研究所分子病毒学与免疫学实验室保存。Trans1-T1感受态细胞、pEASY-Blunt Simple购买自北京全式金公司。由捷瑞公司合成了目的基因为361bp大小的猪德尔塔冠状病毒阳性质粒。
2主要试剂
transStart FastPfu Fly DNA聚合酶、5×TransStart FastPfu Fly Buffer、2.5mM dNTPs均购买自北京全式金生物技术有限公司。6×Loading Buffer购买自 Takara公司。DL2000DNA Marker从天根公司购买。总RNA提取盒购买自生工生物工程公司。胶回收试剂盒购买自BioFlux公司。质粒小量提取试剂盒购买自corning。
3主要设备
PCR仪购买自赛默飞世尔；水浴锅购自上海一恒公司；组织研磨仪购买自上海净心公司；离心机购买自Eppendorf。
4主要试剂配制方法
4.1LB液体培养基
取500mL锥形瓶，称取蛋白胨2g，酵母提取物1g，氯化钠10g，用去离子水定容至200mL，121℃灭菌20min。待冷却后，加入200μL抗生素。
4.2LB固体培养基
取500mL锥形瓶，分别称取蛋白胨2g、酵母提取物1g、氯化钠10g、琼脂15g，加去离子水定容至200mL，121℃灭菌20min。冷却至50℃左右后，加入200μL抗生素。根据板的尺寸，将一定量的溶液分别倒入板中，然后让溶液静置，直到凝固。分别包装好封口膜后，倒置，放入4℃冰箱备用。
本发明提供的TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1引物设计
利用PDCoV、TGEV及PEDV的一段同源区域设计共同下游简并引物，使得引物条数减少了两条，预计扩增的的条带大小分别为361bp、528bp及 763bp。
实施例2阳性质粒的构建
本发明共有3种阳性质粒：其中TGEV、PEDV阳性质粒通过PCR方法构建，目的片段长度分别为528bp及763bp；PDCoV阳性质粒(GenBank登录号：KJ601778.1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，目的片段长度为361 bp。
2.1分别以TGEV、PEDV总RNA为模板，进行反转录及PCR扩增，体系及程序如下：
A.反转录：
(1)配置以下体系：
①总RNA：2μg
②dNTP(2.5μM)：4μL
③Random Primer(9mer)：2μL
④加水至10μL
70℃，水浴5min，冰浴2min。
(2)配置以下体系：
①反转录酶：4μL
②RNA酶抑制剂：1μL
③Buffer：4μL
④水：4μL
用上述的方法与(12)产物混合、混匀，42℃水浴1h，75℃水浴15min。
B.获取目的基因:
(1)分别配置TGEV、PEDV目的基因反应体系：
①TGEV或PEDV cDNA：4μL
②TGEV或PEDV 上游引物：1μL
③冠状病毒共用下游引物：1μL
④5×buffer：10μL
⑤dNTP(2.5μM)：4μL
⑥FastPfu Fly DNA聚合酶：1μL
⑦水：29μL
(2)将上述体系通过下面的程序做PCR扩增：
Figure BDA0003119227840000101
①目的片段的回收：
将上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收目的片段。
2.2连接
取干净的PCR管，加入4.5μL回收的目的基因及0.5μL pEASY-Blunt SimpleCloning Vector，25℃水浴10min。
2.3转化
①取50μL Trans1-T1感受态细胞置于冰盒内，刚解冻时加入2.2.3中的连接产物，轻弹混匀，冰浴30min。
②42℃水浴45s，迅速置于冰上2min。
③加入1mL无抗性LB培养基，200rpm，37℃培养1h。
④3000rpm离心1min，保留100μL上清液，混合均匀。
⑤将菌液均匀涂在氨苄抗性平皿上，在37℃恒温培养12h。
2.4挑菌
挑单一、圆润的菌落至含5mL氨苄抗性培养液的试管里，37℃，200rpm 培养12h。
2.5提取质粒
按照试剂盒说明书(corning)进行。
2.6PCR鉴定
通过PCR方法分别对PDCoV、TGEV、PEDV阳性质粒进行鉴定。
2.7测序
把重组质粒送吉林省库美生物科技有限公司进行测序。
实施例3单个PCR引物浓度的确定
本发明中，将各引物溶液浓度配置为10μM、8μM、6μM、4μM、2μM 共5个梯度。配置反应体系时，上游和下游引物均各取1μL。反应体系如下：
①质粒：1μL
②上游引物：1μL
③下游引物：1μL
④5×buffer：5μL
⑤dNTP(2.5μM)：2μL
⑥FastPfu Fly DNA聚合酶：0.5μL
⑦水：14.5μL
反应程序如下：
Figure BDA0003119227840000111
实施例4三重PCR引物浓度的摸索
每种引物溶液设置5个梯度，分别为10μM、8μM、6μM、4μM、2μM。模板为三种冠状病毒质粒，各1μL。反应体系如下：
①质粒：3μL(TGEV质粒+PEDV质粒+PDCoV质粒)
②TGEV上游引物(如SEQ ID No.1所示)：1μL
PEDV上游引物(如SEQ ID No.2所示)：1μL
PDCoV上游引物(如SEQ ID No.3所示)：1μL
③共用下游引物(如SEQ ID No.4所示)：3μL
④5×buffer：5μL
⑤dNTP(2.5μM)：2μL
⑥FastPfu Fly DNA聚合酶：0.5μL
⑦水：8.5μL
反应程序为：
Figure BDA0003119227840000121
实施例5三重PCR反应体系特异性和重复性检验
按照上述确定的反应体系，分别配置五次预混液，进行重复性和特异性检验。
结果例1：重组质粒PCR鉴定
如图1所示：通过PCR方法分别对PEDV、TGEV、PDCoV阳性质粒进行鉴定，分别得到了大小约为763bp、528bp和361bp的条带，与目的条带大小相等。
结果例2：单一PCR引物浓度的摸索
如图2所示：用五种不同的引物浓度分别对各阳性质粒扩增，结果显示，当引物溶液浓度为4μM及以上时，均可得到明亮清晰的条带。
结果例3：三重PCR引物浓度的摸索
如图3所示：当上下游引物浓度为4μM及以上时，均可得到清晰明亮的条带。
综合单一PCR引物溶液浓度的摸索，确定反应体系及程序为：
(1)三重PCR最终反应体系：
①模板
②TGEV上游引物(如SEQ ID No.1所示，4μM)：1μL
PEDV上游引物(如SEQ ID No.2所示，4μM)：1μL
PDCoV上游引物(如SEQ ID No.3所示，4μM)：1μL
③冠状病毒共用下游引物(如SEQ ID No.4所示，4μM)：3μL
④5×buffer：5μL
⑤dNTP(2.5μM)：2μL
⑥酶：0.5μL
⑦水：加至25μL
(2)三重PCR最终反应程序：
Figure BDA0003119227840000131
结果例4：三重PCR反应体系特异性和重复性检验
如图4结果显示，该反应体系的重复性及特异性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州博达锦弘生物科技有限公司
<120> TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgagtacgg tagtgattct gtttat 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgtcaarg actcattgcg tctat 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgcgtctt attatgtgca acat 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagaracytc atchachach acaat 25

Claims (4)

1.引物组合，其特征在于，包括：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1～3所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的引物组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用；
所述病毒为冠状病毒；
所述冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪德尔塔冠状病毒。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病毒检测的扩增程序为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述病毒检测的反应体系为：
①模板
②TGEV上游引物，如SEQ ID No.1所示，4μM：1μL
PEDV上游引物，如SEQ ID No.2所示，4μM：1μL
PDCoV上游引物，如SEQ ID No.3所示，4μM：1μL
③冠状病毒共用下游引物，如SEQ ID No.4所示，4μM：3μL
④5×buffer：5μL
⑤dNTP，2.5μM：2μL
⑥酶：0.5μL
⑦水：加至25μL。
4.病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合以及常用的制剂；
所述病毒为冠状病毒；
所述冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪德尔塔冠状病毒。
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