CN108441579A - 猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT‑PCR引物和探针及试剂盒，所述PCR引物的上下游引物序列依次如SEQ ID NO:1～2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；本发明方法能特异检测PEDV病毒，与TGEV、RV等其他14种常见猪病原、猪基因组核酸以及传代细胞核酸均无交叉反应；检测低限可达0.39copy/μL克隆基因拷贝或2fg/μL病毒核酸，且重复性非常好。对119份猪临床样品的检测试验显示，本发明荧光RT‑PCR方法临床检测高效可靠；采用135份样品进行的方法准确性评估试验结果显示，该法检测真阳性率为100%，真阴性率为100%，说明本发明方法准确可靠，具有较大的应用前景。

Description

猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于动物疾病检测技术领域，更具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为特征。各种日龄的猪均可感染，哺乳仔猪、断奶仔猪的发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最为严重，此病多发生于寒冷季节。20世纪70年代最初发现于英国。随后，许多国家如比利时、德国、加拿大、法国、日本等国也都出现了PED流行的报道，我国从20世纪80年代初开始陆续有本病的流行报道，并且给我国的养猪业带来了巨大的损失。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于I类冠状病毒。PEDV是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA 5'端有帽结构(cap)，3'端有Poly(A)尾，基因组全长为28033bp。基因组5'端非翻译区(5'UTR)位于基因1上游，长296nt；5'UTR内含有长为65nt～98nt的前导序列(L)和1个以AUG为起始密码子并拥有Kozak序列(GUUCaugC)和编码12个氨基酸的开放阅读框(ORF)；基因组3'端非翻译区(3'UTR)长度为334nt，末端连有Poly(A)序列。3'UTR内含有由8个碱基(GGAAGAGC)组成的保守序列起始于poly(A)上游的73nt处。剩余基因组序列包括6个ORF，从5'～3'端依次为编码复制酶多聚蛋白1ab(pp1ab)、纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)的基因。复制酶多聚蛋白基因(基因1)占全基因组2/3，长20346nt，包括ORF1a(12354nt)和ORF1b(8037nt)两个开放阅读框，二者之间有46nt的重叠序列，重叠处有滑动序列(UUUAAAC)和假结结构，它们能使核糖体进行移码阅读，从而保证基因1的正确翻译。S基因、E基因、M基因和N基因分别编码病毒的结构蛋白，长度分别为4152，231，681nt和1326nt。ORF3基因长675nt，编码非结构蛋白，在每两个相邻基因之间有基因间隔序列(IS)，它与基因组和亚基因组mRNA的L序列3'端有7nt～18nt相同，在病毒基因组复制和翻译过程中发挥重要作用。

目前针对PEDV的实验室诊断方法有病原学方法、基于病毒抗原或抗体的免疫学方法和针对病毒RNA核酸检测技术。传统的病原学方法主要通过细胞进行病毒的分离，耗时、耗力。用免疫学检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的过程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，因此抗体检测在作为快速防控的方法时存在一定局限性。荧光定量PCR以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的诸多优点成为分子生物学研究中的重要工具。

申请号为CN201310511288.4、CN201410146551.9、CN201310217682.7、CN201710200348.9、CN201610626179.0和CN201610088587.5的专利均公开了猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物、方法或试剂盒，但均存在着检测灵敏度不高等问题，无法适用于临产复杂多变的检测需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述猪流行性腹泻病毒检测存在的缺陷和不足，针对猪流行性腹泻病毒囊膜糖蛋白基因M基因设计了用于猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测的PCR引物和探针，建立了猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR方法，所述方法特异性高，灵敏度强，重复性好，临床检测高效可靠，具有较大的应用前景。

本发明的目的是提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR引物和探针。

本发明的第二个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法。

本发明的第三个目的是提供一种猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于检测猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR引物和探针，所述PCR引物的上下游引物序列依次如SEQ ID NO:1～2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示，探针5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团。

上游引物序列：5’-AACGCTAACACTCCTTAG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物序列：5’-GAAGCATTGACTGAACGAC-3’(SEQ ID NO:2)；

探针序列：5’-TGTACGCCAGTAGCAACCTTATAGCC-3’(SEQ ID NO:3)；

优选地，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。

本发明还请求保护所述荧光RT-PCR引物和探针在猪流行性腹泻病毒检测中和/或在制备猪流行性腹泻病毒检测试剂盒中的应用。

一种猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法，包括如下步骤：

S1.提取待测样本RNA；

S2.以S1所述RNA为模板，用上述荧光RT-PCR引物和探针进行荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判断：样品检测结果Ct≤35.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光RT-PCR阳性反应；检测结果样品呈现无Ct值或Ct值为40.0、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光RT-PCR阴性反应；对于35＜Ct＜40.0的样品，重新取样进行重复检测；重复检测样品Ct＜40.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光RT-PCR阳性反应，否则判为荧光RT-PCR阴性反应。

优选地，25μL反应的体系为：10mmol/L Tris-HCL(PH8.8)，50mmol/L KCL，3mmol/LMgCL₂，0.2mmol/LdNTP，0.1mg/mLBSA，上、下游引物各0.2μmol/L，探针0.12μmol/L，4％甘油，1U Taq DNA聚合酶，50U M-MLV逆转录酶，5～10μL模板。

优选地，所述荧光RT-PCR反应的条件为：42℃反转录15min，95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火40s，40个循环，60℃设置采集荧光。

一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括上述荧光RT-PCR引物和探针。

优选地，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂，荧光定量PCR所需试剂，DEPC处理水，阳性对照和阴性对照。

优选地，所述试剂盒还包含待测样本RNA提取所需试剂。

优选地，所述阳性对照为含有PEDV M2基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC处理水。

本发明还提供利用所述试剂盒检测猪流行性腹泻病毒的方法，包括以下步骤：

S1.提取待测样本RNA；

S2.以S1所述RNA为模板，用试剂盒中的RT-PCR引物和探针进行荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判断：样品检测结果Ct≤35.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光RT-PCR阳性反应；检测结果样品呈现无Ct值或Ct值为40.0、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光RT-PCR阴性反应；对于35＜Ct＜40.0的样品，重新取样进行重复检测；重复检测样品Ct＜40.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光RT-PCR阳性反应，否则判为荧光RT-PCR阴性反应。

所述25μLPCR反应的体系为：10mmol/LTris-HCL(PH8.8)，50mmol/L KCL，3mmol/LMgCL₂，0.2mmol/L dNTP，0.1mg/mL BSA，上、下游引物各0.2μmol/L，探针0.12μmol/L，4％甘油，1U Taq DNA聚合酶，50U M-MLV逆转录酶，5～10μL模板。

所述荧光RT-PCR反应的条件为：42℃反转录15min，95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火40s，40个循环，60℃设置采集荧光。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的荧光RT-PCR方法能特异检测PEDV病毒，与TGEV、RV等其他14种常见猪病原、猪基因组核酸以及传代细胞核酸均无交叉反应；检测低限可达0.39copy/μL克隆基因拷贝、或2fg/μL病毒核酸；重复性试验显示，其组内变异系数(CV％)为0.41％～3.19％，远低于SN/T3223-2012要求的25％，由2名操作者进行组间重复性试验结果显示，其组间变异系数为1.8％～7.9％，远低于SN/T3223-2012要求的30％，说明方法的重复性非常好。对119份猪临床样品的检测试验显示，该荧光RT-PCR方法临床检测高效可靠；采用135份样品进行的方法准确性评估试验结果显示，该法检测真阳性率为100％，真阴性率为100％，说明方法准确可靠。

附图说明

图1为PEDV荧光RT-PCR特异性试验；1：PEDV-GD毒株，2：PEDV-SZ毒株，3：PEDV-SS毒株。

图2为PEDV荧光RT-PCR方法对纯化病毒核酸的检测灵敏度试验。

图3为PEDV荧光RT-PCR方法对克隆质粒DNA模板的检测灵敏度试验。

图4为不同操作者对5分样品的5次检测试验图谱；A：操作者A对5分样品的5次检测试验图谱，B：操作者B对5分样品的5次检测试验图谱。

图5为部分临床样品的检测结果图谱。、

图6为对比例1与实施例1荧光RT-PCR引物探针的扩增反应曲线图；A为实施例1的荧光RT-PCR引物探针的扩增反应曲线，B为对比例1所述RT-PCR引物探针的扩增反应曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

PEDV分离株PEDV-GD、PEDV-SZ、PEDV-SS样品分别由华南农业大学、深圳出入境检验检疫局、佛山科技学院赠送。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)猪细小病毒(PPV)，猪圆环病毒2型(PCV-2)，猪伪狂犬病毒(PRV)等各种常见猪病毒核酸为广东出入境检验检疫技术中心保存，猪轮状病毒(RV，A群轮状病毒)样品由哈尔滨兽医研究所馈赠。博卡病毒阳性核酸样品(6份)由惠州出入境检验检疫局技术中心提供；大肠杆菌0157菌株购自环凯生物技术公司、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌等细菌性病原核酸样品由汕头出入境检验检疫局技术中心提供；猪增生性肠炎(细胞内劳森氏菌)临产样品(2份)由佛山科技学院馈赠。

临床样品。PEDV攻毒猪样品41份(其中肠内容物14份、粪样27份)，临床发病猪样品23份(含肠内容物9份、粪样14份)，由华南农业大学采集提供；阴性猪样品55份(其中肠内容物15份、粪样40份)，分别由华南农业大学、佛山科技学院采集提供。

实施例1猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR引物探针

1、引物探针设计筛选

在NCBI网站下载PEDV核酸序列，采用DNAMAN 6.0软件进行同源性比对，选取最保守的序列区域进行扩增引物、探针设计。采用ABI Primer Express 3.0专业设计软件，设置引物的Tm值在60℃左右，探针的Tm值在70℃左右，初步选取多对引物、探针组合，采用在线分析软件BLAST确认引物和探针的保守性和特异性；进一步通过特异性、敏感性等检测试验筛选确定特异扩增引物和探针组合。本标准方法选定的扩增引物和探针序列如下：

上游引物序列：5’-AACGCTAACACTCCTTAG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物序列：5’-GAAGCATTGACTGAACGAC-3’(SEQ ID NO:2)；

探针序列：5’-TGTACGCCAGTAGCAACCTTATAGCC-3’(SEQ ID NO:3)；探针5’端标记FAM荧光基团、3’端标记BHQ1基团；扩增产物分子量为150bp，扩增目标基因为PEDV囊膜糖蛋白基因M基因。探针、引物委托英骏生物技术有限公司合成和标记，引物采用PAGE纯化、探针采用HPLC纯化。

3、荧光RT-PCR反应条件

通过比较试验、选取经优化的试剂和反应参数建立荧光RT-PCR反应体系和扩增反应条件。对反应体系中引物和探针浓度、退火反应温度和时间等进行一系列梯度试验，比较不同浓度和反应条件下的检测效果，选取各反应要素在最佳反应效果下的参数建立荧光RT-PCR反应体系和扩增循环反应条件，优化的反应体系如下：

采用25μL反应体系，含以下成分：10mmol/L Tris-HCL(PH8.8)，50mmol/L KCL，3mmol/L MgCL₂，0.2mmol/L dNTP，0.1mg/mL BSA，上、下游引物各0.2μmol/L，探针0.12μmol/L，4％甘油，1U Taq DNA聚合酶，50U M-MLV逆转录酶，5～10μL模板。

扩增反应条件：第一阶段：42℃反转录15min，95℃预变性3min；第二阶段：95℃变性10s，60℃退火40s，40个循环，60℃设置采集荧光。荧光素设定：Report Dye设定为FAM，Quench Dye设定None，Reference Dye设定为None。

结果判定：样品检测结果Ct≤35.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光RT-PCR阳性反应；检测结果样品呈现无Ct值或Ct值为40.0、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光RT-PCR阴性反应；对于35＜Ct＜40.0的样品，重新取样进行重复检测。重复检测样品Ct＜40.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光RT-PCR阳性反应，否则判为荧光RT-PCR阴性反应。

实施例2样品前处理与病毒核酸提取方法及比较

参考国内外文献报道的方法以及商品化病毒核酸提取纯化试剂盒，并进行优化改进，建立粪样、组织等临床样品前处理和病毒核酸提取方法，并通过对已知样品的检测试验来检验样品处理与病毒核酸提取效果。本发明采用荧光RT-PCR方法来检验验证从样品中提取纯化病毒核酸的效果。

(1)样品前处理

将小肠内容物、粪便样品用灭菌PBS按照1:5重量体积比制成悬液，混匀，在4℃采用4000r/min离心10min，去取上清液置于无RNA酶的灭菌离心管中，备用。经上述前处理的待检样品上清液置4℃保存不超过24h，长期保存应置-70℃以下，避免反复冻融。

(2)病毒核酸提取方法

TRIzol核酸提取法：取上述待检样品上清液200μL，置于无RNA酶的灭菌离心管(1.5ml)中，加入600μLTRIzol试剂，颠倒混匀后室温静置15min，短暂离心，加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置5min。4℃12000r/min离心15min。吸取上清至另一洁净1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10min。4℃12000r/min离心10min，倒掉上清，沿管壁缓慢加入75％乙醇1ml,上下颠倒洗涤离心管。4℃12000r/min离心10min，倾斜管壁弃掉上清，将离心管倒扣在吸水纸上自然晾干。加入50μL无核酸酶水(或DEPC处理水)，室温静置5min，短暂离心以收集管壁液滴。贮存于低温备用(-20℃以下)。

可采用商品化病毒核酸提取试剂盒，取上述经样品前处理后得到的待检样品上清液，按试剂盒操作程序进行。本发明在研究过程中采用了TIANamp(天根)病毒DNA/RNA纯化试剂盒(Cat.#DP315)。

(3)结果

本发明随机选取已知阳性猪的肠内容物样品、已知阳性猪粪便样品和PEDV细胞培养病毒液样品各3份，采用TRIzol病毒核酸提取法、TIANamp试剂盒方法，分别从每份样品中取样进行病毒核酸提取，共获得9份核酸样品，采用PEDV特异荧光RT-PCR方法进行检测，比较对不同的核酸提取方法获得样品所测得的CT值，结果显示，两种提取方法所获得样品的检测CT值偏差(CV％)小于4.1％，说明两种方法均能高效提取病毒核酸，其提取纯化病毒核酸效果无明显差异。详见表1。

表1 样品核酸提取方法及荧光RT-PCR检测比较结果

实施例3克隆质粒制备与基因拷贝数换算

通过常规RT-PCR扩增特异PEDV核酸片段，按常规基因克隆操作把扩增产物克隆到pMD19-T质粒载体，并转化感受态宿主菌E.coliDH5α。将转化后的大肠杆菌进行增菌培养。提取并纯化质粒DNA，采用常规PCR对重组质粒进行初步检测鉴定，选择经PCR检查鉴定为阳性的重组质粒，委托上海英骏生物技术有限公司进行测序验证。采用质粒提取试剂盒纯化阳性克隆质粒DNA，用微量核酸分光光度计测纯化质粒DNA样品的OD₂₆₀吸光度值并转换成核酸浓度值。根据公式：质粒拷贝数/μL＝﹛总含量(ug/μL)﹜/﹛质粒分子碱基数×10^-15ug﹜，将纯化质粒DNA按浓度换算成单位体积对应基因拷贝数。

实施例4猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR特异性检测

采用荧光RT-PCR方法，对PEDV的3株分离株PEDV-GD、PEDV-SZ、PEDV-SS样品，以及TGEV、RV、博卡病毒、大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、细胞内劳森氏菌等能引起猪腹泻症状的9种相关病毒性或细菌性病原核酸样品，以及PRRSV、CSFV、PPV、PCV-2、PRV等各种常见猪病原样品、猪全基因组核酸样品、Vero传代细胞核酸样品等进行检测试验。结果显示，仅3株PEDV分离株样品呈典型阳性反应，其它14种各种相关猪病原核酸以及猪基因组核酸、传代细胞核酸等均呈典型阴性反应，说明该荧光RT-PCR方法能特异检测PEDV，与TGEV、RV等其它各种常见猪病原无交叉反应。如图1所示。

实施例5猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR敏感性检测

1、对PEDV病毒基因组核酸的检测敏感性试验：取纯化PEDV细胞毒核酸，测得浓度为20ng/μL，进行10倍倍比系列稀释，取各种稀释度病毒核酸样品进行荧光RT-PCR检测，结果显示荧光RT-PCR的检测低限达10^-7稀释度，对应检测灵敏度为2fg/μL或每个反应20fg纯化病毒核酸，检测图谱见图2。

2、对克隆质粒DNA模板的检测敏感性试验：提取纯化含扩增区域的克隆质粒DNA样品，测定浓度为216.3ng/μL，换算基因拷贝数为3.9×10¹⁰/μL，用无核酸酶水进行10倍系列稀释，采用PEDV特异荧光RT-PCR方法，对各种稀释度克隆质粒DNA样品分别进行检测试验。记录检测终点稀释度并换算对应的基因拷贝数。检测结果显示，荧光RT-PCR对克隆质粒的检测低限可达10^-11稀释度，对应检测灵敏度为0.39copy/μL、即每个反应3.9copies质粒样本，对应终点模板用量约达每个反应0.02fg质粒DNA，检测图谱见图3。

实施例6猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR重复性试验

参考OIE关于核酸检测方法的验证指南(OIE Validation Guideilne3.6.3)和SN/T 3223-2012推荐的方法，对本标准建立的荧光RT-PCR方法进行组内重复性试验和组间重复性试验。

1、组内重复性检测试验

重复性试验核酸样品准备。取5份已知阳性样品：病毒分离株PEDV-GD、PEDV-SZ、PEDV-SS的细胞增殖病毒液各1份、粪样1份、肠内容物1份：分别从每份样品中取样3次、进行3次独立的核酸提取；共获得15份核酸样品。

分别采用荧光RT-PCR方法对上述5份已知阳性样品对应的15份核酸样品同时进行检测，记录每份样品对应的3份独立提取核酸样品的检测CT值及其CT值偏差；详见表2。

表2 PEDV特异荧光RT-PCR方法组内重复性试验

如表2所示，PEDVA荧光PT-PCR方法对5份样品的组内重复性检测偏差(CV％)为0.41％～3.19％，远远小于25％，完全满足OIE指南和SN/T 3223-201的要求，说明本方法的组内重复性好。

2、组间重复性试验

取5份已知阳性样品：细胞增值病毒液样品3份、肠内容物样品1份、粪便样品1份，分别提取病毒核酸，分别分装成小分量，置于-20℃以下冻存；由2名操作者，各自在5个工作日、分别对上述5份核酸样品进行PEDV特异荧光RT-PCR检测试验(即每位操作者共进行25次试验)，每个工作日进行一次检测，每次取出上述核酸样品的分装样进行，避免核酸样品反复冻融。记录每份样品每次检测的CT值，计算每位操作者对5份样品进行5次检测的CT值偏差(CV％)。详见表3，扩增图谱见图4(A，B)。

表3 PEDV荧光PT-PCR组间重复性试验结果

如表3所示，由操作者A对5份样品进行5次测试，其5份样品的检测值CT值偏差为1.9％～5.6％；操作者B对5份样品的检测值CT值偏差为1.8％～7.9％；两位操作者对5份样品的检测值偏差均远远小于30％，满足OIE指南和SN/T 3223-2012的要求，说明本方法的组间重复性好。

实施例7猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR临床检测试验

采集PEDV攻毒猪样品41份(其中肠内容物14份、粪样37份)、临床发病猪样品23份(含肠内容物9份、粪样14份)和阴性猪样品55份(其中肠内容物15份、粪样40份)，采用PEDV特异荧光RT-PCR方法进行检测。检测结果，41份攻毒猪样品中仅1份编号为F3的肠内容物样品呈检测阴性(注：对该样品采用其他方法检测的结果也是阴性)，其余样品均呈检测阳性，检测CT值为18.43～29.57；23份临床发病猪样品均呈检测阳性，检测CT值为19.97～30.76；55份阴性猪样品均呈典型阴性反应。图5显示对部分临床样品的检测结果图谱。

实施例8猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR方法准确性评估

参照SN/T3223-2012，根据上述对临床样品和特异性试验中对各种病原样品的检测结果，统计计算检测方法的真阳性率和真阴性率，对该荧光RT-PCR方法的检测准确性进行评估。

(1)已知阳性样品：以PEDV分离株病毒液样品(3份)PEDV攻毒猪样品40份(剔除F3)、临床发病猪样品23份，共计66份。

(2)已知阴性样品：临床采集的55份阴性猪样品、特异性试验中检测的TGEV、RV等共14份已知阴性病原核酸样品，共计69份。

对上述66份已知阳性样品、69份已知阴性样品的检测结果如表4；

表4 方法准确性评估样品检测结果

根据表4，该法真阳性率＝TP/(TP+FN)＝66/66＝100％；真阴性率＝TN/(TN+FP)＝69/69＝100％(注：若已知阳性样品中保留F3，则真阳性率为98.5％(66/67))。

本发明通过开展严格的试验研究制定猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR检测方法主要技术内容。主要试验研究包括：临床样品前处理及核酸提取方法的建立、荧光RT-PCR方法的建立、特异性试验、敏感性试验、重复性试验、临床样品检测试验以及方法准确性评估，并参考OIE和SN标准关于核酸检测方法的验证指南，通过严谨的试验工作对所建立方法进行充分测试验证。

根据试验研究结果，本发明的荧光RT-PCR方法能特异检测PEDV病毒，与TGEV、RV等其他14种常见猪病原、猪基因组核酸以及传代细胞核酸均无交叉反应；检测低限可达0.39copy/μL克隆基因拷贝、或2fg/μL病毒核酸；重复性试验显示，其组内变异系数(CV％)为0.41％～3.19％，远低于SN/T3223-2012要求的25％，由2名操作者进行组间重复性试验结果显示，其组间变异系数为1.8％～7.9％，远低于SN/T3223-2012要求的30％，说明方法的重复性非常好。对119份猪临床样品的检测试验显示，该荧光RT-PCR方法临床检测高效可靠；采用135份样品进行的方法准确性评估试验结果显示，该法检测真阳性率为100％，真阴性率为100％，说明方法准确可靠。

对比例1

1、猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR引物探针

上游引物序列：5’-CTCCTTAGTGGTACATTGCTTG-3’；

下游引物序列：与实施例1相同；

探针序列：与实施例1相同。

2、按照实施例1中的荧光RT-PCR反应条件进行荧光RT-PCR扩增反应，其结果如图6所示，A为实施例1所述RT-PCR引物探针的扩增反应曲线，B对本对比例1所述RT-PCR引物探针的扩增反应曲线，无法满足检测需求。

对比例2

1、猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR引物探针与实施例1相同

2、按照实施例1中的荧光RT-PCR反应条件进行荧光RT-PCR扩增反应，，唯一不同的反应体系中是上、下游引物与探针均为0.2μmol/L；结果显示，出现非特异性扩增，无法满足检测需求。

序列表

<110> 广州市瑞品生物技术有限公司

<120> 猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒

<130> 1714833ZBSH042

<141> 2017-12-15

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)

<400> 1

aacgctaaca ctccttag 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)

<400> 2

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<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)

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Claims (9)

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述PCR引物的上下游引物序列依次如SEQ ID NO:1～2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示，探针5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。

3.权利要求1或2所述荧光RT-PCR引物和探针在猪流行性腹泻病毒检测中和/或在制备猪流行性腹泻病毒检测试剂盒中的应用。

4.一种猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样本RNA；

S2.以S1所述RNA为模板，用权利要求1所述荧光RT-PCR引物和探针进行荧光定量PCR扩增反应；

S3.结果判断：样品检测结果Ct≤35.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光RT-PCR阳性反应；检测结果样品呈现无Ct值或Ct值为40.0、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光RT-PCR阴性反应；对于35＜Ct＜40.0的样品，重新取样进行重复检测；重复检测样品Ct＜40.0且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光RT-PCR阳性反应，否则判为荧光RT-PCR阴性反应。

5. 根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，25µLPCR反应的体系为：10mmol/L Tris-HCL（PH8.8），50mmol/L KCL，3mmol/L MgCL₂，0.2mmol/L dNTP，0.1mg/mL BSA，上、下游引物各0.2µmol/L，探针0.12 µmol/L，4%甘油，1U Taq DNA聚合酶，50U M-MLV逆转录酶，5～10µL模板。

6.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述荧光RT-PCR反应的条件为：42℃反转录15min，95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火40s，40个循环，60℃设置采集荧光。

7.一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光RT-PCR引物和探针。

8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂，荧光定量PCR所需试剂，DEPC处理水，阳性对照和阴性对照。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有PEDVM2基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC处理水。