CN111172319A - 一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用，具体而言，该引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物，和序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。该引物对能用于制作阳性对照品，降低检测成本，且检测灵敏度高，特异性好，对样品实现快速、精确且有效地检测。

Description

一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用。

背景技术

目前，猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)由猪流行性腹泻病毒引起的一种接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水。临床变化和症状与猪传染性胃肠极为相似。可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高，哺乳仔猪发病率可达100％，1周以内出生仔猪死亡率高达80％～100％。

因此，如何研发一种能够快速诊断猪流行性腹泻病毒引起的腹泻的方法，对减少PED造成的损失意义重大。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用。该引物对为有效快速检测猪流行性腹泻病毒引起的腹泻提供了一种新的解决途径。

第一方面，本发明实施例提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对，该引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物，和序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。

该引物对能够用于制作阳性对照，制作成本低，且制作出的阳性对照品的稳定性高，易于保存；且能对样本进行精准有效的检测，检测灵敏度高，特异性好。

第二方面，本发明提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂，其包括有上述的检测猪流行性腹泻病毒的试剂。

第三方面，本发明提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其包括有上述的检测猪流行性腹泻病毒的引物对。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括以下任一试剂：Taq DNA聚合酶、逆转录酶和RT-PCR缓冲液。

第四方面，本发明提供了前述实施方式提供的引物对在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。

在一些实施方式中，所述应用不以疾病的诊断为目的。

在一些实施方式中，所述检测猪流行性腹泻病毒包括：将所述引物和待测样本混合，进行PCR扩增反应。

需要说明的是，这里的“PCR扩增反应”是广义的PCR扩增，当样本为RNA病毒时，该应用进行的是RT-PCR扩增，当样本为cDNA时，该应用进行的是PCR或qPCR扩增反应。

在一些实施方式中，所述上游引物与所述下游引物的浓度比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。

在一些实施方式中，上述实施方式所述的PCR体系中包括以下试剂：Taq DNA聚合酶、逆转录酶和RT-PCR缓冲液。

在一些实施方式中，上述实施方式所述的PCR体系为：无菌无核酸酶水7.0μl，RT-PCR反应液12.5μl，酶混合液1.0μl，荧光探针2.5μl。

具体地，酶混合液中包括Taq DNA聚合酶和逆转录酶。RT-PCR反应液中包含有dNTPs和Mg²⁺。

第五方面，本发明提供了如上述实施方式所述的引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒的阳性对照品中的应用。

第六方面，本发明提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的阳性对照品，其由上述的引物对通过PCR反应制备。

在一些实施方式中，阳性对照品的制备包括以下步骤：

采用上述引物对通过RT-PCR的方式扩增测猪流行性腹泻病毒，将扩增产物与克隆载体连接，转化感受态细胞，扩增培养后，随后提取含有猪流行性腹泻病毒的质粒。

在一些实施方式中，将扩增产物与克隆载体连接包括：将扩增产物和克隆载体以体积比为10：(1～2)的比例混合，冰浴20～40min后，40～45℃热休克90s，再冰浴1～5min后，加入培养基，在35～40℃，240～260r/min震荡培养50～70min。

在一些实施方式中，提取含有猪流行性腹泻病毒的质粒包括：将震荡后的培养产物均匀涂布于含40～60μg/mL氨苄的LB固体平板上，37℃培养10～14h。从上述转化培养的平板中挑取白色单菌落，接种于15mL含氨苄的LB液体培养基，37℃，240～260r/min震荡培养过夜(不要超过16h)，离心去上清，收集菌体，提取质粒，提取步骤参照试剂盒。

在一些实施方式中，上述克隆载体优选为Peasy-T1载体；感受态细胞优选为Trans1-T1感受态细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明实施例公开了一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用，该引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和序列如SEQ ID No.2所示的下游引物，该引物对能用于制作阳性对照品，降低检测成本，且检测灵敏度高，特异性好，对样品实现快速、精确且有效地检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明试验例1中检测猪流行性腹泻病毒的引物对的扩增图；

图2为本发明试验例2中的标准品制作的标准曲线；

图3为本发明试验例2中的引物对的灵敏度测试结果；

图4为本发明试验例2中猪流行性腹泻阳性对照及验证样品的扩增图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对，该引物对包括序列如SEQID No.1所示的上游引物，和序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。

其中，上游引物序列为：

5’-GCTATAAGGTTGCTACTGGC-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物的序列为：

5’-GAACTCGGATTACTCACAGC-3’(SEQ ID No.2)。

实施例2

试验试剂及仪器

试剂：

Peasy-T1 Cloning Kit购于北京全式金生物技术有限公司；

康为金牌超量无内毒素质粒中提试剂盒购于康为；

胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司；

引物由上海生工生物工程有限公司合成；

天根2×Taq PCR Mastermix；

Abcam反转录试剂盒；

RNA病毒提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。

仪器：德国艾本德可调移液器(2.5μL、20μL、200μL、1000μL)，美国赛默飞ABIVeriti PCR仪。

1.1猪流行性腹泻病毒模版cDNA的制备

RNA提取步骤参照RNA病毒提取试剂盒说明书，反转录体系根据Abcam反转录试剂盒配制：

RNA模版 6μl

ACCURT ReactionMix 2μl

混匀后室温放置5min；然后加入下列试剂：

ACCURT Reaction Stooper 2μl

5XAll-In-One RT MasterMix 4μl

无核酸酶水 6μl

配置好的体系瞬时离心混匀，于PCR仪上进行反转录，反转录的条件为：25℃，10min；42℃，50min；85℃，5min；4℃，反应结束。

2.阳性对照品的制备

采用实施例1提供的检测猪流行性腹泻病毒的引物对扩增猪流行性腹泻病毒，具体包括以下步骤。

通过普通PCR扩增猪流行性腹泻病毒(步骤1得到的cDNA)50μL，利用胶回收试剂盒，对扩增产物进行胶回收纯化。

然后将纯化后的与Peasy-T1载体连接，然后从-80℃取50μL Trans1-T1感受态细胞，加入5μL连接产物，冰浴30min，42热休克90s，冰浴2min，加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃250r/min震荡培养1h。

之后用移液枪吸取30μL震荡培养的产物，并均匀涂布于含50μg/mL氨苄的LB固体平板上，37℃培养12h。

从上述转化培养的LB固体平板中挑取白色单菌落，接种于15mL含氨苄的LB液体培养基，37℃250r/min震荡培养过夜(不要超过16h)，离心去上清，收集菌体，提取质粒，提取步骤参照试剂盒。

重组质粒荧光定量PCR鉴定，并将鉴定阳性的质粒送往测序公司进行测序。测序回来的通过基因序列比对，为猪流行性病毒基因序列。

试验例1

验证实施例1提供的引物对的特异性。

采用人工合成序列的方式得到实施例1提供的引物对序列，采用该引物对对猪流行性腹泻病毒的阴性样品和阳性样品进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系如下：

2×RT-PCR Mix 10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，RNA样品模版2μL，TRUEscript Enzyme Mix 0.8μL以及RNase free H₂O(无核酸酶水)5.6μL；

RT-PCR扩增程序：42℃、30min，94℃、3min；循环94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s，共35次；再72℃延伸7min。

扩增结果如图1，阴性无扩增，阳性有对应扩增，说明该引物特异性强，可以应用于猪流行性腹泻病毒的PCR的扩增和检测。

试验例2

灵敏性实验

拷贝数的计算

利用世纪元亨猪流行性腹泻试剂盒里的阳性样品制作标准品，根据该标准品制作的标准曲线请参照图2，从实验室已经确诊的阳性样品及其不同稀释倍数的阳性样品利用世纪元亨的试剂盒进行扩增，根据扩增结果的CT值计算该阳性样品的拷贝值。

附图2中，Slope(斜率)＝-3.508；Y-Inter＝43.553；Eff％：92.766；Error：0.039。

根据标准曲线公式：Ct＝Slope X+Y-Inter进行计算拷贝数，计算结果如表1。

表1不同稀释倍数的拷贝数

样品编号	CT值	拷贝数
			10<sup>0</sup>	19.011	10<sup>6.996</sup>
10<sup>-1</sup>	22.378	10<sup>6.036</sup>
			10<sup>-2</sup>	25.669	10<sup>5.098</sup>
10<sup>-3</sup>	28.990	10<sup>4.151</sup>
			10<sup>-4</sup>	31.798	10<sup>3.351</sup>
10<sup>-5</sup>	35.790	10<sup>2.213</sup>
			10<sup>-6</sup>	38.221	10<sup>1.520</sup>

利用表1确定扩增CT值的样品为样本模版，对其依次作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5以及10^-6倍梯度稀释之后，利用本发明实施例1提供的引物对其进行RT-PCR扩增，得到阳性结果的最低稀释度的拷贝数即为该引物的敏感度，实验结果如图3。

由图3可知，PCR最低检测限为10^2.213copies/μL，该拷贝数即为实施例1提供的引物对的检测灵敏度。

试验例3

采用实施例1的引物对和实施例2制备的阳性对照品对实验室检测阳性的10份仔猪消化组织和10份粪便进行检测，检测结果请参照附图4。

试验步骤：

消化组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置取样，用手术剪剪碎混匀后，于研磨器中研磨，研磨后称取0.05g于1.5mL灭菌离心管中，加入1mL无RNA酶水，震荡混匀，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

粪便样品处理：取约0.05g排泄物于1.5mL灭菌离心管中，加入1mL无RNA酶水涡旋振荡，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

病毒RNA提取步骤：

(1)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min；

(2)将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s。

(3)弃去收集管中液体，加入600μL洗液，13000rpm离心30s，重复该步骤；

(4)弃去收集管中液体，13000rpm空柱离心2min，以除去残留的洗涤液；

(5)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入洗脱液50μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，离心管中液体即为模板RNA。

(6)配制反应体系并进行RT-PCR扩增(同试验例1)。

实验结果

请参照附图4，普通PCR的阳性对照、5份病料和5份粪便全部都有扩增出现目的片段，说明本发明实施例1提供的引物对及其制作的阳性对照稳定性高，应用方便。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建傲农生物科技集团股份有限公司

<120> 一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对及其试剂盒和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctataaggt tgctactggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaactcggat tactcacagc 20

Claims (10)

1.一种检测猪流行性腹泻病毒的引物对，其特征在于，所述引物对包括序列如SEQ IDNo.1所示的上游引物和序列如SEQ ID No.2所示的下游引物。

2.一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂，其特征在于，其包括有权利要求1所述的检测猪流行性腹泻病毒的引物对。

3.一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，其包括有权利要求2所述的检测猪流行性腹泻病毒的试剂。

4.根据权利要求3所述的检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下任一试剂：Taq DNA聚合酶、RT-PCR缓冲液和逆转录酶。

5.如权利要求1所述的引物对在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。

6.根据权利要求5所述的引物对在检测猪流行性腹泻病毒中的应用，其特征在于，所述应用不以疾病的诊断为目的。

7.根据权利要求5所述的引物对在检测猪流行性腹泻病毒中的应用，其特征在于，所述检测猪流行性腹泻病毒包括：将所述引物和待测样本混合，进行PCR扩增反应。

8.根据权利要求7所述的引物对在检测猪流行性腹泻病毒中的应用，其特征在于，在所述PCR扩增反应中，所述引物对的上游引物与下游引物的浓度比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。

9.如权利要求1所述的引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒的阳性对照品中的应用。

10.一种检测猪流行性腹泻病毒的阳性对照品，其特征在于，其由如权利要求1所述的引物对制备得到。

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