CN113584230A - 一种用于检测猪圆环病毒不同基因型的试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型的引物及试剂盒，属于病毒检测技术以及生物技术领域。本发明提供了一组检测猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型的多重引物，所述引物为共用上游引物以及不同基因型的下游引物，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。本发明所述的引物能够快速鉴别PCV相关病毒的感染，可通过一个反应鉴别PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，具有重要的临床使用价值以及降低检测成本。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒不同基因型的试剂及检测方法，即一种用于检测猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型以及猪圆环病毒4型的多重PCR引物、检测方法及试剂盒。
背景技术
作为对全球养猪业具有重大影响的猪病，猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的病原体是猪圆环病毒(PCV)。猪圆环病毒(PCV)是一种基因组为环状、单链的DNA病毒，根据基因组特征，目前已发现PCV1、PCV2、PCV3和PCV4四种基因型。其中PCV1可在猪群中检出，但不致病；PCV2是引起猪断奶后衰竭综合症的主要病原；PCV3是一种与母猪皮炎综合征和繁殖障碍相关的病毒；最新报道的基因型PCV4可能与呼吸道症状、肠道症状以及猪皮炎与肾病综合征相关。
目前市面上的疫苗仅有针对猪圆环病毒2型防控的疫苗，目前PCV3和PCV4病毒没有针对的预防性疫苗，在生产实际中，存在病毒引发疾病的病例，通过病原检测可以进行一定的防控管理。所以目前PCV1、PCV2、PCV3、PCV4的鉴别诊断具有重要的临床意义，因此，利用新型病原学检测技术，建立快速鉴别检测方法用于PCV病原快速鉴定是有效、精准防控疫情的技术关键。但目前，尚未有同时检测PCV1、PCV2、PCV3和PCV4的PCR鉴别的方法报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测猪圆环病毒不同基因型的试剂及检测方法，即一种用于检测猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型以及猪圆环病毒4型的多重PCR引物、检测方法及试剂盒；从而快速灵敏准确的检测不同基因型的猪圆环病毒，为临床确诊PCV1、PCV2、PCV3和PCV4感染提供有力的技术手段。
本发明首先提供了一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物组，所述的不同基因型猪圆环病毒包括猪圆环病毒1型PCV1、猪圆环病毒2型PCV2、猪圆环病毒3型PCV3和猪圆环病毒4型PCV4；所述的引物组包含有：
上游通用引物，其序列信息如下：
5′-TGGTGGGATGGHTAYVATGG-3″(SEQ ID NO:1)；
用于检测PCV1的下游引物PCV1-R，其序列信息如下：
5′-AATACCCACACCAATGTC-3′(SEQ ID NO:2)；
用于检测PCV2的下游引物PCV2-R，其序列信息如下：
5′-AGGACTACAATATCCGTATAA-3′(SEQ ID NO:3)；
用于检测PCV3的下游引物PCV3-R，其序列信息如下：
5′-ACTTTCCACGAATATTCTCCG-3′(SEQ ID NO:4)；
用于检测PCV4的下游引物PCV4-R，其序列信息如下：
5′-AAAAGGACCGGGAACGATC-3′(SEQ ID NO:5)。
本发明还提供了基于上述引物组制备的检测不同基因型猪圆环病毒的试剂盒；
所述试剂盒还包含有10×Taq Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品PCV1/PCV2/PCV3/PCV4阳性质粒混合物、阴性质控品为RNase-free H2O。
本发明还提供一种不同基因型猪圆环病毒PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：
1)DNA提取：待检样品、阳性质控品、阴性质控品按病毒DNA提取试剂盒说明进行提取DNA。
2)PCR扩增反应：待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品PCR扩增反应：
10×Taq Buffer 2.5μl、dNTP 2μl、MgCl2 1.5μl、Taq酶0.2μl，上游共用引物、PCV1下游引物、PCV2下游引物、PCV3下游引物和PCV4下游引物各1μl，DNA模板2μl，加入RNase-free H2O至25μl，混合均匀。PCR扩增反应的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸7min；
3)电泳检测
通过经1％琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品的PCR扩增产物，阳性对照PCR扩增产物和阴性对照PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断；判断标准为：阴性对照样品PCR扩增产物不出条带，阳性对照样品PCR扩增出产物出515bp、455bp、210bp和555bp。待检样品出现单一大小条带，即为单一感染；若出现多符合大小的条带，即为混合感染；待检样品PCR扩增产物无条带，即为阴性。
所述待检样品为组织病料样品、血清样品或全血样品。
进一步优选的组织病料样品为腹股沟淋巴结、肺门淋巴结、肺脏、肝脏或脾脏。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明提供的猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒采用多重PCR扩增，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决四种不同基因型猪圆环病毒引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场和实验室快速检测，亦适用于流行病学调查。
2)本发明的猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒能检测的极限为10拷贝/μl，表明本发明的猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒在检测具有很高的灵敏度，既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。
3)本发明提供的猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒具有很高的稳定性。试验证明本发明所得的猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒实用性和适用性良好。
附图说明
图1为本发明猪圆环病毒检测引物设计中共用上游引物基因片段的序列比对图；
图2为本发明猪圆环病毒不同基因型检测下游引物的基因片段序列比对图；
图3为本发明猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法特异性试验电泳图，其中M表示2000DNAMarker；1表示PCV1；2表示PCV2；3表示PCV3；4表示PCV4；5表示PCV4和PRV混合；6表示PRV；7表示PPV；5表示CSFV；9表示PRRSV。
图4为本发明猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法灵敏度试验电泳图，其中M表示2000DNA Marker；1表示60μg/μl；2表示50μg/μl；3表示40μg/μl；4表示30μg/μl；5表示20μg/μl；6表示10μg/μl；7表示1μg/μl。
图5为PCV2组织样品和全血以及血清样品PCR检测试验电泳图，其中M表示2000DNAMarker；1表示组织样；2表示血清；3表示全血；
图6为PCV3组织样品和全血以及血清样品PCR检测试验电泳图，其中M表示2000DNAMarker；1表示组织样；2表示血清；3表示全血。
图7为PCV4组织样品PCR检测试验电泳图，其中M表示2000DNA Marker；1表示组织样。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，对本发明提供的技术方案进一步详细说明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：猪圆环病毒多重PCR方法特异性引物筛选及体系优化
1)根据PCV1、PCV2、PCV3和PCV4的全基因序列分别设计对应的特异性引物(表1)。选择PCV病毒共同基因区域为保守基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后设计的通用检测上游引物(图1)，并分别设计了不同基因型的下游引物(图2)。
表1：针对PCV1、PCV2、PCV3和PCV4的特异性引物表
| 病毒 | 引物序列(5’-3’) | 产物大小 |
| 通用上游引物 | TGGTGGGATGGHTAYVATGG | |
| PCV1下游引物 | AATACCCACACCAATGTC | 515bp |
| PCV2下游引物 | AGGACTACAATATCCGTATAA | 455bp |
| PCV3下游引物 | ACTTTCCACGAATATTCTCCG | 210bp |
| PCV4下游引物 | AAAAGGACCGGGAACGATC | 555bp |
实施例2：猪圆环病毒多重PCR方法特异性试验
多重PCR步骤如下：
步骤1，DNA提取待检样品、阳性质控品、阴性质控品按病毒DNA提取试剂盒说明进行提取DNA。
步骤2，PCR扩增反应：待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品PCR扩增反应：
10×Taq Buffer 2.5μl、dNTP 2μl、MgCl2 1.5μl、Taq酶0.2μl，上游共用引物、PCV1下游引物、PCV2下游引物、PCV3下游引物和PCV4下游引物各1μl，DNA模板2μl，加入RNase-free H2O至25μl，混合均匀。PCR扩增反应的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸7min。
步骤3电泳检测
通过经1％琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品的PCR扩增产物，阳性对照PCR扩增产物和阴性对照PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断；判断标准为：阴性对照样品PCR扩增产物不出条带，阳性对照样品PCR扩增出产物出515bp、455bp、210bp和555bp。待检样品出现单一大小条带，即为单一感染；若出现多符合大小的条带，即为混合感染；待检样品PCR扩增产物无条带，即为阴性。
实验表明，上述引物特异性强，能分别扩增出PCV1、PCV2、PCV3和PCV4特异性片段。而其他病毒猪伪狂犬病毒，猪瘟病毒，猪细小病毒，猪繁殖与呼吸综合障碍症病毒都无目的片段扩增(图3)。
实施例3：猪圆环病毒多重PCR方法灵敏度试验
一种猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，用以检测1型、2型、3型和4型的阳性质粒，紫外分光光度计测定各自浓度后计算浓度，稀释调整阳性质粒浓度分别为60μg/μl，50μg/μl，40μg/μl，30μg/μl，20μg/μl，10μg/μl，1μg/μl四种质粒作为模板，用试剂盒提供的扩增混合液进行多重PCR(按实施例2中步骤进行)，试验结果如图4所示。结果显示本发明设计的引物组合能够保证检测时的灵敏性，不同PCV病毒检测引物的检测灵敏度为DNA终浓度10μg/μl。
本发明的猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒能检测的极限为10μg/μl，表明本发明的猪圆环病毒1型、2型、3型和4型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法有很高的灵敏度。
实施例4：猪圆环病毒2型组织样品和全血以及血清样品多重PCR方法验证试验
PCV2组织病料、血清以及全血处理以及DNA提取，PCR扩增反应和电泳检测。具体多重PCR操作步骤按实施例2中步骤进行。PCV2通过国标引物验证确定为PCV2病料后，进行本引物PCR验证，三种不同病料均可以扩增出目的条带，如图5所示。
实施例5：猪圆环病毒3型组织样品和全血以及血清样品多重PCR方法验证试验
PCV3组织病料、血清以及全血处理以及DNA提取，PCR扩增反应和电泳检测。具体多重PCR操作步骤按实施例2中步骤进行。PCV3通过国标引物验证确定为PCV3病料后，进行本引物PCR验证，三种不同病料均可以扩增出目的条带，如图6所示。
实施例6：猪圆环病毒4型组织样品多重PCR方法验证试验
PCV4组织病料处理以及DNA提取，PCR扩增反应和电泳检测。具体多重PCR操作步骤按实施例2中步骤进行。PCV4组织病料可以通过本引物组扩增出目的条带，如图7所示。
实施例7：对浓度差异较大的不同基因型的圆环病毒进行验证
PCV1的DNA浓度为40μg/μl，PCV2的DNA浓度为40μg/μl，PCV3的DNA浓度为10μg/μl进行混合检测，通过实施例1中设计的引物进行PCR扩增反应和电泳检测(按实施例2中步骤进行)。结果显示，该混合样PCR鉴定均能检测出PCV1，PCV2和PCV3的目的条带。结果表明本发明所提供的多重引物对样品中浓度差异较大的不同基因型的圆环病毒也能进行验证。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛易邦生物工程有限公司
<120> 一种用于检测猪圆环病毒不同基因型的试剂及检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtgggatg ghtayvatgg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatacccaca ccaatgtc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggactacaa tatccgtata a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actttccacg aatattctcc g 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaaggaccg ggaacgatc 19
Claims (10)
1.一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物组，所述的不同基因型猪圆环病毒包括猪圆环病毒1型PCV1、猪圆环病毒2型PCV2、猪圆环病毒3型PCV3和猪圆环病毒4型PCV4；其特征在于，所述的引物组包含有：
上游通用引物，其核酸序列为SEQ ID NO:1；
用于检测PCV1的下游引物PCV1-R，其核酸序列为SEQ ID NO:2；
用于检测PCV2的下游引物PCV2-R，其核酸序列为SEQ ID NO:3；
用于检测PCV3的下游引物PCV3-R，其核酸序列为SEQ ID NO:4；
用于检测PCV4的下游引物PCV4-R，其核酸序列为SEQ ID NO:5。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测不同基因型猪圆环病毒的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测不同基因型猪圆环病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为PCR扩增检测试剂盒，其中包含有权利要求1所述的引物组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有PCR扩增检测用的试剂。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增检测用的试剂，包含有10×Taq Buffer、dNTP、MgCl2和Taq酶。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含有阳性质控品和阴性质控品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品，为阳性质控品PCV1/PCV2/PCV3/PCV4阳性质粒混合物。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性质控品为RNase-free H2O。
9.一种检测不同基因型猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述的发包括如下的步骤：
1)DNA提取：提取待检测样品的DNA；
2)PCR扩增反应：对待检测的样品进行PCR扩增反应：
10×Taq Buffer 2.5μl、dNTP 2μl、MgCl2 1.5μl、Taq酶0.2μl，上游共用引物、PCV1下游引物、PCV2下游引物、PCV3下游引物和PCV4下游引物各1μl，DNA模板2μl，加入RNase-freeH2O至25μl，混合均匀；PCR扩增反应的程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸7min；
3)电泳检测
通过经1％琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品的PCR扩增产物，阳性对照PCR扩增产物和阴性对照PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断；判断标准为：阴性对照样品PCR扩增产物不出条带，阳性对照样品PCR扩增出产物出518bp、455bp、210bp和858bp；待检样品出现单一大小条带，即为单一感染；若出现多符合大小的条带，即为混合感染；待检样品PCR扩增产物无条带，即为阴性。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的待检样品为组织病料样品、血清样品或全血样品。
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