CN112646930A - 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。该引物对包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物；探针序列如SEQ ID NO.3所示，并在探针的5’端标记有FAM荧光基团。本申请根据猪圆环病毒3型ORF2保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，优化实时荧光定量PCR反应条件和体系，建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法，最低检测值仅为7.87×10¹拷贝/μL，灵敏度高；并且，采用本申请方法检测不同稀释度PCV3标准品的Ct值变异系数均小于1％，表明本申请方法具有很好的重复性。

Description

一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检 测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种小型单股环状无囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径仅17～20nm。已知的猪圆环病毒主要包括2个血清型，猪圆环病毒1型(PCV1)对猪无致病性，猪圆环病毒2型(PCV2)能引发多种猪圆环病毒相关疾病。猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新型圆环病毒，2016年首次在患有猪皮炎肾病综合征(PDNS)与繁殖障碍的母猪以及其流产胎儿体内被鉴定发现。PCV3基因组全长2000bp，含有2个反向排列的开放阅读框(ORFs)，其中ORF1编码含有296个氨基酸的复制酶蛋白(Rep)，ORF2编码含有241个氨基酸的衣壳蛋白(Cap)。基因分析发现PCV3与PCV2、PCV1基因组之间同源性较低，并且抗原蛋白Cap之间不具有交叉保护性。

自2016年以来，我国部分省(市)相继出现以母猪流产和死亡、断奶仔猪呼吸衰竭和死亡为临床特征的PCV3感染报道，相关研究表明，PCV3已经在我国出现并且流行很长一段时间。PCV3作为近几年发现流行的圆环病毒，常以混合感染的形式出现，给养猪业的疾病防控带来一定困难，快速准确地诊断猪群的感染状态对于预防和控制猪圆环病毒具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法，本申请通过设计针对PCV3 ORF2的特异性引物，探索引物和探针最佳工作浓度，进一步确定最适反应体系及扩增条件，应用荧光定量PCR技术建立了定量检测PCV3的方法，该方法特异性强、重复性好、灵敏度高，为PCV3临床鉴别诊断提供了有力的技术支持。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对，包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物。

进一步地，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对用于扩增猪圆环病毒3型的ORF2基因保守区域。

进一步地，采用所述引物对进行PCR检测时，还需使用如SEQ ID NO.3所示的探针。

进一步地，探针为5’端标记有FAM荧光基团的TaqMan MGB探针。

一种用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒，包括权利要求1的引物对以及权利要求3的探针。

一种猪圆环病毒3型的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用权利要求1所述引物和权利要求3所述探针对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据检测结果判断是否含有猪圆环病毒3型。

进一步地，PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq^TM 12μL、PCV3-F 1μL、PCV3-R1μL、PCV3-R探针1μL、模板DNA 2.0μL，最后用ddH₂O补充至20μL。

进一步地，PCV3-F、PCV3-R以及PCV3-R探针的浓度均为0.5μmol/L。

进一步地，PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s；60℃退火30s，共40个循环。

本发明的有益效果为：

本申请根据猪圆环病毒3型ORF2保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，优化实时荧光定量PCR反应条件和体系，建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法。该方法最低检测值为7.87×10¹拷贝/μL，灵敏度高。并且，采用本申请方法检测不同稀释度PCV3标准品的Ct值变异系数均小于1％，表明本申请方法具有很好的重复性。

附图说明

图1为10倍系列稀释PCV3质粒标准品的荧光定量PCR扩增结果；

图2为本申请构建的荧光定量PCR检测PCV3的标准曲线；

图3为本申请构建的荧光定量PCR检测方法特异性试验结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

1、主要试剂及仪器设备

2×Premix Ex Taq^TM、DL2000 DNA Marker均购自宝日医生物工程(北京)有限公司；病毒基因组DNA提取试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司。NANODROP 2000(微量分光光度计，ThermoFisher Scientific)；实时荧光定量PCR仪(CFX Connect Real-Timesystem，BIO RAD)。

实施例1设计引物和探针序列

参照GenBank中发表的PCV3基因组序列，针对猪圆环病毒ORF2保守区域，应用生物信息软件primer peimier 5.0分别设计一对特异性引物和一条标记FAM荧光报告基团的TaqMan MGB探针，并送生工生物工程(上海)有限公司合成。引物和探针序列信息详见表1。

表1PCV3引物及探针序列信息

实施例2试验方法的优化

1、重组质粒标准品的制备

参照DNA试剂盒提取说明书提取PCV3阳性病料DNA，并以其为模板用上述PCV3引物进行目的基因扩增，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测阳性目的基因，回收纯化PCR扩增产物并克隆至pDC316载体，连接产物转化E.Coli DH5α感受态细胞，挑取在氨苄青霉素抗性的LB平板上生长的阳性克隆，测序正确后提取质粒。使用NANODROP 2000测定质粒浓度，按以下公式计算拷贝数：拷贝数(拷贝/μL)＝(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(DNA length×660)。

2、引物和标记探针最佳工作浓度的确定

浓度为10μmol/L的引物和探针，用ddH₂O分别稀释至终浓度为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L，以上述重组质粒标准品为模板，利用矩阵法进行荧光定量PCR试验筛选最适工作浓度，以获得最小Ct值及典型的S型扩增曲线为判定依据。

3、酶最适添加量的确定

在引物和探针最佳工作浓度条件下，扩增体系中酶添加量依次为4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，进行荧光定量PCR试验筛选酶最适添加量。

4、最佳退火延伸温度的确定

在引物和探针最佳工作浓度以及最适酶添加量条件下，退火延伸温度分别设置为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃和62℃，进行荧光定量PCR试验筛选最佳退火延伸温度。

5、标准曲线的建立

将PCV3标准质粒进行10倍系列稀释，选取7个稀释度的标准品模板，对应的浓度分别为7.87×10³～7.87×10⁹拷贝/μL，以确定的最适反应体系及扩增条件进行荧光定量PCR扩增。以每反应拷贝数的对数为X轴，循环阈值(Ct值)为Y轴作回归曲线，建立质粒拷贝浓度与循环阈值对应的定量标准曲线。PCR扩增结果和标准曲线分别见图1和图2。

如图1和图2所示，获得的标准曲线回归方程为：y＝-3.4675x+40.365，相关系数(R²)为0.9996，扩增效率E为0.94。表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可用于PCV3核酸的定性和定量检测。

6、最佳反应体系及扩增条件的确定

制备的PCV3重组质粒标准品测定浓度为311.1ng/μL，换算成拷贝数是7.87×10¹⁰拷贝/μL。以PCV3重组质粒标准品为模板进行荧光定量PCR筛选最佳反应体系及扩增条件结果见表2。检测PCV3所用引物及探针的最适终浓度均为0.5μmol/L，反应体系中酶最适添加量为12μL，最优扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s；60℃退火30s，共40个循环。

表2荧光定量PCR检测方法最佳反应体系

实施例3PCR方法特异性、敏感性、及重复性试验

1、特异性试验

提取猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪伪狂犬病毒核酸，同时以PCV3重组质粒标准品作为阳性对照，按优化的反应体系和扩增条件进行荧光定量PCR，另设立空白对照，验证该检测方法的特异性，其结果如图3所示。

如图3所示，除PCV3重组质粒标准品外，其余样品均未出现特异性扩增，表明本研究建立的荧光定量PCR检测方法特异性良好。

2、敏感性试验

PCV3质粒标准品作10倍系列稀释，稀释至7.87×10¹～7.87×10³拷贝/μL，按照建立的检测PCV3荧光定量PCR方法进行试验，同时进行常规PCR方法检测，比较两者的敏感性，其结果见表3。

表3荧光定量PCR方法敏感性试验结果

如表3所示，本申请构建的荧光定量PCR检测方法最低检测值为7.87×10¹拷贝/μL，而常规PCR方法的最低检测值则是为7.87×10³拷贝/μL，表明本研究建立的检测PCV3的荧光定量PCR方法敏感性优于常规PCR方法，检出率更高。

3、重复性试验

选取3个稀释度重组质粒(7.87×10⁵～7.87×10⁷拷贝数)为模板，进行荧光定量PCR检测，共检测3次且每个稀释度作3个平行试验，对Ct值结果进行统计学分析，并计算组间及组内变异系数(CV)，以验证建立的荧光定量PCR检测方法的重复性，其结果见表4。

表4荧光定量PCR方法重复性试验结果

如表4所示，采用本申请构建的方法进行检测时，不同浓度标准品模板的组内重复试验变异系数为0.3％～0.81％，组间重复试验变异系数为0.39％～0.93％，PCV3质粒标准品重复检测的变异系数均小于1％，表明此方法稳定性和重复性好。

实施例4临床样品的PCV3检测

采用本申请建立的荧光定量PCR方法对2018—2020年四川省不同地区收集的329份正常猪血清、56份流产胎儿、29份精液、102份唾液拭子进行PCV3检测，通过PCV3阳性率了解目前四川省猪圆环病毒3型的流行状况。

根据对临床样品的检测，PCV3阳性率为31.3％(103/329)。56份流产胎儿、29份精液、102份唾液拭子检测结果显示，检出的阳性率分别为流产胎儿48.21％(27/56)、精液33.33％(13/39)、唾液拭纸51.61％(32/62)。该结果表明PCV3在四川省内规模化猪场广泛存在，具有较高的流行率。

本申请根据猪圆环病毒3型ORF2保守区域设计了一对特异性引物和一条探针，优化实时荧光定量PCR反应条件和体系，建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法。该方法最低检测值为7.87×10¹拷贝/μL，灵敏度高于李畅等荧光定量PCR方法检测的129拷贝数。张志等建立的检测PCV3荧光定量PCR方法组内及组间重复性试验变异系数小于3％，而本申请方法检测不同稀释度PCV3标准品Ct值变异系数均小于1％，表明本申请方法重复性更好。

序列表

<110> 畜科生物工程有限公司

<120> 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttccaacg gaaatgacgt t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcccacagct ggcacatac 19

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtggagt atttctt 17

Claims (8)

1.一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的特异性引物。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒3型的引物对，其特征在于，采用所述引物对进行PCR检测时，还需使用如SEQ ID NO.3所示的探针。

3.根据权利要求2所述的用于检测猪圆环病毒3型的引物对，其特征在于，所述探针为5’端标记有FAM荧光基团的TaqMan MGB探针。

4.一种用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对以及权利要求3所述探针。

5.一种猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为模板，采用权利要求1所述引物和权利要求3所述探针对其进行PCR扩增，回收纯化扩增产物后，根据检测结果判断是否含有猪圆环病毒3型。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：2×Premix ExTaq^TM 12μL、PCV3-F 1μL、PCV3-R 1μL、PCV3-R探针1μL、模板DNA 2.0μL，最后用ddH₂O补充至20μL。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述PCV3-F、PCV3-R以及PCV3-R探针的浓度均为0.5μmol/L。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s；60℃退火30s，共40个循环。

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