CN107338330A

CN107338330A - 检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量pcr引物、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN107338330A
Application number: CN201710656101.8A
Authority: CN
Inventors: 樊惠英; 谢永生; 王诚诚
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2017-11-10

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物、试剂盒和检测方法。所述的检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。本发明还提供了一种包含上述引物的试剂盒以及猪圆环病毒3型的检测方法。上述引物、试剂盒以及检测方法特异性强、灵敏性高和重复性稳定，扩增产物的融解曲线波峰单一，无引物二聚体，与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒基因组均无交叉反应；灵敏性为10²拷贝/μL，比常规PCR高100倍；组间和组内重复试验的变异系数均小3.0％。为该疫病的分子流行病学和防控研究奠定了基础。

Description

检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是1974年由德国学者Tischer等从猪传代肾细胞系PK-15中首次分离出来的。PCV是迄今为止发现的最小的动物病毒，病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称；属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属，是单股环状DNA病毒，无囊膜。根据其发现的先后、致病性和基因组序列等差异，目前一共有三种类型的圆环病毒，分别是PCV1(Porcine circovirus 1)、PCV2(Porcine circovirus 2)和PCV3(Porcinecircovirus 3)。PCV1最早发现对猪不具有致病性。而随后发现的能引起猪发病的PCV，称其为PCV2。PCV2已被证明是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning mμLtisystemicwasting syndrome，PMWS)等疾病的的主要病原体，自1991年在加拿大断奶仔猪群中首次报道PMWS以来，该病目前已呈世界流行；主要的临床症状包括消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、增重迟缓、皮肤苍白等。PCV2可造成猪的抵抗力下降，损伤机体的免疫系统，以淋巴结肿大、淋巴细胞减少等为主要特征，导致严重的免疫抑制，给世界养猪业带来巨大的经济损失。根据文献报道，PCV2有五种基因亚型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e，PCV2d序列最早在中国被发现，目前有研究证明，多个国家和地区的PCV2流行基因型已由PCV2b转变为PCV2d。最近在美国和墨西哥的病料中检测到PCV2e，它的全基因序列1777bp。

2016年在美国猪群中首次发现了一种新的圆环病毒，PCV3(Porcine circovirus3)，并且PCV3可能与猪皮炎与肾病综合征(Porcine Dermatitis Nephropathy Syndrome，PDNS)、母猪繁殖失败、流产等临床症状相关。2017年，在国内也有相应的文章报道了PCV3的出现。但是到目前为止关于PCV3的报道依旧很少，加大对PCV3的研究势在必行。

目前对PCV3检测普遍应用的是常规PCR的方法，该方法虽然简单、方便、快速、敏感，但是仍然存在假阳性、易漏检、PCR污染等缺陷。近年来，SYBR-Green I实时荧光定量PCR检测方法因为操作简单、快速、灵敏度高、特异性高、重复性好、不易污染、假阳性率低和可自动定量分析等优点，被越来越多地应用于各种病毒的检测。SYBR-Green I是结合于双链DNA的荧光染料，可在定量PCR反应时与双链PCR产物结合时放出荧光信号，被仪器系统实时监控并检测。

目前国内还没有应用荧光定量PCR方法检测PCV3的报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物。

本发明的另一目的在于提供一种检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包含上述实时荧光定量PCR引物。

本发明的再一目的在于提供上述引物和试剂盒的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种猪圆环病毒3型的检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物，包含引物F1和引物R1，其核苷酸序列如下所示：

引物F1：5'-TTTCCGGGACATAAATGCT-3'；

引物R1：5'-TACTTCACCCCCAAACCAA-3'；

一种检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR试剂盒，包含上述实时荧光定量PCR引物；

所述的检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR试剂盒，优选包含如下组分：SYBRGreen Master Mix(Low ROX Premixed)荧光PCR反应液，引物F1和引物R1，RNase freeH₂O；

所述的引物F1和引物R1的浓度优选为20μM；

所述的试剂盒还包括阳性标准品和阴性对照；

所述的检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物和试剂盒在检测猪圆环病毒3型领域中的应用；

所述的应用用于非疾病治疗与诊断目的；

一种猪圆环病毒3型的检测方法，包含如下步骤：

(1)提取猪圆环病毒3型病料组织中的病毒DNA；

(2)将步骤(1)中获得的病毒DNA使用引物Q1和引物Q2进行PCR扩增，胶回收并纯化PCR扩增产物；将回收纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接，得到重组标准质粒pMD19-T-ORF2；其中，引物Q1和引物Q2的核苷酸序列如下所示：

引物Q1：5'-TTAGAGAACGGACTTGTAACGAATC-3'；

引物Q2：5'-ATGAGACACAGAGCTATATACAGAA-3'；

(3)将步骤(2)制得的重组标准质粒pMD19-T-ORF2作为标准品，测定其浓度并计算起始质粒拷贝数，然后进行10倍梯度稀释；

(4)将步骤(3)中各稀释度的标准品及待测样品分别作为反应模板进行PCV3SYBR-Green I实时荧光定量PCR反应，建立猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测的标准曲线。根据标准曲线计算待测样品中猪圆环病毒3型核酸拷贝数，即为猪圆环病毒3型的含量；

步骤(2)中所述的PCR扩增的反应体系优选为：2xTaq PCR Master Mix 25μL，上下游引物Q1和Q2各1μL，DNA模板2μL，dd H₂O 21μL；

步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延5min；

步骤(4)中所述的PCV3 SYBR-Green I实时荧光定量PCR反应的体系优选为：SYBRGreen Master Mix(Low ROX Premixed)荧光PCR反应液：10μL，引物F1和引物R1(20μM)各0.2μL，反应模板：1μL，RNase free H₂O：8.6μL；

步骤(4)中所述的PCV3 SYBR-Green I实时荧光定量PCR反应的程序优选为：95℃预变性5min，95℃10s、60℃31s，40个循环；每个循环60℃退火延伸31s结束时采集荧光信号；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的猪圆环病毒3型SYBR-Green I实时荧光定量PCR引物、试剂盒以及检测方法特异性强、灵敏性高和重复性稳定，其中，特异性、灵敏性和重复性试验结果显示，扩增产物的融解曲线波峰单一，无引物二聚体，与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)基因组均无交叉反应；灵敏性为10²拷贝/μL，比常规PCR高100倍；组间和组内重复试验的变异系数均小3.0％。

(2)本发明提供的猪圆环病毒3型SYBR-Green I实时荧光定量PCR引物、试剂盒以及检测方法在日后的临床应用中，可以高效、方便地对PCV3病原进行实时监测，可用于临床上对PCV3病原感染的诊断与防治，也为该疫病的分子流行病学和防控研究奠定了基础。

附图说明

图1是PCV3 ORF2基因PCR扩增鉴定图；其中，M：DL2000 DNA Marker；1～4：PCV3阳性样品；5：阴性对照样品。

图2是PCV3实时荧光定量PCR扩增动力学曲线图；其中，1～8依次是10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝数的标准重组质粒的扩增曲线。

图3是PCV3实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，横坐标是质粒拷贝数的对数，纵坐标是循环阈值。

图4是PCV3实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线图。

图5是不同拷贝数的标准重组质粒常规PCR扩增电泳图；M：DL2000 DNA Marker；1～8依次是10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝数的标准质粒样品；9：阴性对照样品。

图6是PCV3实时荧光定量PCR检测方法的特异性实验扩增曲线图，其中，1、2：10⁵和10⁴标准质粒的扩增曲线；3：PCV2、CSFV、PRV、PRRSV和阴性对照的实时荧光定量PCR扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、引物设计与合成

根据己发表的PCV3基因序列，利用Primer 6.0软件根据PCV3 ORF2基因的保守序列设计了1对特异性荧光定量PCR引物F1和R1，该扩增长度为151bp；荧光定量PCR引物序列为:

上游引物F1：5'-TTTCCGGGACATAAATGCT-3'；

下游引物R1：5'-TACTTCACCCCCAAACCAA-3'。

设计一对扩增PCV3ORF2全基因的引物Q1和Q2，该引物扩增长度645bp；PCV3 ORF2全基因引物序列为：

上游引物Q1：5'-TTAGAGAACGGACTTGTAACGAATC-3'；

下游引物Q2：5'-ATGAGACACAGAGCTATATACAGAA-3'。

2、重组质粒标准品的制备

(1)病毒核酸的提取

将PCV3阳性病料组织(来自广东某猪场，根据PCV3标准毒株(GenBank号：KT869077)，经鉴定为PCV3阳性)捣碎，反复冻融三次之后，离心取组织上清液用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA；所获得的DNA置于-20℃备用。

(2)PCV3 ORF2基因的PCR扩增

以步骤(1)制得的PCV3病毒DNA为模板，用特异性引物Q1和引物Q2进行扩增，扩增片段长度为645bp，扩增体系为50μL；PCR反应体系如下：2xTaq PCR Master Mix 25μL，上下游引物Q1和Q2各1μL，DNA模板2μL，dd H₂O 21μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延5min；将扩增PCV3ORF2基因的PCR产物，在质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，结果出现1条645bp左右的DNA条带(图1)，与预期大小一致，回收纯化PCR产物；

(3)PCV3 ORF2基因的克隆与鉴定

将步骤(2)回收纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-T-ORF2；将其转化DH5α感受态细胞，然后在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆子；经PCR鉴定的阳性单菌落，用质粒小提试剂盒提取重组质粒；质粒送北京六合华大基因科技有限公司测序，进一步鉴定阳性的重组质粒；测序结果显示与GenBank上已发表PCV3 ORF2序列完全一致，表明pMD19-T-ORF2标准质粒成功构建；可作为PCV3实时荧光定量PCR检测方法的阳性标准品；

3、定量标准质粒的制备

将测序结果正确的重组质粒pMD19-T-ORF2进行扩大培养和纯化，即得到pMD19-T-ORF2阳性标准品。使用分光光度计测定阳性标准质粒的浓度，据公式计算标准质粒的拷贝数后分装，于-20℃保存备用。

拷贝数的计算公式为：拷贝数(copies/μL)＝[质粒浓度(ng/μL)×1μL]×10^-9/[(T载体质粒长度+PCV2ORF2全基因组长度)×碱基对的分子量]×阿伏伽德罗常数。

提取扩大培养后的pMD19-T-ORF2阳性重组质粒，在分光光度计中分别测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，计算核酸浓度和纯化，换算得到重组质粒拷贝为2.85×10⁹。对阳性重组质粒进行10的倍比稀释，取10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²等8个释释度的重组质粒作为标准品模板。

4、优化PCV3 SYBR-Green I实时荧光定量PCR反应体系及反应程序

实时荧光定量PCR要求较高，必须对反应体系和条件进行优化，通过调整反应程序、反应体系后；确定实时荧光定量PCR反应最佳体系为20μL，其中SYBR Green Master Mix(Low ROX Premixed)荧光PCR反应液：10μL，上、下游引物(20μM)各0.2μL，质粒模板：1μL，RNase-free H₂O：8.6μL。同时设不加质粒模板的阴性对照。

最佳反应程序为：95℃预变性5min，95℃10s、60℃31s，40个循环。每个循环60℃退火延伸31s结束时采集荧光信号。

5、PCV3实时荧光定量PCR标准曲线建立

以重组质粒pMD19-T-ORF2为标准品，进行10倍梯度稀释，取10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²等8个释释度的重组质粒作为模板，分别加入到优化的实时荧光定量PCR体系及程序进行检测；同时设空白对照。以标准质粒拷贝数为横坐标，循环阈值(Ct)为纵坐标，得到PCV3荧光定量PCR扩增动力学曲线，见图2。

根据PCV3荧光定量PCR扩增动力学曲线，软件自动生成标准曲线(图3)，其斜率为-3.353225，截距为39.175278，相关系数为0.998683，从而可以得出拷贝数(x)与循环阈值(Ct)之间的线性关系表达式:Ct＝-3.353225×lgx+39.175278，而待测样品的Ct值可以从曲线读取；将待测样品的Ct值代入表达式就可以计算出待检测样品的初始拷贝数。

6、PCV3实时荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线

从图4可以看出，标准品DNA各个稀释度的溶解温度均为87.5℃左右，波峰单一、波峰的高度与DNA浓度呈正相关，而空白对照溶解曲线无波峰。

7、PCV3实时荧光定量PCR检测方法的灵敏性分析

将已计算出拷贝数的标准重组质粒为模板，在荧光定量PCR仪上所能检出的最低拷贝数为10²拷贝/20μL(图2)，而常规PCR所能检出的最低拷贝数为10⁴(图5)；因此实时荧光定量PCR的灵敏性比常规PCR高100倍。

8、PCV3实时荧光定量PCR检测方法的特异性分析

用所建立的实时荧光定量PCR方法对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)等病毒DNA(或cDNA)进行检测，同时设阳性和阴性对照，确定该方法的特异性。其中，猪圆环病毒2型毒株已在申请号为“201610333059.1”，申请名称为“一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用”中公开；猪瘟病毒(CSFV)毒株(疫苗株GXW-07)已在申请号为“201310629121.8”，申请名称为“检测猪瘟病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用”中公开；猪伪狂犬病毒毒株已在申请号为“201610909248.9”，申请名称为“一种提高伪狂犬病病毒同源重组效率和重组病毒筛选的方法”中公开；猪蓝耳病毒(PRRSV)已在申请号为“201110135690.8”，申请名称为“一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用”中公开；

特异性实时荧光定量PCR扩增结果显示：只有PCV3有荧光信号，其他如猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)的扩增曲线和阴性对照相同，可认定为阴性，表明该荧光定量PCR引物对PCV-3基因具有很好的特异性(图6)。

9、PCV3实时荧光定量PCR检测方法的重复性分析

选取10⁷、10⁶、10⁵、10⁴稀释度的标准质粒样品进行重复性试验，每个样品3次组内重复性实验和3次组间重复性实验，统计每组标准质粒样品的平均值、标准差、变异系数(％)，验证荧光定量PCR结果的重复性。结果：4份PCV3标准质粒样品经3次组内重复及3次组间重复检测的Ct值误差均小于1.0，变异系数均小于3.0％(表1、表2)；表明该方法重复性较高，从而保证了不同样品间检测结果的可靠性和稳定性。

表1组内重复试验结果

表2组间重复试验结果

10、临床样本的检测结果

从广东省不同地区的发病猪群中收集的20份疑似PCV3感染的病料样品采用常规PCR检测，可检测到12份阳性样品；而用本发明建立PCV3 SYBR-Green I实时荧光定量PCR方法检测，15份样品完全阳性，且多余的3份阳性样品的PCV3核酸拷贝数均介于10²～10⁴之间，在常规PCR灵敏度的范围之外；说明本发明建立的PCV3 SYBR-Green I实时荧光定量PCR检测方法比常规PCR的检测结果更准确且灵敏度更高。

本发明成功建立了猪圆环病毒3型SYBR-Green I实时荧光定量PCR检测方法，能够快速、特异性的检测PCV3病毒，该方法具有特异、敏感、定量、重复性好等优点，可用于临床上对PCV3病原感染的诊断与防治，同时可为规模化猪场净化PCV3病毒提供了一种可行的方法，也为PCV3的分子流行病学调查，发病机制，诊断试剂盒的研制与开发奠定了理论依据和技术支持。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物、试剂盒和检测方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F1

<400> 1

tttccgggac ataaatgct 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 2

tacttcaccc ccaaaccaa 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Q1

<400> 3

ttagagaacg gacttgtaac gaatc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物Q2

<400> 4

atgagacaca gagctatata cagaa 25

Claims

1.一种检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物，其特征在于包含引物F1和引物R1，其核苷酸序列如下所示：

引物F1：5'-TTTCCGGGACATAAATGCT-3'；

引物R1：5'-TACTTCACCCCCAAACCAA-3'。

2.一种检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的实时荧光定量PCR引物。

3.根据权利要求2所述的检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包含如下组分：SYBR Green Master Mix荧光PCR反应液，权利要求1中所述的引物F1和引物R1，RNase free H₂O。

4.根据权利要求3所述的检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

所述的引物F1和引物R1的浓度为20μM；

所述的试剂盒还包括阳性标准品和阴性对照。

5.权利要求1所述的检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR引物和权利要求2～4任一项所述的试剂盒在检测猪圆环病毒3型领域中的应用。

6.一种猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)提取猪圆环病毒3型病料组织的病毒DNA；

(2)将步骤(1)中获得的病毒DNA使用引物Q1和引物Q2进行PCR扩增PCV3ORF2基因，胶回收并纯化PCR扩增产物；将回收纯化后的PCR产物与pMD19-T载体连接，得到重组标准质粒pMD19-T-ORF2；其中，引物Q1和引物Q2的核苷酸序列如下所示：

引物Q1：5'-TTAGAGAACGGACTTGTAACGAATC-3'；

引物Q2：5'-ATGAGACACAGAGCTATATACAGAA-3'；

(4)将步骤(3)中各稀释度的标准品及待测样品分别作为反应模板进行PCV3SYBR-Green I实时荧光定量PCR反应，建立猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测的标准曲线。根据标准曲线计算待测样品中猪圆环病毒3型核酸拷贝数，即为猪圆环病毒3型的含量。

7.根据权利要求6所述的猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的PCV3ORF2基因的PCR扩增反应体系为：2xTaq PCR Master Mix 25μL，上下游引物Q1和Q2各1μL，DNA模板2μL，dd H₂O 21μL。

8.根据权利要求6所述的猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的PCV3ORF2基因PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延5min。

9.根据权利要求6所述的猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的实时荧光定量PCR反应的体系为：SYBR Green Master Mix荧光PCR反应液：10μL，引物F1和引物R1各0.2μL，反应模板：1μL，RNase free H₂O：8.6μL。

10.根据权利要求6所述的猪圆环病毒3型的检测方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的实时荧光定量PCR反应的程序为：95℃预变性5min，95℃10s、60℃31s，40个循环；每个循环60℃退火延伸31s结束时采集荧光信号。