CN111020059A - 一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法 - Google Patents

一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111020059A
CN111020059A CN201911309233.9A CN201911309233A CN111020059A CN 111020059 A CN111020059 A CN 111020059A CN 201911309233 A CN201911309233 A CN 201911309233A CN 111020059 A CN111020059 A CN 111020059A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcv3
pcr
porcine
primer
detection method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911309233.9A
Other languages
English (en)
Inventor
张�杰
丁耀忠
张维兵
李彦军
汪洋
李苗苗
李国秀
马炳
刘永生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN201911309233.9A priority Critical patent/CN111020059A/zh
Publication of CN111020059A publication Critical patent/CN111020059A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，根据猪圆环病毒3型(PCV3)的保守基因区段筛选出特异性引物，建立PCR检测方法，所得目的基因扩增片段大小为457bp。建立的PCV3 PCR不与猪圆环病毒2型、1型和2型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒、古典猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒发生交叉反应，可用以了解样品采集地猪群PCV3的感染情况，经敏感性和特异性检测分析表明建立的PCV3 PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用于田间样品的常规检测。采用本发明建立的PCR方法检测了我国2017‑2018年11个不同省份不同猪场的总共1402份田间样品，PCV3的阳性检出率为29.48％，具有一定临床应用价值，可用于临床PCV3的检测。

Description

一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus)属于圆环病毒科圆环病毒属，是一类单链环状DNA病毒，病毒粒子无囊膜、呈二十面体对称球形，平均直径17nm，是目前已知的最小的哺乳动物病毒。猪圆环病毒中猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型发现较早，其研究也相对较多，而猪圆环病毒3型(PCV3)是近几年检测发现的一类新型的猪圆环病毒，该病毒与圆环病毒基因组结构类似，具有遗传相似性，与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性小于70％。猪圆环病毒3型(PCV3)的患病猪会出现皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心肌炎和多系统炎症。PCV3感染与猪的品系、年龄和种类无关，逐渐成为危害全球养猪业健康发展的又一主要致病病原。PCV3属于圆环病毒科，但是与现在猪场常见的PCV2的亲缘关系很远，其主要蛋白核衣壳Cap的氨基酸同源性仅为30％，所以，当前针对PCV2的疫苗对PCV3的交叉免疫保护的可能性较低，事实也证明了这一点，免疫了PCV2疫苗的猪场仍然存在PCV3感染。所以，在当今缺乏相关有效疫苗的情况下，及时发现并淘汰PCV3阳性猪群是净化猪场的重要举措。
发明内容
针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
对PCV3全基因组序列进行多序列比对找出高度保守序列，根据高度保守基因序列设计特异性引物P833和P834，所述引物P833为上游引物，P834为下游引物，所述引物的基因序列如下：
P833：5'-CCGGGACATAAATGCTCCAAAG-3'，
P834：5'-AAGAAATACTCCACCATGAACGTCA-3'；
(2)样品处理及核酸提取
采集猪血清样品若干份，以3～5管各一定体积的血清样品为一组进行混合，得到预混血清样品，预混处理后，使用核酸提取试剂盒提取预混血清样品的核酸样品；
(3)PCV3阳性质粒的制备
以PCV3全基因组序列为目的序列，与pUC57载体进行重组质粒的构建；
(4)PCR扩增反应
以P833和P834为引物对构建的重组质粒进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为20.0μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1.0μL，MyLab 2XPCR TaqMix 10μL，加无菌dd H2O补足至20μL；反应条件：95℃预变性5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s，进行40个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。
优选地，所述扩增后的目的片段大小为457bp。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本发明为PCV3基因序列设计并筛选了一对特异性引物，PCR扩增可获得较短的扩增片段(300bp～500bp)，这有利于提高PCR扩增的灵敏性，进而极大提高了临床检测效率。同时经过对PCR反应程序及条件的反复优化，结果显示PCV3 PCR检测方法对标准品质粒检度为100copies/μL，且不与猪圆环病毒2型、1型和2型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒、古典猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒发生交叉反应。本发明建立了一种快速、特异、灵敏度高的PCV3 PCR检测方法，可用以了解样品采集地猪群PCV3的感染情况。经过试验表明，本发明建立的PCV3的PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，具有一定临床应用价值，为后续PCV3的检测及其疾病的诊断提供了参考。
附图说明
图1是本发明实施例提供的PCV3重组质粒PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：以PCV3质粒为模板；2：阴性ddH2O对照。
图2是本发明实施例提供的PCR特异性检测结果图，图中，M：DL：2000DNA分子质量标准；1：猪繁殖与呼吸综合征-美洲型；2：猪繁殖与呼吸综合征-欧洲型；3：猪流行性乙型脑炎(JEV)；4：猪细小病毒(PPV)；5：猪伪狂犬病毒(PRV)；6：猪圆环病毒2型(PCV2)；7：古典猪瘟病毒(CSFV)；8：非洲猪瘟病毒(ASFV)；PC：PCV3阳性对照；NC：阴性对照。
图3是本发明实施例提供的PCV3敏感性检验结果图，图中，M：DL：2000DNA分子质量标准；10-1：1x1010～1x101 copies/μL；PC：PCV3阳性质粒；NC:阴性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、材料与方法
1、材料
毒株猪圆环病毒2型(PCV2)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)、猪乙脑病毒(Pig je virus，JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)为本实验室保存毒株。
临床样品共1402份血清样品，采自2017-2018年中国7大地理区域随机的11个省份不同规模化猪场，对同一猪场的血清样品以3～5管为单位进行混合，最后总共得407份血清样品，-40℃保存。
小剂量核酸提取试剂盒购自宝生生物工程(大连)有限公司；MyLab 2xPCR TaqMix购自北京美莱博医学科技有限公司；质粒提取试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司。
2、方法
(1)引物设计与合成
利用Megalign软件将Gen Bank中已登录的PCV3全基因组序列进行多序列比对找出高度保守序列，运用的Primer Premier 6.0软件，根据Gen Bank中已登录的PCV3(登录号：KY778777)高度保守基因序列设计特异性引物P833和P834，扩增目的片段大小预期为457bp。引物P833为上游引物，P834为下游引物，其基因序列如下：
P833：5'-CCGGGACATAAATGCTCCAAAG-3'，
P834：5'-AAGAAATACTCCACCATGAACGTCA-3'；
引物委托西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。
(2)样品处理及核酸提取
对预混处理后的407份血清样品使用核酸提取试剂盒提取预混血清样品的核酸样品。
(3)PCV3阳性质粒的制备
以Gen BanK中登录号KY778777.1的PCV3全基因组序列为目的序列送往金唯智(苏州)生物科技有限公司与pUC57载体进行重组质粒的构建。
(4)PCR的建立及条件优化
分别设定退火温度(50℃～65℃)、延伸时间(30s～65s)、引物量(0.2μL～1μL)、模板量(0.5μL～2μL)多个变量，对PCR检测方法进行优化，获得最佳反应条件。
(5)PCR产物测序鉴定选取
以P833和P834为引物，利用建立的PCR方法检测田间样品得部分阳性样品，经PCR产物送往西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序，测序结果用DNAStar软件与Gen Bank中登录的PCV3基因序列进行比对分析，同时在NCBI中进行比对以确定PCR扩增片段的特异性。
3、检测试验
(1)PCR特异性试验
利用建立的PCR方法分别扩增PCV2、JEV、CSFV、ASFV、PRRSV、PRV和PPV，并以PCV3阳性质粒和ddH2O依次作为阳性和阴性对照，检测该PCR方法的特异性。
(2)PCR敏感性试验
测定PCV3阳性质粒的浓度，并依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取1μL作为PCR反应模板，进行PCR扩增，测定最低检出浓度，评估该PCR方法的敏感性。
(3)临床样品PCR检测
利用建立的PCR方法对2017-2018年收集的田间样品预混407份进行回顾性检测，分析不同地区样品中的PCV3的感染情况。
二、结果与分析
1、PCR阳性质粒的制备结果
以引物P833和P834对重组质粒进行PCR扩增，在500bp条带以下得到预期大小片段457bp，如图1所示。经测序，测序结果与NCBI公布的登录号KY778777.1同源性为100％，说明构建的PCV3阳性质粒正确。
2、PCR反应的建立及条件优化结果
经条件优化，确定最优反应体系为20.0μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1.0μL，MyLab 2XPCR TaqMix 10μL，加无菌dd H2O补足至20μL；最优反应条件：95℃预变性5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s，进行40个循环；72℃延伸10min。
3、PCR特异性试验结果
利用建立的最优PCR反应条件，对PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2、CSFV、ASFV进行扩增，结果如图2所示。结果表明，建立的PCR方法只能扩增出PCV3样品中的特异性目的片段，而对PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2、CSFV、ASFV均扩增不出目的片段，表明该PCR方法特异性较好。
4、PCR敏感性试验结果
利用建立的最优PCR反应条件，对不同稀释度的PCV3阳性质粒进行PCR扩增，结果如图3所示。结果表明可检测到的最低质粒浓度为100copies/μL，说明该方法具有较好的敏感性。
5、田间样品检测结果
利用建立的PCR方法对来自2017-2018年中国6大地理区域中的11个省份不同规模化猪场共1402份血清样品进行检测，结果如表1所示，显示407份预混样品中检出120份阳性，阳性率为29.48％。
表1 2017-2018各地区田间样品PCR检测结果统计表
Figure BDA0002324053630000061
三、结论
本发明参考PCV3基因序列设计并筛选了一对特异性引物，在500bp条带以下得到预期大小片段457bp，较短的扩增片段(300bp～500bp)有利于提高PCR扩增的灵敏性，进而极大提高了临床检测效率。同时经过对PCR反应程序及条件的反复优化，结果显示PCV3 PCR检测方法对标准品质粒检度为100copies/μL，且与8种常见的猪源病原均无交叉反应。基于以上试验结果，表明本发明建立的PCR方法具有良好的特异性和敏感性。因此本发明建立的PCR检测方法具有一定临床应用价值，为PCV3的检测和及其疾病的诊断提供了参考。应用本研究所建立的PCR检测方法对2017-2018年田间样品进行检测，结果显示407份预混样品中PCV3阳性率为29.48％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
对PCV3全基因组序列进行多序列比对找出高度保守序列，根据高度保守基因序列设计特异性引物P833和P834，所述引物P833为上游引物，P834为下游引物，所述引物的基因序列如下：
P833：5'-CCGGGACATAAATGCTCCAAAG-3'，
P834：5'-AAGAAATACTCCACCATGAACGTCA-3'；
(2)样品处理及核酸提取
采集猪血清样品若干份，以3～5管各一定体积的血清样品为一组进行混合，得到预混血清样品，预混处理后，使用核酸提取试剂盒提取预混血清样品的核酸样品；
(3)PCV3阳性质粒的制备
以PCV3全基因组序列为目的序列，与pUC57载体进行重组质粒的构建；
(4)PCR扩增反应
以P833和P834为引物对构建的重组质粒进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为20.0μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1.0μL，MyLab 2XPCR TaqMix 10μL，加无菌dd H2O补足至20μL；反应条件：95℃预变性5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s，进行40个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型的PCR检测方法，其特征在于，所述扩增后的目的片段大小为457bp。
CN201911309233.9A 2019-12-18 2019-12-18 一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法 Pending CN111020059A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911309233.9A CN111020059A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911309233.9A CN111020059A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111020059A true CN111020059A (zh) 2020-04-17

Family

ID=70210461

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911309233.9A Pending CN111020059A (zh) 2019-12-18 2019-12-18 一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111020059A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176104A (zh) * 2020-10-09 2021-01-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪圆环病毒3型的可视化lamp检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287350A (zh) * 2017-06-27 2017-10-24 广东温氏食品集团股份有限公司 一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法
CN107338330A (zh) * 2017-08-03 2017-11-10 华南农业大学 检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量pcr引物、试剂盒和检测方法
CN107828916A (zh) * 2017-11-30 2018-03-23 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪圆环病毒3型的引物、pcr试剂盒及应用
CN107937619A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 江苏省农业科学院 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287350A (zh) * 2017-06-27 2017-10-24 广东温氏食品集团股份有限公司 一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法
CN107338330A (zh) * 2017-08-03 2017-11-10 华南农业大学 检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量pcr引物、试剂盒和检测方法
CN107828916A (zh) * 2017-11-30 2018-03-23 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪圆环病毒3型的引物、pcr试剂盒及应用
CN107937619A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 江苏省农业科学院 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANCHANG WANG ET AL.: "Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detection of porcine circovirus 3", 《J VIROL METHODS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176104A (zh) * 2020-10-09 2021-01-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪圆环病毒3型的可视化lamp检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112575120B (zh) 一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒及检测方法
CN111020062A (zh) 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒
CN110878377B (zh) 非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量pcr鉴别诊断试剂盒
CN111321248B (zh) 非洲猪瘟病毒mgf-505r基因荧光pcr检测试剂、试剂盒及其应用
CN107955839A (zh) 用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物、检测方法及试剂盒
CN105907890B (zh) 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法
CN112795706A (zh) 非洲猪瘟病毒p72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用
CN115976285A (zh) 一种检测非洲猪瘟的四重荧光定量pcr检测试剂盒
CN113122655A (zh) 非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法
CN113174446A (zh) 一种用于牛病毒性腹泻病毒分型的一步法双重rt-pcr检测方法
CN103952498A (zh) 猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒及其应用
CN114350848A (zh) 一种鉴别非洲猪瘟ⅰ型毒株与ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用
Thuy et al. First investigation of the prevalence of parvoviruses in slaughterhouse pigs and genomic characterization of ungulate copiparvovirus 2 in Vietnam
CN111020059A (zh) 一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法
CN112280899A (zh) 猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用
CN111621596A (zh) 一种猪圆环病毒3型实时荧光定量pcr检测引物探针组、试剂盒及方法
CN117025846A (zh) 一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用
CN107513583A (zh) 检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量pcr引物及试剂盒
CN107937619B (zh) 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用
CN115852054A (zh) 一种猪蓝耳类欧洲株的荧光探针引物、试剂盒及其应用
CN112626278B (zh) 鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的引物、探针及应用
WO2021164186A1 (zh) 鉴别猪伪狂犬病毒变异毒株的pcr引物及方法
CN113755565A (zh) 一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法
Cao et al. Establishment and application of dual TaqMan fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) for the detection of porcine Circovirus types 2 and 3
CN111455101A (zh) 一种检测猪圆环病毒的实时荧光定量pcr试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200417

RJ01 Rejection of invention patent application after publication