CN111020059A - 一种猪圆环病毒3型的pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，根据猪圆环病毒3型(PCV3)的保守基因区段筛选出特异性引物，建立PCR检测方法，所得目的基因扩增片段大小为457bp。建立的PCV3 PCR不与猪圆环病毒2型、1型和2型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒、古典猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒发生交叉反应，可用以了解样品采集地猪群PCV3的感染情况，经敏感性和特异性检测分析表明建立的PCV3 PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用于田间样品的常规检测。采用本发明建立的PCR方法检测了我国2017‑2018年11个不同省份不同猪场的总共1402份田间样品，PCV3的阳性检出率为29.48％，具有一定临床应用价值，可用于临床PCV3的检测。

Description

一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus)属于圆环病毒科圆环病毒属，是一类单链环状DNA病毒，病毒粒子无囊膜、呈二十面体对称球形，平均直径17nm，是目前已知的最小的哺乳动物病毒。猪圆环病毒中猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型发现较早，其研究也相对较多，而猪圆环病毒3型(PCV3)是近几年检测发现的一类新型的猪圆环病毒，该病毒与圆环病毒基因组结构类似，具有遗传相似性，与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性小于70％。猪圆环病毒3型(PCV3)的患病猪会出现皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心肌炎和多系统炎症。PCV3感染与猪的品系、年龄和种类无关，逐渐成为危害全球养猪业健康发展的又一主要致病病原。PCV3属于圆环病毒科，但是与现在猪场常见的PCV2的亲缘关系很远，其主要蛋白核衣壳Cap的氨基酸同源性仅为30％，所以，当前针对PCV2的疫苗对PCV3的交叉免疫保护的可能性较低，事实也证明了这一点，免疫了PCV2疫苗的猪场仍然存在PCV3感染。所以，在当今缺乏相关有效疫苗的情况下，及时发现并淘汰PCV3阳性猪群是净化猪场的重要举措。
发明内容
针对上述背景技术中指出的不足，本发明提供了一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，旨在解决上述背景技术中现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
对PCV3全基因组序列进行多序列比对找出高度保守序列，根据高度保守基因序列设计特异性引物P833和P834，所述引物P833为上游引物，P834为下游引物，所述引物的基因序列如下：
P833：5'-CCGGGACATAAATGCTCCAAAG-3'，
P834：5'-AAGAAATACTCCACCATGAACGTCA-3'；
(2)样品处理及核酸提取
采集猪血清样品若干份，以3～5管各一定体积的血清样品为一组进行混合，得到预混血清样品，预混处理后，使用核酸提取试剂盒提取预混血清样品的核酸样品；
(3)PCV3阳性质粒的制备
以PCV3全基因组序列为目的序列，与pUC57载体进行重组质粒的构建；
(4)PCR扩增反应
以P833和P834为引物对构建的重组质粒进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为20.0μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1.0μL，MyLab 2XPCR TaqMix 10μL，加无菌dd H2O补足至20μL；反应条件：95℃预变性5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s，进行40个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。
优选地，所述扩增后的目的片段大小为457bp。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本发明为PCV3基因序列设计并筛选了一对特异性引物，PCR扩增可获得较短的扩增片段(300bp～500bp)，这有利于提高PCR扩增的灵敏性，进而极大提高了临床检测效率。同时经过对PCR反应程序及条件的反复优化，结果显示PCV3 PCR检测方法对标准品质粒检度为100copies/μL，且不与猪圆环病毒2型、1型和2型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒、古典猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒发生交叉反应。本发明建立了一种快速、特异、灵敏度高的PCV3 PCR检测方法，可用以了解样品采集地猪群PCV3的感染情况。经过试验表明，本发明建立的PCV3的PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，具有一定临床应用价值，为后续PCV3的检测及其疾病的诊断提供了参考。
附图说明
图1是本发明实施例提供的PCV3重组质粒PCR扩增的结果图，图中，M：DL2000分子量Marker，1：以PCV3质粒为模板；2：阴性ddH2O对照。
图2是本发明实施例提供的PCR特异性检测结果图，图中，M：DL：2000DNA分子质量标准；1：猪繁殖与呼吸综合征-美洲型；2：猪繁殖与呼吸综合征-欧洲型；3：猪流行性乙型脑炎(JEV)；4：猪细小病毒(PPV)；5：猪伪狂犬病毒(PRV)；6：猪圆环病毒2型(PCV2)；7：古典猪瘟病毒(CSFV)；8：非洲猪瘟病毒(ASFV)；PC：PCV3阳性对照；NC：阴性对照。
图3是本发明实施例提供的PCV3敏感性检验结果图，图中，M：DL：2000DNA分子质量标准；10-1：1x1010～1x101 copies/μL；PC：PCV3阳性质粒；NC:阴性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、材料与方法
1、材料
毒株猪圆环病毒2型(PCV2)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)、猪乙脑病毒(Pig je virus，JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)为本实验室保存毒株。
临床样品共1402份血清样品，采自2017-2018年中国7大地理区域随机的11个省份不同规模化猪场，对同一猪场的血清样品以3～5管为单位进行混合，最后总共得407份血清样品，-40℃保存。
小剂量核酸提取试剂盒购自宝生生物工程(大连)有限公司；MyLab 2xPCR TaqMix购自北京美莱博医学科技有限公司；质粒提取试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司。
2、方法
(1)引物设计与合成
利用Megalign软件将Gen Bank中已登录的PCV3全基因组序列进行多序列比对找出高度保守序列，运用的Primer Premier 6.0软件，根据Gen Bank中已登录的PCV3(登录号：KY778777)高度保守基因序列设计特异性引物P833和P834，扩增目的片段大小预期为457bp。引物P833为上游引物，P834为下游引物，其基因序列如下：
P833：5'-CCGGGACATAAATGCTCCAAAG-3'，
P834：5'-AAGAAATACTCCACCATGAACGTCA-3'；
引物委托西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。
(2)样品处理及核酸提取
对预混处理后的407份血清样品使用核酸提取试剂盒提取预混血清样品的核酸样品。
(3)PCV3阳性质粒的制备
以Gen BanK中登录号KY778777.1的PCV3全基因组序列为目的序列送往金唯智(苏州)生物科技有限公司与pUC57载体进行重组质粒的构建。
(4)PCR的建立及条件优化
分别设定退火温度(50℃～65℃)、延伸时间(30s～65s)、引物量(0.2μL～1μL)、模板量(0.5μL～2μL)多个变量，对PCR检测方法进行优化，获得最佳反应条件。
(5)PCR产物测序鉴定选取
以P833和P834为引物，利用建立的PCR方法检测田间样品得部分阳性样品，经PCR产物送往西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序，测序结果用DNAStar软件与Gen Bank中登录的PCV3基因序列进行比对分析，同时在NCBI中进行比对以确定PCR扩增片段的特异性。
3、检测试验
(1)PCR特异性试验
利用建立的PCR方法分别扩增PCV2、JEV、CSFV、ASFV、PRRSV、PRV和PPV，并以PCV3阳性质粒和ddH2O依次作为阳性和阴性对照，检测该PCR方法的特异性。
(2)PCR敏感性试验
测定PCV3阳性质粒的浓度，并依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取1μL作为PCR反应模板，进行PCR扩增，测定最低检出浓度，评估该PCR方法的敏感性。
(3)临床样品PCR检测
利用建立的PCR方法对2017-2018年收集的田间样品预混407份进行回顾性检测，分析不同地区样品中的PCV3的感染情况。
二、结果与分析
1、PCR阳性质粒的制备结果
以引物P833和P834对重组质粒进行PCR扩增，在500bp条带以下得到预期大小片段457bp，如图1所示。经测序，测序结果与NCBI公布的登录号KY778777.1同源性为100％，说明构建的PCV3阳性质粒正确。
2、PCR反应的建立及条件优化结果
经条件优化，确定最优反应体系为20.0μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1.0μL，MyLab 2XPCR TaqMix 10μL，加无菌dd H2O补足至20μL；最优反应条件：95℃预变性5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s，进行40个循环；72℃延伸10min。
3、PCR特异性试验结果
利用建立的最优PCR反应条件，对PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2、CSFV、ASFV进行扩增，结果如图2所示。结果表明，建立的PCR方法只能扩增出PCV3样品中的特异性目的片段，而对PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2、CSFV、ASFV均扩增不出目的片段，表明该PCR方法特异性较好。
4、PCR敏感性试验结果
利用建立的最优PCR反应条件，对不同稀释度的PCV3阳性质粒进行PCR扩增，结果如图3所示。结果表明可检测到的最低质粒浓度为100copies/μL，说明该方法具有较好的敏感性。
5、田间样品检测结果
利用建立的PCR方法对来自2017-2018年中国6大地理区域中的11个省份不同规模化猪场共1402份血清样品进行检测，结果如表1所示，显示407份预混样品中检出120份阳性，阳性率为29.48％。
表1 2017-2018各地区田间样品PCR检测结果统计表
Figure BDA0002324053630000061
三、结论
本发明参考PCV3基因序列设计并筛选了一对特异性引物，在500bp条带以下得到预期大小片段457bp，较短的扩增片段(300bp～500bp)有利于提高PCR扩增的灵敏性，进而极大提高了临床检测效率。同时经过对PCR反应程序及条件的反复优化，结果显示PCV3 PCR检测方法对标准品质粒检度为100copies/μL，且与8种常见的猪源病原均无交叉反应。基于以上试验结果，表明本发明建立的PCR方法具有良好的特异性和敏感性。因此本发明建立的PCR检测方法具有一定临床应用价值，为PCV3的检测和及其疾病的诊断提供了参考。应用本研究所建立的PCR检测方法对2017-2018年田间样品进行检测，结果显示407份预混样品中PCV3阳性率为29.48％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)引物设计与合成
对PCV3全基因组序列进行多序列比对找出高度保守序列，根据高度保守基因序列设计特异性引物P833和P834，所述引物P833为上游引物，P834为下游引物，所述引物的基因序列如下：
P833：5'-CCGGGACATAAATGCTCCAAAG-3'，
P834：5'-AAGAAATACTCCACCATGAACGTCA-3'；
(2)样品处理及核酸提取
采集猪血清样品若干份，以3～5管各一定体积的血清样品为一组进行混合，得到预混血清样品，预混处理后，使用核酸提取试剂盒提取预混血清样品的核酸样品；
(3)PCV3阳性质粒的制备
以PCV3全基因组序列为目的序列，与pUC57载体进行重组质粒的构建；
(4)PCR扩增反应
以P833和P834为引物对构建的重组质粒进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为20.0μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板1.0μL，MyLab 2XPCR TaqMix 10μL，加无菌dd H2O补足至20μL；反应条件：95℃预变性5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，40s，进行40个循环；72℃延伸10min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的片段，测序并分析特异性。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型的PCR检测方法，其特征在于，所述扩增后的目的片段大小为457bp。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176104A (zh) * 2020-10-09 2021-01-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪圆环病毒3型的可视化lamp检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287350A (zh) * 2017-06-27 2017-10-24 广东温氏食品集团股份有限公司 一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法
CN107338330A (zh) * 2017-08-03 2017-11-10 华南农业大学 检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量pcr引物、试剂盒和检测方法
CN107828916A (zh) * 2017-11-30 2018-03-23 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪圆环病毒3型的引物、pcr试剂盒及应用
CN107937619A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 江苏省农业科学院 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287350A (zh) * 2017-06-27 2017-10-24 广东温氏食品集团股份有限公司 一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法
CN107338330A (zh) * 2017-08-03 2017-11-10 华南农业大学 检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量pcr引物、试剂盒和检测方法
CN107828916A (zh) * 2017-11-30 2018-03-23 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪圆环病毒3型的引物、pcr试剂盒及应用
CN107937619A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 江苏省农业科学院 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANCHANG WANG ET AL.: "Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detection of porcine circovirus 3", 《J VIROL METHODS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176104A (zh) * 2020-10-09 2021-01-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪圆环病毒3型的可视化lamp检测试剂盒

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