CN113122655A - 非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法。本发明选择目前中国流行的ASFV重要毒力相关因子EP402R基因(CD2v)基因为靶标，构建了阳性质粒标准品并设计了检测非洲猪瘟病毒EP402R基因的实时荧光定量PCR引物和探针，在此基础上，本发明进一步建立了非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法。本发明所建立的非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，与已有的经典检测方法符合率高，不仅丰富了ASFV现有检测靶标，在ASFV疫苗毒与野毒的检测上也有重要的应用前景。

Description

非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法，尤其涉及非洲猪瘟病毒的检测靶标、荧光定量PCR检测引物以及由此建立的非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法，属于非洲猪瘟病毒的检测或诊断领域。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染引起猪的一种高度接触性、广泛出血性烈性传染病，死亡率高达100％。19世纪20年代首次在非洲肯尼亚暴发，经过近100年的时间从非洲途经欧洲传至亚洲。2018年8月中国辽宁发生首起ASF疫情，随后迅速蔓延至全国各地，给中国养猪及相关行业造成了无法预估的经济损失。目前，已有10个亚洲国家暴发ASF。由于缺乏安全有效的疫苗，以及全球频繁的贸易往来和人员流动，使得ASF的防控和根除异常艰难。因此，急需研发具有良好保护性和安全性的疫苗来预防该病。荧光定量PCR检测方法对于实验室早期确诊ASF具有十分重要作用。

ASFV为非洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，也是唯一已知的DNA虫媒病毒，可以通过直接接触受感染的猪及其产品或通过钝缘蜱属软蜱传播。ASFV主要感染肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)和单核细胞(Monocytes)。ASFV基因组为双链闭合线性DNA分子，不同分离株的基因组大小在170-194kb之间变化，含有151–167个开放阅读框(Open reading frames，ORF)(MAZUR-PANASIUKN,

G,NIEMCZUK K.The first complete genomic sequences ofAfrican swine fever virus isolated in Poland.Scientific Reports,2019,9(1):4556.)，可编码多种结构蛋白和非结构蛋白。其中CD2v基因(EP402R基因)是ASFV重要的囊膜蛋白，可能在病毒入侵或细胞间传播起作用。CD2v的胞质尾部含有数目可变的富含脯氨酸的重复序列，可与宿主蛋白SH3P7结合。SH3P7与囊泡运输相关，这表明CD2v蛋白可能在调节囊泡运输中发挥作用(Kay-Jackson PC,Goatley LC,Cox L,Miskin JE,Parkhouse RM,Wienands J,Dixon LK.The CD2v protein of African swine fever virus interactswith the actin-binding adaptor protein SH3P7.J Gen Virol.2004,85(1):119-30.)。CD2v也可增强ASFV在软蜱中的复制。研究表明，不同基因型ASFV缺失CD2v后其致弱与免疫保护效果有较大的差异(王涛,孙元,罗玉子,仇华吉.非洲猪瘟防控及疫苗研发:挑战与对策.生物工程学报,2018,34(12):1931-1942.)。国内相关研究也已证实，不同基因型的ASFV缺失CD2v后致弱效果差异较大：ASFV BA71株(基因Ⅰ型)缺失CD2v后可以完全致弱，免疫后具有完全交叉保护效果，然而Malawi LiL-20/1(基因Ⅷ型)缺失CD2v未能致弱ASFV，而国内流行毒株(基因Ⅱ型)后免疫猪只存活率为0-50％不等(张艳艳,周鑫韬,齐宇,缪发明,王立冬,米立娟,杨金梅,张静远,张守峰,杨金金,王述超,蒋依倩,陈腾,扈荣良.非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗构建和免疫保护特性研究,中国兽医学报,2019,1-5.步志高,陈伟业,赵东明,何希君,刘任强,柳金雄.基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用:CN110093324A[P].2019-04-26.ARIAS M,DE LA TORRE A,DIXON L,GALLARDO C,JORI F,LADDOMADA A,MARTINS C,PARKHOUSE RM,REVILLA Y,RODRIGUEZ FAJ；SANCHEZ-VIZCAINO.Approaches and perspectives for development of African swine fevervirus vaccines.Vaccines(Basel),2017,5(4):35.)因此关于CD2v的功能十分有必要进一步研究。

ASF对养猪业危害严重，且无安全有效疫苗及治疗药物可用，因此亟需开展综合防控技术及疫苗研发。现阶段，ASF的防控只能依靠加强生物安全措施、早期检测和严格的扑杀。由于ASF的临床症状与多种病毒及细菌性疾病感染极为相似。因此其确诊必须借助实验室检测。针对ASF的检测技术主要有间接免疫荧光试验、红细胞吸附试验、病毒分离、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR等。

实时荧光定量PCR具有极高的灵敏性和特异性，广泛应用于包括ASFV在内的多种病原检测。目前，ASF的PCR及荧光定量PCR检测主要是针对ASFV B646L(p72)基因，诊断靶标相对单一。

建立一种针对ASFV的新的检测靶标基因的ASFV荧光定量PCR检测方法对于早期检测防控该病，深入研究ASFV致病机制以及将来疫苗株与野毒感染的鉴别诊断都至关重要。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种诊断或检测ASFV的新的检测靶标基因；

本发明的目的之二提供用于荧光定量PCR检测ASFV的阳性质粒标准品；

本发明目的之三是提供扩增所述检测靶标基因的PCR引物；

本发明的目的之四是针对ASFV的新的检测靶标基因，建立一种针对新的检测靶标基因的ASFV荧光定量PCR检测方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明选择目前中国流行的ASFV重要毒力相关因子EP402R基因(CD2v基因)为靶标，构建了阳性质粒标准品并设计了荧光定量PCR检测引物，最终建立了ASFV MGF360-13LTaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的阳性质粒标准品，包括骨架载体和检测靶标基因，其中，所述的检测靶标基因是非洲猪瘟病毒EP402R基因(CD2v基因)基因；作为一种参考，所述的骨架载体可以是pOK12载体。

本发明还提供了一种扩增非洲猪瘟病毒EP402R基因(CD2v基因)的PCR引物，由SEQID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。

本发明进一步提供了用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成的定量PCR引物和SEQ ID NO.5所示的探针序列；其中，SEQ ID NO.5所示的探针的5'端连有FAM荧光集团，其3'端连有TAMRA淬灭集团。

本发明建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法可实现对最低16拷贝/μL ASFV核酸的检测，灵敏性高；同时，与CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV-1和PCV-2等多种病原不存在交叉反应，特异性强。本发明方法相比常规PCR检测方法在敏感性上高出3个数量级，与广泛应用的针对ASFV p72基因的荧光定量检测方法相比，具有较高的符合率，因此也可应用本发明建立的检测方法对可疑样品进行二次确认。除p72基因外，目前已建立的ASF荧光定量检测靶标仅有早期基因E184L、K205R基因和CP530R基因等，相对较少，本发明不仅丰富了ASFV现有检测靶标，也能够区分CD2v基因缺失ASFV疫苗株感染与野毒感染；本发明也将为后续CD2v基因功能探索以及缺失病毒纯度鉴定等提供技术支持。

本发明选择目前中国流行的ASFV重要毒力相关因子CD2v基因为靶标，建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法，本发明检测方法方法特异性强、灵敏度高、重复性好，与已有的经典检测方法符合率高，不仅丰富了ASFV现有检测靶标，也有较好的应用前景。

附图说明

图1目的基因扩增；M：DL 2000bp分子量标准M:DL2000 DNA Marker；1：CD2v基因CD2v Gene；2：阴性对照。

图2ASFV CD2v基因标准曲线。

图3ASFV CD2v基因与相关病毒基因扩增曲线。

图4ASFV CD2v基因的扩增曲线；A-H：质粒标准品1.6×10⁸-1.6×10¹拷贝/μL。

图5PCR琼脂糖凝胶电泳图；M:2000bp分子量标准M：DL2000DNA Marker；1-10：质粒标准品1.6×10¹⁰-1.6×10¹拷贝/μL；11：阴性对照；12：阳性对照。

图6ASFV疫苗毒与野毒感染PAM细胞检测扩增曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1非洲猪瘟病毒EP402R基因(CD2v基因)TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及验证

1材料与方法

1.1病毒与细胞

ASFV核酸由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队(本实验室)提取并保存；ASFV/LN-18由本发明人实验室分离鉴定保存，ASFV CD2v基因缺失疫苗毒(ASFV/LN-18-ΔCD2v)由本发明人实验室构建及鉴定；无特定病原体(SPF)猪肺泡巨噬细胞(PAM)由本发明人实验室分离并保存；猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒1型(PCV-1)和猪圆环病毒2型(PCV-2)核酸由本发明人实验室保存。

1.2主要仪器与试剂

DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep^TM Body Fluid viral DNA/RNA提取试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司；Premix PrimeSTAR HS、Premix Ex Taq^TM荧光定量试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；DH5α感受态、pOK12载体、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。荧光定量PCR仪(QuantStudio3&5)购自美国Thermo公司；紫外凝胶成像仪(AlphaImager HP)购自美国ProteinSimple公司；超微量分光光度计

购自德国Implen公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit一步同源重组试剂盒购自Vazyme公司。Antibiotic-Antimycotic和RPMI 1640含L-谷氨酰胺培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3引物和探针

根据GenBank中收录的ASFV全基因组(登录号：MK128995.1)，选择CD2v基因序列设计扩增引物：

CD2v-F：5'-ggtacccgggagctcgaattcTTTAAGTATTGATTATTGGGTT-3'(SEQ IDNO.1)；

CD2v-R：5'-gtctgcagaagcttcgaattcTGTATTATACTGATAACGACT-3'(小写为左右同源臂序列)(SEQ ID NO.2)；

扩增片段大小811bp；Real-Time PCR引物信息如下：

F：5'-ACCACCTGAATCTAATGAA-3'(SEQ ID NO.3)，

R：5'-GACTGTAAGGCTTAGGAA-3'(SEQ ID NO.4)，片段大小101bp；

双标探针信息如下：5'-(FAM)TGACACCACTTCCATACATGAACCA(TAMRA)-3'(SEQ IDNO.5)；以上引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成与验证。

1.4阳性质粒标准品的构建

以本实验室保存的ASFV核酸为模板，利用引物扩增CD2v基因，反应体系为50μL：Premis Prime STAR HS 25μL、ddH₂O 21μL、上、下游引物各1μL、模板2μL；反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min；将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；回收目的条带，利用限制性核酸内切酶EcoRI切割pOK12载体，利用一步同源重组试剂盒将目的基因连接至pOK12载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单菌落提质粒并进行测序验证。

1.5荧光定量PCR标准曲线的建立及其特异性和敏感性验证

采用超微量分光光度计测定标准品浓度，根据公式：(6.02×10²³拷贝/mol)×DNA量(g)/[DNA长度(碱基数)×660g/(mol·碱基)]＝拷贝数，计算标准品拷贝数。将标准品连续10倍梯度稀释至10^-10，并将其作为模板按照如下条件进行荧光定量PCR检测，反应体系为25μL：Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL、ddH₂O 8.25μL、上、下游引物各0.5μL、探针1.0μL、模板2μL、ROX 0.25μL；反应条件为：预变性95℃30s，变性95℃5s，退火55℃10s，延伸72℃20s，其他条件跟随仪器自设系统，40个循环，设置三个阴性对照孔。

另取CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV-1、PCV-2和ASFV的核酸按已优化的方法同时进行TaqMan荧光定量PCR检测，以评价其特异性。此外，将构建的质粒标准品梯度稀释后，利用引物进行常规PCR扩增，然后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以比较所建立的ASFV CD2v基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性。

1.6临床样品检测

对发生ASF猪场采集的30份样品，每份取200μL按照AxyPrep^TMBody Fluid ViralDNA/RNA提取试剂盒说明书操作提取DNA。利用本实验室先前发表的方法(LUO Y,ATIM SA,SHAO L,AYEBAZIBWE C,SUN Y,LIU Y,JI S,MENG X Y,LI S,LI Y,MASEMBE C,

K,

F,LIU L,QIU H J.Development of an updated PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus.Archives of Virology,2017,162(1):191-199.)及本次建立的方法同时进行检测，利用SPSS 13.0软件进行一致性和配对卡方检验，比较两种检测方法结果之间的符合率。

1.7ASFV疫苗毒与野毒的鉴别诊断

PAM细胞使用含2％双抗和10％胎牛血清的RPMI 1640含L-谷氨酰胺培养基进行培养，以1MOI的ASFV与ASFV/LN-18-ΔCD2v接种，48h收取野毒和CD2v基因缺失疫苗毒感染和未感染ASFV的PAM细胞上清，每个样品进行3次重复，提取DNA，利用本发明建立的检测方法进行检测。

2试验结果

2.1标准品的制备

以本发明人实验室保存的ASFV核酸为模板，利用引物进行PCR扩增，可以得到一条大小为811bp的目的条带，如图1所示。利用一步克隆试剂盒将目的片段克隆至pOK12载体上，构建CD2v基因标准品，经测序验证后，提取标准品质粒并测得浓度为516ng/μL，经计算每微升拷贝数为1.6×10¹¹。

2.2ASFV CD2v基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

2.2.1标准曲线的建立

对1.6×10¹-1.6×10⁸拷贝/μL质粒标准品进行荧光定量PCR检测，以Ct值为纵坐标，CD2v基因标准品拷贝数为横坐标，利用QuantStudio^TM Design&Analysis Softwarev1.4.3分析软件绘制其标准曲线(图2)。建立的ASFV CD2v荧光定量PCR线性回归方程为：y＝-3.241x+43.259，R²为0.998，扩增效率为103.4％，最低可检测到16拷贝/μL的病毒核酸。

2.2.2ASFV CD2v基因荧光定量PCR的特异性

对CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV-1、PCV-2和ASFV的核酸(cDNA/DNA)以本研究建立的TaqMan荧光定量PCR进行检测，除ASFV的DNA对应孔外，其余病毒核酸对应孔均未出现扩增曲线(图3)。结果表明，本发明建立的ASFV CD2v基因TaqMan荧光定量PCR检测方法扩增效果良好，特异性强。

2.2.3ASFV CD2v基因荧光定量PCR的重复性

将构建的质粒标准品10倍梯度稀释至1.6×10¹拷贝/μL，取1.6×10⁸-1.6×10¹拷贝/μL共8个梯度的质粒标准品，按照相同的条件进行扩增；经计算组内变异系数(CV)小于0.56％，组间变异系数(CV)小于0.82％，并且最低出现扩增曲线的稀释度为1.6×10¹，结果表明本发明构建的检测方法具有良好的重复性(图4)。

2.2.4ASFV CD2v基因荧光定量PCR的敏感性

将10倍梯度稀释的标准品，进行常规PCR扩增，并将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，反应条件和体系参照1.4。结果表明，常规PCR最低能够检测到1.6×10⁴拷贝/μL的病毒核酸(图5)。本发明建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法相比常规PCR检测方法在敏感性上高出3个数量级。

2.3临床样品检测及符合率比较

在30份临床样品的检测中，本发明人实验室建立的针对ASFV p72基因检出阳性样品16个，检出率为53.3％；本发明建立的针对ASFV CD2v检出阳性样品14个，未出现假阳性，检出率为46.7％，McNemer检验的结果，P＝0.5>0.05，表明两种检测方法结果无统计学差异；Kappa检验的结果，Kappa＝0.867>0.75，P<0.001，提示两种检测方法结果符合率较好。

2.4ASFV疫苗毒与野毒的检测结果

利用本发明构建的检测方法检测感染ASFV/LN-18的PAM细胞上清CT值平均为24.1，未感染和感染ASFV/LN-18-ΔMGF的PAM细胞上清无CT值。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

<120> 非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法

<130> HLJ-2001-191110A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

ggtacccggg agctcgaatt ctttaagtat tgattattgg gtt 43

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

gtctgcagaa gcttcgaatt ctgtattata ctgataacga ct 42

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

accacctgaa tctaatgaa 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

gactgtaagg cttaggaa 18

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

tgacaccact tccatacatg aacca 25

Claims (10)

1.非洲猪瘟病毒EP402R基因作为检测靶标基因在制备检测或诊断非洲猪瘟病毒试剂中的用途。

2.一种用于检测非洲猪瘟病毒的阳性质粒标准品，包括骨架载体和检测靶标基因，其特征在于，所述的检测靶标基因是非洲猪瘟病毒EP402R基因。

3.权利要求2所述的阳性质粒标准品在制备检测非洲猪瘟病毒试剂中的应用。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用包括采用所述的阳性质粒标准品构建检测非洲猪瘟病毒EP402R基因的荧光定量PCR标准曲线。

5.一种扩增非洲猪瘟病毒EP402R基因的PCR引物，其特征在于：由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。

6.用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成的定量PCR引物和SEQ ID NO.5所示的探针序列。

7.按照权利要求6所述的用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物，其特征在于，SEQ ID NO.5所示的探针的5'端连有FAM荧光集团，其3'端连有TAMRA淬灭集团。

8.一种检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，包括：阳性质粒标准品、定量PCR引物和探针序列；其特征在于：所述定量PCR引物为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

9.按照权利要求8所述的检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.5所示的探针的5'端连有FAM荧光集团，其3'端连有TAMRA淬灭集团。

10.按照权利要求8所述的检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒标准品包括骨架载体和检测靶标基因，其中，所述的检测靶标基因是非洲猪瘟病毒EP402R基因。

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