CN116426620A - 检测禽流感三价dna疫苗中单个质粒含量的引物和探针组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测禽流感三价DNA疫苗中单个质粒含量的引物和探针组合及试剂盒，包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.6所示核苷酸序列的引物及SEQ ID No.7~SEQ ID No.9所示核苷酸序列的TaqMan探针。本发明建立的定量测定和区分禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗（pH5‑FJ（H5‑Re13）株+pH5‑SX（H5‑Re14）株+pH7‑YN（H7‑Re4）株）中pH5‑FJ（H5‑Re13）株、pH5‑SX（H5‑Re14）株和pH7‑YN（H7‑Re4）株各组份含量的TaqMan荧光定量PCR方法重复性好，准确性高，对于检测禽流感DNA三价苗中各个质粒的含量监控具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于TaqMan荧光定量PCR检测禽流感三价DNA疫苗中单个质粒含量的引物和探针的组合及试剂盒。
背景技术
近年来，H5亚型和H7亚型高致病性禽流感病毒（Highly Pathogenic AvianInfluenza Virus，HPAIV）给一些国家的家禽养殖业、甚至是整个国民经济都造成了巨大的损失。H5亚型和H7亚型AI的爆发同样对公共卫生安全构成了严重的威胁。
DNA疫苗的生物安全性较高，且具有制备简单、易于构建成联合疫苗和多价疫苗等优点，是目前具有良好应用前景的一种防控HPAIV的基因工程疫苗，能够快速应对病毒变异。针对当前主要流行的H5亚型2.3.4.4h分支禽流感病毒、2.3.4.4b分支禽流感病毒和H7N9禽流感病毒，CN 114524862 A公开了禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗（pH5-FJ（H5-Re13）株+pH5-SX（H5-Re14）株+pH7-YN（H7-Re4）株）（简称禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗），实验结果表明三价DNA疫苗具有良好的免疫效力，能对当前流行的禽流感病毒的致死性攻击提供完全的免疫保护。三价DNA疫苗是三种质粒pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株等量混合而成，成品质量检验需要测定三种组份的含量，常规的（超）微量分光光度计检测方法只能测定出总的含量，无法区分和测定出三种组份的含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：为了更好的对禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗进行质量控制，测定禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗（pH5-FJ（H5-Re13）株+pH5-SX（H5-Re14）株+pH7-YN（H7-Re4）株）中pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株各组份的含量，我们建立了能定量测定和区分禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗（pH5-FJ（H5-Re13）株+pH5-SX（H5-Re14）株+pH7-YN（H7-Re4）株）中pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株各组份含量的TaqMan荧光定量PCR方法。
本发明的技术方案为：一种基于TaqMan荧光定量PCR检测禽流感三价DNA疫苗中单个质粒含量的引物和探针组合，包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.6所示核苷酸序列的引物及SEQ ID No.7~SEQ ID No.9所示核苷酸序列的TaqMan探针。
进一步地，所述TaqMan探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1或MGB。
一种检测试剂盒，含有上述所述的引物和探针组合。
进一步地，还包括pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株三种质粒的标准品。用去内毒素质粒提取试剂盒分别提取pH5-FJ（H5-Re13）、pH5-SX（H5-Re14）、pH7-YN（H7-Re4）质粒（三种质粒的制备方法已经在CN 114524862 A 中公开），然后通过超微量分光光度计定量，分别每管分装1µg，真空干燥，制成三种质粒的标准品。
一种基于TaqMan荧光定量PCR检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗中单个质粒含量的方法，包括如下步骤：
（1）以pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株三种质粒的标准品为模板，以上述所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR，建立标准曲线；
（2）取待检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品或其稀释后的使用液作为模板，以上述所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR；
（3）对比各个质粒的标准曲线，计算出禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗中各个质粒的拷贝数。
进一步地，所述荧光定量PCR的体系为：
RT-PCR酶 10µl，
无RNA酶H2O 7µl，
10pmol上游引物 0.4µl，
10pmol下游引物 0.4µl，
10pmol探针 0.2µl，
模板 2µl。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应程序为：37℃污染消化2分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性10秒，60℃退火30秒，共30个循环，在每一退火步骤结束时收集FAM荧光信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明建立的定量测定和区分禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗（pH5-FJ（H5-Re13）株+pH5-SX（H5-Re14）株+pH7-YN（H7-Re4）株）中pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株各组份含量的TaqMan荧光定量PCR方法重复性好，准确性高，对于检测禽流感DNA三价苗中各个质粒的含量监控具有重要的现实意义。
附图说明
图1不同稀释度标准品的检验结果，扩增曲线最左侧是100稀释度，从左至右是10倍稀释度扩增曲线；引物FJ F2-Forward、FJ R2-Reverse、探针FJ P2-Probe，pH5-FJ（H5-Re13）株作为DNA模板。
图2不同稀释度标准品的检验结果，扩增曲线最左侧是100稀释度，从左至右是10倍稀释度扩增曲线；引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe，pH5-SX（H5-Re14）株作为DNA模板。
图3不同稀释度标准品的检验结果，扩增曲线最左侧是100稀释度，从左至右是10倍稀释度扩增曲线；引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe，pH7-YN（H7-Re4）株作为DNA模板。
图4 标准品的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度；引物FJ F2-Forward、FJ R2-Reverse、探针FJ P2-Probe，pH5-FJ（H5-Re13）株作为DNA模板。
图5 标准品的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度；引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe，pH5-SX（H5-Re14）株作为DNA模板。
图6 标准品的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度；引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe，pH7-YN（H7-Re4）株作为DNA模板。
图7 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果；引物FJ F2-Forward、FJ R2 –Reverse、探针FJ P2-Probe。
图8 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果；引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe。
图9 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果；引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
图10 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗使用液含量时的Ct值检验结果；引物FJ F2-Forward、FJ R2 –Reverse、探针FJ P2-Probe。
图11 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗使用液含量时的Ct值检验结果；引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe。
图12 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗使用液含量时的Ct值检验结果；引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
图13 第一次重复性检测时的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度，引物FJ F2-Forward、FJ R2 –Reverse、探针FJ P2-Probe。
图14 第一次重复性检测时的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度，引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe。
图15 第一次重复性检测时的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度，引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
图16 第一次荧光定量PCR方法检测不同批次的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果，引物FJ F2-Forward、FJ R2 –Reverse、探针FJ P2-Probe。
图17 第一次荧光定量PCR方法检测不同批次的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果，引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe。
图18 第一次荧光定量PCR方法检测不同批次的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果，引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
图19 第二次重复性检测时的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度，引物FJ F2-Forward、FJ R2 –Reverse、探针FJ P2-Probe。
图20 第二次重复性检测时的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度，引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe。
图21 第二次重复性检测时的标准曲线，从左至右5个点依次是100~10-4稀释度，引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
图22 第一次荧光定量PCR方法检测不同批次的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果，引物FJ F2-Forward、FJ R2 –Reverse、探针FJ P2-Probe。
图23 第一次荧光定量PCR方法检测不同批次的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果，引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe。
图24 第一次荧光定量PCR方法检测不同批次的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品含量时的Ct值检验结果，引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1 TaqMan荧光定量PCR引物和探针的设计
将pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株的opti-FJHA5、opti-SXHA5和opti-YNHA7 HA基因，用DNAStar生物软件进行同源性分析比较，找出三个HA基因序列特有的序列差异区域，用Primer Express 3.0软件针对有鉴别意义的差异序列片段设计引物和TaqMan探针探针在5’末端标记FAM，在3’端标记有BHQ1或MGB淬灭基团，如表1所示。
表1引物及探针序列
实施例2 标准曲线的建立
用去内毒素质粒提取试剂盒分别提取pH5-FJ（H5-Re13）、pH5-SX（H5-Re14）、pH7-YN（H7-Re4）质粒（三种质粒的制备方法已经在CN 114524862 A 中公开），然后通过超微量分光光度计定量，分别每管分装1µg，真空干燥，制成标准品，使用时加入100µl ddH2O溶解（10ng/µl）。
将三个质粒标准品，按照10倍梯度依次稀释，100~10-4梯度稀释后作为待测样本，用筛选出的引物探针扩增，绘制每个质粒的标准曲线。
荧光定量PCR的体系为：
RT-PCR酶 10µl，
无RNA酶H2O 7µl，
10pmol上游引物 0.4µl，
10pmol下游引物 0.4µl，
10pmol探针 0.2µl，
模板 2µl。
荧光定量PCR的反应程序为：37℃污染消化2分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性10秒，60℃退火30秒，共30个循环，在每一退火步骤结束时收集FAM荧光信号。
拷贝数为1.4×109拷贝/µl的质粒进行10倍梯度稀释后，取100~10-4稀释度进行检测，结果显示存在良好的线性相关，三个质粒斜率slope分别为-3.5188、-4.0588、-3.0335，相关系数R2分别为0.9992、0.9993、0.9956（见表2、图1~图6）。标准曲线重复性试验证明制备的标准品较为稳定，3次同条件扩增时Ct值均有较好的重现性，且变异系数小于10%（见表3），由此可见本检测方法的标准曲线制备重复性好，稳定性高。
表2 不同稀释度标准品的Ct值检验结果
表3 不同稀释度标准品重复性检测的Ct值及变异系数
A:引物FJ F2-Forward、FJ R2-Reverse、探针FJ P2-Probe； B:引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe；C:引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
实施例3 TaqMan荧光定量PCR方法对不同含量的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗样品的检测
取2021001批次禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗（pH5-FJ（H5-Re13）株+pH5-SX（H5-Re14）株+pH7-YN（H7-Re4）株）成品及其稀释后的使用液作为样品，分别稀释到10-2检测其Ct值，对比各个质粒的标准曲线，计算不同含量的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗中各个质粒的拷贝数，拷贝数计算公式为：(6.02×1023) × (ng/ul×10-9 ) / (DNA length ×660) =copies/ul；结果表明，根据检测出的质粒的拷贝数计算的质粒含量与禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗配制时各个质粒的含量相近，结果如表4、表5、表6、图6~图12。
表4 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗含量时的Ct值结果
A:引物FJ F2-Forward、FJ R2-Reverse、探针FJ P2-Probe； B:引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe；C:引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
表5 荧光定量PCR方法检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗含量时的拷贝数计算结果
A:引物FJ F2-Forward、FJ R2-Reverse、探针FJ P2-Probe； B:引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe；C:引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
表6 禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗样品中各质粒的含量结果
A:引物FJ F2-Forward、FJ R2 -Reverse、探针FJ P2-Probe； B:引物SX F1-Forward、SX R1-Reverse、探针SX P1-probe；C:引物YN F1-Forward、YN R2-Reverse、探针YN P2-probe。
实施例4 TaqMan荧光定量PCR方法的重复性试验结果
对三个批次的禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品进行TaqMan荧光定量PCR检测，将疫苗样品稀释到10-2，每个批次做5个重复，分别由3个不同的操作人员在不同仪器上进行，进行不同的三次重复性试验，荧光定量PCR检测其Ct值，对比各个质粒的标准曲线，计算出成品疫苗中各个质粒的拷贝数以及含量，同时计算出批间和批内的变异系数。结果，三次重复性试验中，批间和批内的变异系数均在15%之内，结果表明，我们建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法重复性良好。
在重复性检测的基础上，确定禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗（pH5-FJ（H5-Re13）株+pH5-SX（H5-Re14）株+pH7-YN（H7-Re4）株）中，pH5-FJ（H5-Re13）株每毫升含量应在0.354±0.069mg范围内，pH5-SX（H5-Re14）株每毫升含量应在0.355±0.061mg范围内，pH7-YN（H7-Re4）株每毫升含量应在0.335±0.090mg范围内。
4.1 第一次重复性试验的结果
第一次重复性试验由操作人员1进行，检测结果表明批间变异系数在11%以内，批内变异系数均在12%之内，结果见表7、表8、表9和图13~图18。
表7 荧光定量PCR法检测疫苗成品中各质粒含量时的Ct值结果
表8 荧光定量PCR法检测疫苗成品中各质粒含量时的拷贝数计算结果（108拷贝/µl）
表9 不同批次疫苗成品中各质粒的含量（ng/µl）以及变异系数
4.2 第二次重复性试验的结果
第二次重复性试验由操作人员2进行，PCR仪是相同型号的另一台仪器，检测结果表明批间变异系数在12%以内，批内变异系数在14%之内，结果见表10、表11、表12和图19~图24。
表10 荧光定量PCR法检测疫苗成品中各质粒含量时的Ct值结果
表11 荧光定量PCR法检测疫苗成品中各质粒含量时的拷贝数计算结果（108拷贝/µl）
表12 不同批次疫苗成品中各质粒的含量（ng/µl）以及变异系数
4.3 第三次重复性试验的结果
第三次重复性试验由操作人员3进行，PCR仪是第一次重复性试验用的同一台仪器，检测结果表明批间变异系数在9%以内，批内变异系数在11%之内，结果见表13、表14、表15。
表13 荧光定量PCR法检测疫苗成品中各质粒含量时的Ct值结果
表14 荧光定量PCR法检测疫苗成品中各质粒含量时的拷贝数计算结果（108拷贝/µl）
表15 不同批次疫苗成品中各质粒的含量（ng/µl）以及变异系数
Claims (7)
1.一种基于TaqMan荧光定量PCR检测禽流感三价DNA疫苗中单个质粒含量的引物和探针组合，其特征在于，包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.6所示核苷酸序列的引物及SEQ IDNo.7~SEQ ID No.9所示核苷酸序列的TaqMan探针。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述TaqMan探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1或MGB。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株三种质粒的标准品。
5.一种基于TaqMan荧光定量PCR检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗中单个质粒含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株三种质粒的标准品为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR，建立标准曲线；
（2）取待检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品或其稀释后的使用液作为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR；
（3）对比各个质粒的标准曲线，计算出禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗中各个质粒的拷贝数。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的体系为：
RT-PCR酶 10µl，
无RNA酶H2O 7µl，
10pmol上游引物 0.4µl，
10pmol下游引物 0.4µl，
10pmol探针 0.2µl，
模板 2µl。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：37℃污染消化2分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性10秒，60℃退火30秒，共30个循环，在每一退火步骤结束时收集FAM荧光信号。
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2023
- 2023-06-05 CN CN202310653944.8A patent/CN116426620A/zh active Pending
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