CN110735003A - 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法，其中通用引物包括用以扩增真菌rDNA的上游引物和下游引物，上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种。实验表明，利用本发明的引物组检测待测细胞制品样本时，极大提高了真菌检测的通用性；同时也可避免检测目的片段与细胞制品中含有的人基因组序列的同源性，为细胞产品早期的检测提供了快速准确的方法。本发明的检测方法操作简单，无需复杂的核酸提取过程，只需将细胞制品中污染的真菌通过短暂离心富集后用裂解液裂解即可作为模板进行定量PCR检测，能够在3小时内完成细胞制品中常见真菌的检测。

Description

细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
近年来，随着细胞疗法研究的迅速发展，体外的细胞培养已成为细胞治疗过程中的一个重要环节。在细胞培养过程中，细菌、真菌以及支原体等的污染严重影响了细胞生长。按照2015年版《中国药典》的无菌检查法，供试品的无菌检查需要在规定的培养基和适宜的温度下培养14天，在实验过程中需要做好各项实验对照，同时实验要求较为严格，并且在培养过程中每日观察并记录培养的平皿中是否有真菌生长。药典中的检测方法在检测时间上要求的时间较长，待到培养法检测得出结论时，细胞培养过程中也早已能够观察出来。因此，需要一种快速灵敏的方式来检测细胞培养过程中是否存在真菌污染。实时荧光定量PCR技术作为一种新兴的检测手段，其在检测过程中具灵敏度高、重复性好、检测时间短等优点，已逐渐被应用到病原菌检测中。
真菌基因组中编码核糖体RNA的基因有4种，26S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8SrDNA。26S在结构上分为保守区和高变区，保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异。真菌的26S rDNA具有一定的保守性，保守区序列是大部分真菌所共有的，该段序列用于真菌的检测可以避免和细菌、人的基因发生交叉反应，具有很强的特异性。真菌大亚基上的26S rDNA分子，可分为D1、D2…D12等多个区域，其中D1/D2区域序列长度适中，是目前流行的真菌分子鉴定和系统发生分析标记，同时也可适用于定量PCR的方法对真菌进行检测。
发明内容
针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法，该方法对常见真菌检测通用性强，基于荧光定量PCR技术，在引物设计上避免了扩增的序列在细胞制品自身核酸上的同源性，解决了定量PCR检测中的假阳性问题，提高了检测结果的可靠性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提供一种用于细胞制品中真菌污染检测的通用引物组，包括用以扩增真菌rDNA的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物序列与真菌26SrDNA序列的保守区域互补，所述上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，所述下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种。
进一步地，组成所述引物组的各条引物的单链DNA分子的物质的量相等。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测细胞制品中真菌污染的试剂盒，所述试剂盒包含有上述任一项所述的通用引物组和PCR预混液。
进一步地，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第三个目的是提供上述任一项所述的通用引物，或上述任一项所述的试剂盒在细胞培养液、细胞培养基真菌污染检测中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，包括：
(1)以带有标准序列的质粒为模板进行荧光定量PCR，建立标准曲线，所述标准序列如SEQ ID NO.6所示，所述荧光定量PCR的上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5中的一种或两种；
(2)供试品处理，获得荧光定量PCR供试品模板；
(3)扩增检测：以步骤(2)中的模板为扩增模板进行荧光定量PCR，所述荧光定量PCR的上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种；
(4)荧光定量结果分析：根据供试品的样本基因组DNA中的靶标扩增Ct值来判断供试品中是否存在真菌污染。
进一步地，所述步骤(2)中供试品处理方法为：取细胞制品进行短暂离心富集后，再使用裂解液裂解直接获得供试品模板。
进一步地，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃3min预变性；以95℃10s，58℃10s，72℃30s为一个循环，共40个循环。
进一步地，所述方法中设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为裂解液裂解酵母后的溶液，所述阴性对照为无菌去离子水。
进一步地，所述方法中设置阳性干扰品，所述阳性干扰品为等体积的供试品中添加酵母菌液形成的；所述阳性干扰品处理方法为：取阳性干扰品进行短暂离心富集后，再使用裂解液裂解直接获得阳性干扰品模板。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明的技术方案通过设计通用引物，运用实时荧光定量PCR技术实现了对常见真菌通用检测的目的，有效地解决了以往PCR方法只能用于检测单一真菌的问题，同时也避免了检测目的片段与细胞制品中含有的人基因组序列的同源性，极大提高了真菌检测的通用性，为细胞产品早期的检测提供了快速准确的方法。
(2)本发明的检测方法操作简单，无需复杂的核酸提取过程，只需将细胞制品中污染的真菌通过短暂离心富集后用裂解液裂解后即可作为模板进行定量PCR检测，能够在3小时内完成细胞制品中常见真菌的检测。
附图说明
图1为实施例1中SEQ ID NO.1所示上游引物与参考序列比对结果示意图；
图2为实施例1中SEQ ID NO.2所示上游引物与参考序列比对结果示意图；
图3为实施例1中SEQ ID NO.3所示上游引物与参考序列比对结果示意图；
图4为实施例1中SEQ ID NO.4所示下游引物与参考序列比对结果示意图；
图5为实施例1中SEQ ID NO.5所示下游引物与参考序列比对结果示意图；
图6为实施例2中重组克隆质粒荧光定量PCR扩增曲线；
图7为实施例2中重组克隆质粒荧光定量PCR标准曲线；
图8为实施例2中念珠菌荧光定量PCR扩增曲线；
图9为实施例2中念珠菌荧光定量PCR标准曲线；
图10为实施例2中黑曲霉菌荧光定量PCR扩增曲线；
图11为实施例2中黑曲霉菌荧光定量PCR标准曲线；
图12为实施例2中待测样本的荧光定量PCR检测结果示意图。
图13为实施例3中重组克隆质粒荧光定量PCR扩增曲线；
图14为实施例3中重组克隆质粒荧光定量PCR溶解曲线；
图15为实施例3中重组克隆质粒荧光定量PCR标准曲线；
图16为实施例3中待测样本的荧光定量PCR检测结果示意图。
具体实施方式
下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。
实施例1：用于快速检测细胞制品中真菌污染的荧光PCR引物的获得
一、引物对的设计与合成
本发明的细胞制品真菌快速检测方法中，上下游PCR引物序列是从真菌26S rDNA序列的保守区域中筛选得到的通用引物，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)上获取得到真菌的26S rDNA序列后，用DNAMAN软件对序列进行分析，寻找不同真菌种属间的保守片段，根据引物设计原则，在这些真菌保守区域筛选通用引物，同时利用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析引物在人基因组中的是否能扩增出大小相近的序列来确保引物的可靠性，从中选择最佳引物混合物的组合。引物设计参考序列如表1所示。
表1引物设计参考序列
Figure BDA0002311420690000051
图1－图5为设计的引物与参考物种序列比对分析的结果(箭头标识的位置为引物设计参考区域)，结果显示设计的引物与参考序列在3’端有着较高的同源性，表明引物可用于多种真菌检测分析。
获得的引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司进行引物合成。设计的上下游PCR引物序列如下：
表2引物序列
Figure BDA0002311420690000061
实施例2：SEQ ID NO.1－5所示引物混合物检测真菌污染
1、用于检测细胞制品中真菌污染的荧光PCR引物的特异性检测及灵敏度的确定
本实施例采用标准菌株酵母菌对实施例1得到的5种引物混合物进行最低检测限的确定。标准品序列如SEQ ID NO.6所示。
用实施例1的5种引物扩增标准菌株酵母菌，切胶回收PCR产物，纯化后将目的片段连接到pTOPO克隆载体上，用载体引物M13F对重组的阳性克隆进行测序验证无误后，抽提重组克隆质粒。测定浓度并换算成(拷贝数/体积)，然后进行梯度稀释，稀释到9.7×107拷贝/μl-9.7×10拷贝/μl。在每个浓度下取1μl作为模板进行定量PCR检测实验，每个浓度下做三个重复。
扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为10μl，其中按要求加入梯度稀释的模板1μl，浓度为10μM的5种引物各0.25μl，荧光定量PCR预混液5μl(购买于TaKaRa公司)，无菌去离子水2.75μl补足到10μl。
反应条件：95℃3min预变性；以95℃10s，52℃10s，72℃30s为一个循环，共进行40个循环。40个循环完成后再进行溶解曲线的制作。
检测结果：
表3中质粒拷贝数对应的荧光定量PCR Ct值来自于图6的荧光定量PCR扩增曲线(标注P1-P7的曲线分别为重组克隆质粒稀释到9.7×107拷贝/μl-9.7×10拷贝/μl的样品)，从扩增曲线来看，实验重复性好。
表3质粒拷贝数与荧光定量PCR检测结果对照
标准曲线：y＝-3.7094x+39.598 R2＝0.9986
x：表示Lg(质粒拷贝数) y：表示荧光定量Ct值
从表3中荧光定量Ct值与每微升中目的基因序列拷贝数对应的关系来看，本方法中能够检测到的最低灵敏度是97个拷贝。图7是标准序列不同拷贝数与对应的Ct值数据经处理后得出Lg(质粒拷贝数)与荧光定量PCR Ct值的线性化关系的标准曲线。标准曲线的R2>0.98，表明数据与线性化方程吻合程度高，利用该标准曲线可以定量检测待检测样品中目的基因的浓度，最低检测限约达97个拷贝。
2、用于检测细胞制品中真菌污染的荧光PCR引物灵敏度的确定
本实施例采用标准菌株念珠菌对实施例1得到的5种引物混合物进行最低检测限的确定。
念珠菌梯度稀释：将lml的念珠菌菌液4000rpm离心2min富集菌体，弃上清。加入200μl的无菌水将菌体重悬后，将念珠菌菌液进行10倍梯度稀释，总共稀释八个梯度，各个菌液浓度依次记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。
念珠菌计数：在各个菌液浓度下取200μl菌液涂在YPD固体培养平板上，在30℃培养16h后查看每个浓度下涂板长出的单菌落。
qPCR模板的制备：在各个菌液中取5μl加入到20μl Lysis Buffer forMicroorganism中，在80℃下裂解30min，裂解完成后10000rpm离心2min，取上清液2μl作为模板进行荧光定量PCR，每个浓度下做三个重复。
扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为10μl，其中按要求加入梯度稀释的模板2μl，浓度为10μM的5种引物各0.25μl，荧光定量PCR预混液5μl(购买于TaKaRa公司)，无菌去离子水1.75μl补足到10μl。
反应条件：95℃3min预变性；以95℃10s，52℃10s，72℃30s为一个循环，共进行40个循环。
检测结果：
表4为每个浓度下每1ml中念珠菌的个数，表5为qPCR 2μl模板中念珠菌的个数与qPCR对应的Ct值，表5中Ct值来源于图8的荧光定量PCR扩增曲线。
表4梯度稀释的菌液中对应的细菌数量
Figure BDA0002311420690000081
表5念珠菌数量与荧光定量PCR检测结果对照
Figure BDA0002311420690000092
标准曲线：y＝-3.5263x+35.602 R2＝0.995
x：Lg(2μl模板中菌的数量) y：表示荧光定量Ct值
从表5中荧光定量Ct值与加入到对应反应体系中念珠菌的数量关系来看，本方法中能够检测到的最低灵敏度是1cfu。图9是不同细菌数量与对应的Ct值数据经处理后得出Lg(细菌数)与荧光定量PCR Ct值的线性化关系的标准曲线。标准曲线的R2>0.98，表明数据与线性化方程吻合程度高，利用该标准曲线可以定量检测待检测样品中念珠菌的浓度，最低检测限约达1cfu。
3、用于检测细胞制品中真菌污染的荧光PCR引物灵敏度的确定
本实施例采用标准菌株黑曲霉菌对实施例1得到的5种引物混合物进行最低检测限的确定。
将黑曲霉接种到TSA培养基上在30℃培养5天，将菌体从平板上刮下来以后用真菌DNA提取试剂盒(购买于北京索莱宝科技有限公司)提取黑曲霉DNA。测定DNA浓度后，将黑曲霉DNA进行10倍梯度稀释。在每个浓度下取1μl作为模板进行定量PCR检测实验，每个浓度下做三个重复。
扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为10μl，其中按要求加入梯度稀释的模板1μl，浓度为10μM的5种引物各0.25μl，荧光定量PCR预混液5μl，无菌去离子水2.75μl补足到10μl。
反应条件：95℃3min预变性；以95℃10s，52℃10s，72℃30s为一个循环，共进行40个循环。
检测结果：
表6黑曲霉DNA浓度对应的荧光定量PCR Ct值来自于图10的荧光定量PCR扩增曲线，从扩增曲线来看，实验重复性好。
表6黑曲霉DNA浓度与荧光定量PCR检测结果对照
Figure BDA0002311420690000101
标准曲线：y＝-3.7934x+16.159 R2＝0.9994
x：lg(DNA浓度) y：表示荧光定量Ct值
从表6中荧光定量Ct值与加入到对应反应体系中黑曲霉DNA的量的关系来看，本方法中能够检测到的最低DNA浓度灵敏度是0.000043ng。图11是不同DNA浓度与对应的Ct值数据经处理后得出Lg(DNA浓度)与荧光定量PCR Ct值的线性化关系的标准曲线。标准曲线的R2>0.98，表明数据与线性化方程吻合程度高，利用该标准曲线可以定量检测待检测样品中黑曲霉DNA浓度的浓度，最低检测限约达0.000043ng。
4、通过实时荧光定量PCR对细胞产品的真菌检测
本实验在待检测样品中加入少量酵母菌体，用实施例1中设计的5条引物混合物通过实时荧光定量PCR对细胞产品进行真菌检测。
1、待测样本的处理
取细胞培养液3ml到15ml离心管中，10000rpm离心2min，去掉上清液后加入20μl的Lysis Buffer for Microorganism(购买于TaKaRa公司)裂解液，置于PCR仪上80℃反应20min，反应完成后取1μl作为供试品模板。
2、阳性对照
用牙签蘸取少量酵母菌体，在20μl的Lysis Buffer for Microorganism裂解液中搅动几下后取出，然后置于PCR仪上80℃反应20min，反应完成后取1μl作为阳性对照模板。
3、阴性对照
取1μl无菌去离子水做阴性对照模板。
4、阳性干扰品的处理
细胞培养液混匀取3ml上清到15ml离心管中，同时加入2μl酵母菌液，10000rpm离心2min，去上清后再加入20μl的Lysis Buffer for Microorganism裂解液，置于PCR仪上80℃反应20min，取1μl作为供试品模板。
5、实时荧光定量PCR检测
分别对上述的样品在荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测，总反应体积为10μl，其中模板1μl，浓度为10μM的5种引物各0.25μl，PCR预混液5μl，无菌去离子水2.75μl；反应条件为：95℃3min预变性；以95℃10s，52℃10s，72℃30s为一个循环，共40个循环。
6、检测结果
定性标准：
(1)荧光定量PCR Ct值等于40.0的标本为阴性；
(2)CT值≤32的标本，检测结果为阳性；
(3)Ct值在32～40之间为可疑区域，将样本置于30℃摇床上震荡培养一天后重做，重做后大于32值为阴性。
各个样本的定量PCR扩增曲线见图12，各个样本对应的Ct值见表7。根据检测结果，阳性对照能够正常扩增，阴性对照和供试品均未读出Ct值，表明检测样品无真菌污染。同时将待测样本在细胞培养基中30℃震荡培养7天，培养基仍然清澈，表明本发明的检测结果准确可靠。
表7样本检测对应Ct值
Figure BDA0002311420690000121
实施例2：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示引物混合物检测真菌污染
1、用于检测细胞制品中真菌污染的荧光PCR引物的特异性检测及灵敏度的确定
本实施例采用标准菌株酵母菌对实施例1的SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示引物进行特异性检测及最低检测限的确定。标准品序列如SEQ ID NO.6所示。
用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示引物扩增标准菌株酵母菌，切胶回收PCR产物，纯化后将目的片段连接到pTOPO克隆载体上，用载体引物M13F对重组的阳性克隆进行测序验证无误后，抽提重组克隆质粒。测定浓度并换算成(拷贝数/体积)，然后进行梯度稀释，稀释到1.0977×10-1.0977×108拷贝/μl。在每个浓度下取1μl作为模板进行定量PCR检测实验，每个浓度下做三个重复。
扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为10μl，其中按要求加入梯度稀释的模板1μl，10μM的上下游引物各0.25μl，荧光定量PCR预混液5μl(购买于TaKaRa公司)，无菌去离子水3.5μl补足到10μl。
反应条件：95℃3min预变性；以95℃10s，58℃10s，72℃30s为一个循环，共进行40个循环。40个循环完成后再进行溶解曲线的制作。
检测结果：
表8中质粒拷贝数对应的荧光定量PCR Ct值来自于图13的荧光定量PCR扩增曲线(标注P1-P8的曲线分别为重组克隆质粒稀释到1.0977×108拷贝/μl-1.0977×10拷贝/μl的样品)，图14为该实验的溶解曲线。从扩增曲线和溶解曲线来看，实验重复性好，特异性强。
表8质粒拷贝数与与荧光定量PCR检测结果对照
Figure BDA0002311420690000131
标准曲线：y＝-4.6511x+46.797 R2＝0.9998
x：表示Lg(质粒拷贝数) y：表示荧光定量Ct值
从表8中荧光定量Ct值与每微升中目的基因序列拷贝数对应的关系来看，本方法中能够检测到的最低灵敏度是110个拷贝。图15是标准序列不同拷贝数与对应的Ct值数据经处理后得出Lg(质粒拷贝数)与荧光定量PCR Ct值的线性化关系的标准曲线。标准曲线的R2>0.98，表明数据与线性化方程吻合程度高，利用该标准曲线可以定量检测待检测样品中目的基因的浓度，最低检测限约达110个拷贝。
2、通过实时荧光定量PCR对细胞产品的真菌检测
1、待测样本的处理
取细胞培养液3ml到15ml离心管中，10000rpm离心2min，去掉上清液后加入20μl的Lysis Buffer for Microorganism(购买于TaKaRa公司)裂解液，置于PCR仪上80℃反应20min，反应完成后取1μl作为供试品模板。
2、阳性对照
用牙签蘸取少量酵母菌体，在20μl的Lysis Buffer for Microorganism裂解液中搅动几下后取出，然后置于PCR仪上80℃反应20min，反应完成后取1μl作为阳性对照模板。
3、阴性对照
取1μl无菌去离子水做阴性对照模板。
4、阳性干扰品的处理
细胞培养液混匀取3ml上清到15ml离心管中，同时加入2μl酵母菌液，10000rpm离心2min，去上清后再加入20μl的Lysis Buffer for Microorganism裂解液，置于PCR仪上80℃反应20min，取1μl作为供试品模板。
5、实时荧光定量PCR检测
分别对上述的样品在荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测，总反应体积为10μl，其中模板1μl，浓度为10μM的SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示引物各0.25μl，PCR预混液5μl，无菌去离子水3.5μl；反应条件为：95℃3min预变性；以95℃10s，58℃10s，72℃30s为一个循环，共40个循环。
6、检测结果
定性标准：
(1)荧光定量PCR Ct值等于40.0的标本为阴性；
(2)CT值≤32的标本，检测结果为阳性；
(3)Ct值在32～40之间为可疑区域，将样本置于30℃摇床上震荡培养一天后重做，重做后大于32值为阴性。
各个样本的定量PCR扩增曲线见图16，各个样本对应的Ct值见表9。根据检测结果，阳性对照能够正常扩增，阴性对照和供试品均未读出Ct值，表明检测样品无真菌污染。同时将待测样本在细胞培养基中30℃震荡培养7天，培养基仍然清澈，表明本发明的检测结果准确可靠。
表9样本检测对应Ct值
Figure BDA0002311420690000151
综上所述，本发明所提供的采用实施例1获得的引物对细胞制品中进行实时荧光定量PCR检测，可大大提高真菌检测的准确性、特异性和通用性，解决了定量PCR检测中的假阳性问题，提高了检测结果的可靠性。同时本发明的检测方法操作简单，无需复杂的核酸提取过程，只需将细胞制品中污染的真菌通过短暂离心富集后用裂解液裂解即可作为模板进行定量PCR检测，能够在3小时内完成细胞制品中常见真菌的检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉睿健医药科技有限公司
<120> 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggcgagtga agcggsaa 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcccgmrttg taatttgnag 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacaggacgy catagagggt gaga 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catataacca ttaygccagc atcc 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctgccgcnn aaacygatgc tggcc 25
<210> 6
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacaggacgt catagagggt gagaatcccg tgtggcgagg agtgcggttc tttgtaaagt 60
gccttcgaag agtcgagttg tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa attccatcta 120
aagctaaata ttggcgagag accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa gatgaaaaga 180
actttgaaaa gagagtgaaa aagtacgtga aattgttgaa agggaagggc atttgatcag 240
acatggtgtt ttgtgccctc tgctccttgt gggtagggga atctcgcatt tcactgggcc 300
agcatcagtt ttggtggcag gataaatcca taggaatgta gcttgcctcg gtaagtatta 360
tagcctgtgg gaatactgcc agctgggact gaggactgcg acgtaagtca aggatgctgg 420
cataatggtt atatg 435

Claims (10)

1.一种用于细胞制品中真菌污染检测的通用引物组，其特征在于，包括用以扩增真菌rDNA的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物序列与真菌26S rDNA序列的保守区域互补，所述上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，所述下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞制品中真菌污染检测的通用引物组，其特征在于，组成所述引物组的各条引物的单链DNA分子的物质的量相等。
3.用于检测细胞制品中真菌污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1-2任一项所述的通用引物组和PCR预混液。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测细胞制品中真菌污染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品序列如SEQ ID NO.6所示。
5.权利要求1-2任一项所述的通用引物，或权利要求3-4任一项所述的试剂盒在细胞培养液、细胞培养基真菌污染检测中的应用。
6.一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，其特征在于，包括：
(1)以带有标准序列的质粒为模板进行荧光定量PCR，建立标准曲线，所述标准序列如SEQ ID NO.6所示，所述荧光定量PCR的上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种；
(2)供试品处理，获得荧光定量PCR供试品模板；
(3)扩增检测：以步骤(2)中的模板为扩增模板进行荧光定量PCR，所述荧光定量PCR的上游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种，下游引物选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的一种或两种；
(4)荧光定量结果分析：根据供试品的样本基因组DNA中的靶标扩增Ct值来判断供试品中是否存在真菌污染。
7.根据权利要求6所述的一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中供试品处理方法为：取细胞制品进行短暂离心富集后，再使用裂解液裂解直接获得供试品模板。
8.根据权利要求6所述的一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃3min预变性；以95℃10s，58℃10s，72℃30s为一个循环，共40个循环。
9.根据权利要求6所述的一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，其特征在于，所述方法中设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为裂解液裂解酵母后的溶液，所述阴性对照为无菌去离子水。
10.根据权利要求6所述的一种细胞制品中真菌污染的快速检测方法，其特征在于，所述方法中设置阳性干扰品，所述阳性干扰品为等体积的供试品中添加酵母菌液形成的；所述阳性干扰品处理方法为：取阳性干扰品进行短暂离心富集后，再使用裂解液裂解直接获得阳性干扰品模板。
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