CN111378774A - 一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法，所述引物组的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明的引物组和试剂盒的灵敏性高，对单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到5.37×10‑7ng/μL；并且引物组与李斯特菌属的其它菌以及其它常见致病菌均无特异性扩增条带，具有良好的特异性，为单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测提供了一个新的靶标基因及其引物组，同时也为单核细胞增生李斯特菌的现场快速检测提供有效的技术手段。

Description

一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂 盒及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学快速检测技术领域，特别的涉及一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌属于李斯特菌属，单核细胞增生李斯特菌是属中唯一可使人类致病的致病菌，广泛存在于自然界中，如土壤、地面水、冰箱内、牛奶及奶制品、水产品和肉制品中。该菌经口摄入后，首先侵入肠道的上皮细胞，在细胞内和细胞间扩散，然后经入血液感染其它敏感的机体细胞，可引起人脑膜炎、败血症和流产，尤其对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。人类感染单增李斯特菌后有高达20%〜30 %的致死率。1986年，世界卫生组织(WHO)将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一；2000年，WHO又将其列为需要重点监测的食源性致病菌之一。因此，加强食品中李斯特菌监测，应对李斯特菌导致的食品安全突发事件，已成为各国政府和国际相关组织所面临的迫切任务。
目前我国现行的李斯特菌检测国家标准方法主要是GB 4789系列标准，标准中的检测主要依靠传统的细菌培养、血清学、生化鉴定等方法，包括富集、选择性培养、生化鉴定。这些传统检测方法具有劳动强度高、费用高、检测周期长，一般需要 4-7天，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低，且一次性完成大批量的样本检测，较为耗时耗力，通量较低，已不能满足我国公共卫生突发事件应急检测的需要。更重要的是，传统方法检测灵敏度较低、特异性不足，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难加以区分。由于PCR方法从分子水平上检测单增李斯特菌，具有较高的特异性和灵敏度，特别是实时荧光定量PCR法、恒温核酸扩增方法等，可以实时监测体系的反应过程，因此在李斯特菌的检测上得到了广泛的应用。如Bessesen MT等于1990年建立了PCR检测单核细胞增生李斯特菌的方法，通过扩增李斯特氏菌的特异基因溶血素基因hlyA中以达到快速检测单核细胞增生李斯特菌的效果（ApplEnviron Mierobiol,1990,56(9): 2930-2932）。发明专利201911188273.2公开了用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、RPA试剂盒及其应用，特点是RPA引物是基于单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因设计的。综上所述，借助分子生物学的方法实现单增李斯特的快速检测，技术已相对成熟，但基于不断增长的微生物基因组、转录组等大量数据的更新完善，导致基于上述靶基因序列获得的引物在实际应用中很难确保其特异性：hlyA基因总长1590bp，在单增李斯特与伊氏李斯特菌中只存在43bp的差异，序列一致性高达97%，与英诺克李斯特菌中hly的序列一致性也高达94%，若想通过该基因区分两种菌株，则可选择的用于PCR引物设计的区域较少，考虑到引物GC含量，退火温度等因素后，可选区域会进一步缩小，不利于引物的设计及后期的实验。
荧光定量PCR、RPA和LAMP与常规PCR相比，各有优缺点，荧光定量PCR可以实现实时的定量检测，但试剂及仪器成本较高，对实验人员的实验技术要求较高；RPA和LAMP虽对仪器要求较低，但引物设计较为困难，往往需要设计几对GC含量合适，打分较高的优质引物组，在序列条件不是特别好的情况下，较难实现；常规PCR具有成本低，引物质量要求相对较低的优势，在日常的科研实验和检验任务中占据主导地位，因此，挖掘新的特异基因以及其引物对组，建立一种简便、快速、灵敏、特异、准确的单核细胞增生李斯特菌检测方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于：为单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测提供一个新的靶标基因、引物组、试剂盒和方法，所述引物组具有较高的种间特异性，所述方法具有检测时间短、特异性好和灵敏度高的特点。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，所述引物组是基于单核细胞增生李斯特菌的IAP基因设计的，IAP基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示，引物组的核酸序列如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示，分别为：IAP-F:5’-ACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAG-3’，IAP-R:5’-CCAGAGCCGTGGATGTTATCGTATT-3’。
本发明还提供了用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组，还包括用于DNA扩增所需要的所有试剂；包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、Tag酶、缓冲液、稀释剂、镁离子或辅助因子。
本发明还提供了一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，实验步骤如下：
1）提取待检样品的基因组DNA；
2）以提取的DNA为模板，用所述的试剂盒进行PCR扩增；
3）结果判定：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，判断样品中是否有单核细胞增生李斯特氏菌。
作为优选的，步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 2.5μL，10 μmol/L的引物各0.5 μL，10 mmol/L的dNTP 0.5μL，5U /μL的Taq酶0.5 μL，DNA模板 1.0 μL，25mmol/L的Mg2+1.5μL，dd H2O 18μL。
作为优选的，步骤(2)中所述的PCR扩增程序为：95℃预变性 5 min，进入循环:95℃变性 30s，58℃复性 30s，72℃延伸 1min，共35个循环，然后72℃延伸10min。
作为优选的，若PCR扩增产物在539 bp处有特异性的电泳条带，则样品中存在单核细胞增生李斯特氏菌。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明经过前期充分的生物信息学分析，对候选靶标基因和候选引物进行了大量的筛选和优化，最终特异性强，灵敏度高且使用范围广的引物组，在后期的实验验证中，该引物组对单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到5.37×10-7ng/μL，并且引物组与其它李斯特菌属菌及其它常见致病菌之间均无特异性扩增条带，判读结果为阴性，表明该引物对不仅检测灵敏度较高，还具有良好的种间特异性，为单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测提供了一个新的靶标基因及其引物组，同时也为单核细胞增生李斯特菌的现场快速检测提供了有效的技术手段。
2本发明的检测方法中PCR扩增条件简单，操作简单，成本较低，采用简单PCR反应后，通过电泳检测便可快速鉴定单核细胞增生李斯特菌，具有高效、便捷及成本低廉等显著优点，对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测具有指导意义。
附图说明
图1为本发明对单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测结果图，泳道1为DNA 分子量marker，泳道2~10依次为：单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115，斯氏李斯特菌ATCC35967，伊氏李斯特菌ATCC 19119，马红球菌ATCC 6939，英诺克李斯特菌CICC 10417，威氏李斯特菌CICC 21672，格氏李斯特菌CICC 21670，大肠埃希氏菌O157：H7 CICC 21530，阴性对照。
图2为本发明对单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏性检测结果图，泳道1为DNA分子量marker，泳道2~10为不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌DNA，其浓度依次为5.37 ng/μL，5.37×10-1 ng/μL，5.37×10-2 ng/μL，5.37×10-3ng/μL，5.37×10-4 ng/μL，5.37×10-5ng/μL,5.37×10-6 ng/μL,5.37×10-7 ng/μL,5.37×10-8 ng/μL。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中所用方法如没有特别说明均为实验室常规方法。
以下实施例所涉及到的单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115，斯氏李斯特菌ATCC35967，伊氏李斯特菌ATCC 19119和马红球菌ATCC 6939均购自美国菌种保藏中心。英诺克李斯特菌CICC 10417，威氏李斯特菌CICC 21672，格氏李斯特菌CICC 21670和大肠埃希氏菌O157：H7 CICC 21530均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法的建立
（1）靶标基因及引物组的设计和筛选：
根据GenBank上公开登录的单核细胞增生李斯特菌基因序列信息（登录号：CP023861.1），利用生物信息学知识以及相关分析软件，对单核细胞增生李斯特菌的候选特异基因与NCBI的Nr数据库进行同源性比对分析，最终筛选出与其他微生物菌种相似度较低，且核苷酸总长较为合适的IAP基因作为靶标基因，完整核酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因总长1446bp，与英诺克李斯特菌中IAP的序列一致性仅87%，与其它李斯特菌的序列一致性极低，序列的高特异性保证了可用以筛选优质引物的范围。然后针对IAP基因进行特异性引物的设计，结合与Nr数据库的同源性比对结果，最终筛选出与同源序列差异较大，且引物质量较高的引物对作为后期实验验证的候选；对候选引物对进行试验比较分析，从中选择特异性高，灵敏度较高的引物对，引物对与完整核酸序列的相对位置如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，下划线区域为PCR扩增产物，加粗序列为引物的结合位点。ACAGCACCTAA AGCACCAACAGAAGCTGCAAAACCAGCTCCTGCACCATCtacaaacacaaatgctaataaaacaaatacaaataca aatacaaatacaaatacaaacaatactaatacaaatacaccatctaaaaatactaatacaaactcaaatactaata cgaatacaaaCTCAAATACGAATGCTAATCAAGGTTCTTCCAACAATAACAGCAATTCAAGTGCAAGTGCTATTAT TGCTGAAGCTCAAAAACACCTTGGAAAAGCTTATTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGT TACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGGAATCTCCCTTCCACGTACTTCTGGCGCACAATACGCTAGCACTACAA GAATCTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTCTTTGACTATGGTAGCGGAATTTCTCACGTTGGTAT CTACGTTGGTAATGGTCAAATGATTAACGCGCAAGACAATGGCGTTAAATACGATAACATCCACGGCTCTGG。
上游引物IAP-F：5’-ACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAG-3’
下游引物IAP-R：5’-CCAGAGCCGTGGATGTTATCGTATT-3’。
（2）样品中基因组DNA的提取：
按照中华人民共和国国家标准GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》中指定的方法对待检样品进行增菌培养24-48h；采用天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒对菌株的基因组DNA进行提取，提取完成后使用Nano-drop one对DNA提取浓度和质量进行把控，以提供浓度适宜且质量较高的DNA用以后续的PCR扩增检测。
（3）PCR扩增检测：
S1：PCR反应体系：反应总体积为25μL。其中，10×PCR buffer 2.5μL，上游引物IAP-F（10μmol/L）和下游引物IAP-R（10μmol/L）各0.5μL；dNTP （10 mmol/L ）0.5μL，Taq 酶（5U /μL）0.5 μL，DNA模板 1.0 μL，Mg2+（25mmol/L）1.5μL，dd H2O 18μL。
S2：PCR反应条件：95℃预变性 5 min后进入PCR循环：95℃变性 30s，58℃复性30s，72℃延伸 1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
S3：PCR扩增产物分析：反应结束后，PCR扩增产物与核酸染料混合，加入提前制好的1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，最后在凝胶成像系统的辅助下，对检测结果进行判定，若扩增产物在539bp处有电泳条带，则待测样品中存在单核细胞增生李斯特菌；若扩增产物在539bp处无条带，则待测样品中不存在单核细胞增生李斯特菌。
按照常规方法，本发明的引物及其用于DNA扩增所需要的试剂，如脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、缓冲液、稀释剂、镁离子或辅助因子等，可组装成专用试剂盒，用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测。
实施例2 对本发明所建立的检测方法进行特异性试验分析。
分别收集单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115，斯氏李斯特菌ATCC 35967，伊氏李斯特菌ATCC 19119，马红球菌ATCC 6939，英诺克李斯特菌CICC 10417，威氏李斯特菌CICC21672，格氏李斯特菌CICC 21670和大肠埃希氏菌O157：H7 CICC 21530进行培养，提取细菌DNA。再分别以上述菌的基因组DNA为模板并参照实施例1的PCR反应体系和反应条件进行扩增，各实验组中的模板、引物和酶等各类试剂的浓度均相同；实验结果如图1所示。
由结果可知，只有阳性对照单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115的扩增结果呈阳性，即在539bp处有特异性的电泳条带，而李斯特菌属的其它菌和其它常见致病菌均未扩增出目的条带，结果判定为阴性。该结果表明，本发明中设计的单核细胞增生李斯特菌引物组具有较高的特异性。
实施例3 对本发明所建立的检测方法进行灵敏度试验分析。
以不同浓度的单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115基因组DNA为模板，利用IAP-F和IAP-R为引物进行PCR扩增，不同反应中，模板DNA的浓度分别为5.37 ng/μL，5.37×10-1 ng/μL，5.37×10-2 ng/μL，5.37×10-3ng/μL，5.37×10-4 ng/μL，5.37×10-5 ng/μL，5.37×10-6ng/μL，5.37×10-7 ng/μL，5.37×10-8 ng/μL。分别以上述浓度的DNA为模板并参照实施例1的PCR反应体系和反应条件进行扩增，实验结果如图2所示。
由结果可知，单核细胞增生李斯特氏菌DNA模板浓度为5.37×10-7ng/μL时，仍可以观察明显的目的条带，从而说明本发明中的引物组具有较高的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆市计量质量检测研究院；
<120> 一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）
<400> 1
atgaaaaaag caactatcgc ggctacagct gggattgcgg taacagcatt tgctgcgcca 60
acaatcgcat ccgcaagcac tgtagtagtc gaagctggtg atactctttg gggtatcgca 120
caaagtaaag ggactactgt tgacgcaatt aaaaaagcaa acaatttaac aacagataaa 180
atcgtaccag gtcaaaaatt acaagtaaat aatgaggttg ctgctgctga aaaaacagag 240
aaatctgtta gcgcaacttg gttaaacgtc cgtagtggcg ctggtgttga taacagtatt 300
attacgtcca tcaaaggtgg aacaaaagta actgttgaaa caaccgaatc taacggctgg 360
cacaaaatta cttacaacga tggaaaaact ggtttcgtta acggtaaata cttaactgac 420
aaagcagtaa gcactccagt tgcaccaaca caagaagtga aaaaagaaac tactactcaa 480
caagctgcac ctgctgcaga aacaaaaact gaagtaaaac aaactacaca agcaactaca 540
cctgcgccta aagtagcaga aacgaaagaa actccagtag tagatcaaaa tgctactaca 600
cacgctgtta aaagcggtga cactatttgg gctttatccg taaaatacgg tgtttctgtt 660
caagacatta tgtcatggaa taatttatct tcttcttcta tttatgtagg tcaaaagctt 720
gctattaaac aaactgctaa cacagctact ccaaaagcag aagtgaaaac ggaagctcca 780
gcagctgaaa aacaagcagc tccagtagtt aaagaaaata ctaacacaaa tactgctact 840
acagagaaaa aagaaacagc aacgcaacaa caaacagcac ctaaagcacc aacagaagct 900
gcaaaaccag ctcctgcacc atctacaaac acaaatgcta ataaaacaaa tacaaataca 960
aatacaaata caaatacaaa caatactaat acaaatacac catctaaaaa tactaataca 1020
aactcaaata ctaatacgaa tacaaactca aatacgaatg ctaatcaagg ttcttccaac 1080
aataacagca attcaagtgc aagtgctatt attgctgaag ctcaaaaaca ccttggaaaa 1140
gcttattcat ggggtggtaa cggaccaact acatttgatt gctctggtta cactaaatat 1200
gtatttgcta aagcgggaat ctcccttcca cgtacttctg gcgcacaata cgctagcact 1260
acaagaatct ctgaatctca agcaaaacct ggtgatttag tattctttga ctatggtagc 1320
ggaatttctc acgttggtat ctacgttggt aatggtcaaa tgattaacgc gcaagacaat 1380
ggcgttaaat acgataacat ccacggctct ggctggggta aatatctagt tggcttcggt 1440
cgcgtataa 1449
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acagcaccta aagcaccaac agaag 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccagagccgt ggatgttatc gtatt 25

Claims (7)

1.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组的核酸序列为：IAP-F:5’-ACAGCACCTAAAGCACCAACAGAAG-3’，IAP-R:5’-CCAGAGCCGTGGATGTTATCGTATT-3’。
2.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、缓冲液、稀释剂、镁离子或辅助因子。
4.一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待检样品的DNA；
2）以提取的DNA为模板，以权利要求1所述的引物组进行PCR扩增，得到扩增产物；
3）结果判定：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，判断样品中是否有单核细胞增生李斯特氏菌。
5.根据权利要求4所述一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步骤2)中所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 2.5μL，10 μmol/L的引物各0.5 μL，10 mmol/L的dNTP 0.5μL，5U /μL的Taq酶0.5 μL，DNA模板 1.0 μL，25mmol/L的Mg2+1.5μL，dd H2O 18μL。
6.根据权利要求4所述一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，步骤2)中所述的PCR扩增程序为：95℃预变性 5 min，进入循环:95℃变性 30s，58℃复性 30s，72℃延伸 1min，共35个循环，然后72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，若PCR扩增产物在539 bp处有特异性的电泳条带，则样品中存在单核细胞增生李斯特氏菌。
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