CN115992266A - 一种检测鼠李糖乳杆菌x253的引物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物及其应用，所述引物组合物包括引物对和探针；本发明还公开了上述引物组合物的应用，应用于鼠李糖乳杆菌X253的定性和/或定量检测。本发明提供的检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物，具有良好的特异性、重复性和灵敏性；应用含有该引物组合物对样品中鼠李糖乳杆菌X253进行菌株定性定量测定时更加快速、准确，可有效提高对含有鼠李糖乳杆菌X253的食品原料、中间体及成品质量安全监控的力度和效率。本发明适用于对食品中鼠李糖乳杆菌X253定性定量分析。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种检测益生菌的引物组合物，具体地说是一种检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物及其应用。
背景技术
鼠李糖乳杆菌(Lacticasei-bacillus rhamnosus)属于革兰氏阳性菌，兼性厌氧，异型发酵乳酸菌，广泛分布于动物胃肠道、生殖道、乳制品及植物材料中。如今，鼠李糖乳杆菌被广泛应用于乳制品、保健食品、动物饲料及生物医药等领域，体现了其较高的经济价值。鼠李糖乳杆菌中的鼠李糖乳杆菌X253分离筛选自新疆发酵乳，研究表明，该菌是安全性强、对人体胃肠液有较强的耐受性，同时该菌抗氧化能力强、有益口腔健康、可缓解体力疲劳，是一种具良好市场前景的潜在菌株。但当鼠李糖乳杆菌X253在食品中过量增殖时，也会影响人体的免疫机能以及肠道的菌落平衡；鼠李糖乳杆菌X253数量过低时，达不到预期的有益效果。因此，针对鼠李糖乳杆菌X253的检验也是在食品相关原料、食品的生产和质量安全中重要环节。
目前益生菌的鉴定主要分为培养法和分子生物学法。培养法主要是通过形态学、革兰氏染色和生化测试进行鉴定，非常耗时且无法对同种内菌株进行区分。分子生物学方法主要包括16S rDNA、16S-23S ITS基因序列测序方法、脉冲场凝胶电泳法、随机扩增多态性DNA分析或扩增长度多态性分析等，存在以下不足：(1)在辨别密切相关的物种和亚种方面存在局限性；(2)操作复杂、重复性差、需要专业技能或先进的硬件和软件。因此，开发一种适用于企业的简便、快速、重复性好的鼠李糖乳杆菌X253菌株水平鉴定及量化方法势在必行。
发明内容
本发明一个目的，旨在提供一种检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物，以达到定性定量地检测样品中的鼠李糖乳杆菌X253的目的；
本发明的另一个目的，旨在提供上述引物组合物的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物，所述引物组合物包括引物对和探针；所述引物对，上游引物的核苷酸序列为：ggttggtcgtttgccttatca；下游引物的核苷酸序列为：ttcagtatccaccagcccacta；所述探针的核苷酸序列为：actggcccatgctt。
本发明还提供了所述检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物一种应用，所述引物组合物在定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌X253中的应用。
作为对上述检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物应用的一种限定，所述定性检测鼠李糖乳杆菌X253的方法为：收集样品菌体、提取样品DNA、qPCR扩增、分析、判定；
所述判定的标准包括，qPCR扩增产物起峰且Cq值<35，则样品中鼠李糖乳杆菌X253检测结果为阳性。
作为对上述检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物应用的另一种限定，根据权利要求2所述检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物的应用，其特征在于，所述定量检测鼠李糖乳杆菌X253的方法包括依次进行的以下步骤：
S1.标准曲线的制作
取鼠李糖杆菌X253菌液标准品，梯度稀释，提取菌液标准品DNA作为模板进行qPCR扩增，线性拟合，建立标准曲线；
S2.样品中鼠李糖乳杆菌X253的定量测定
收集含鼠李糖乳杆菌X253的样品，提取DNA作为模板进行qPCR扩增，对照步骤S1建立的标准曲线，获得样品中鼠李糖乳杆菌X253浓度；
其中，步骤S1和步骤S2中所述qPCR扩增采用权利要求1所述的引物组合物。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
①本发明根据鼠李糖乳杆菌X253特异性SNP位点，结合差异位点个数及位置、Tm值、引物末端稳定性、GC含量、二级结构等参数，设计了多组特异性的探针和引物，经优选后，选定的该组探针和引物具有良好的种间特异性和种内特异性，能够有效区分鼠李糖乳杆菌X253与其它菌株；
②应用本发明提供的引物组合物检测鼠李糖乳杆菌X253时，检出限低，反应灵敏、重复性好；
③本发明提供的检测鼠李糖乳杆菌X253方法，与常规的培养法和分子生物学法相比，能够更加高效、准确地对样品中鼠李糖乳杆菌X253进行定性定量测定，大幅度缩短检测时间，提高工作效率；
综上所述，本发明提供的检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物，具有良好的特异性、重复性和灵敏性；应用含有该引物组合物对样品中鼠李糖乳杆菌X253进行菌株鉴定和含量测定时更加快速、准确，可有效提高对含有鼠李糖乳杆菌X253的食品原料、中间体及成品质量安全监控的力度和效率。
本发明适用于对食品中鼠李糖乳杆菌X253进行定性定量分析。
附图说明
图1为本发明实施例2中种间特异性检测结果图；
图2为本发明实施例2中种内特异性检测结果图；
图3为本发明实施例5不同稀释度发酵乳qPCR图；
图4为本发明实施例6中鼠李糖乳杆菌X253菌液标准曲线；
图5为本发明实施例6中菌粉样品qPCR图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中所使用荧光定量qPCR仪型号为Roche Light Cycler480，生产厂家为德国罗氏诊断有限公司。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1筛选检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物
本发明鼠李糖乳杆菌X253分离自新疆发酵乳，该菌菌株已于2019年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18404。本实施例提供的一种检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物的筛选过程如下：
(1)SNP分析
经初筛，优选29个鼠李糖乳杆菌菌株，并在NCBI数据库中获取所选29个鼠李糖乳杆菌菌株全基因组序列，以鼠李糖乳杆菌X253菌株作为参考菌株，基因组比对所用菌株信息详见表1。
表1基因组比对所用菌株信息
通过Bwa软件将模拟序列比对到鼠李糖乳杆菌X253参考序列上，Samtools软件将比对结果排序，Sambamba软件除去重复序列，通过VarScan软件分析得到鼠李糖乳杆菌X253的SNP位点集合，该集合中约有120000个SNP位点，经数据逐级筛选分析，最终获得4个鼠李糖乳杆菌X253菌株基因的特异性SNP位点，具体如以下表2所示。
表2鼠李糖乳杆菌X253与其它29株鼠李糖乳杆菌SNP分析结果
(2)实验菌株的选择
为避免日后使用设计的引物组合物时出现假阳性，发明人选择鼠李糖乳杆菌X253及其与鼠李糖乳杆菌X253分类学地位相似或者基因序列接近的43株菌株作为实验菌株，实验菌株详情如表3所示。
表3实验菌株
(3)DNA提取
实验菌株及样品DNA用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取，按厂商提供的说明书方法进行。提取的DNA样品经1.0％的琼脂凝胶电泳检测，测定DNA样品的浓度、260/280比值和260/230比值后，存放于-20℃冰箱备用。
(4)菌株特异性引物设计
根据鼠李糖乳杆菌X253特异性SNP位点，结合差异位点个数及位置、Tm值、引物末端稳定性、GC含量、二级结构等参数，使用Primer Express 3.0软件设计出可用的引物与探针，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中本实施例中四种探针的荧光基团均选择5-FAM、淬灭基团均选择BHQ1。
根据本实施例步骤(2)得到的4个鼠李糖乳杆菌X253菌株基因的特异性SNP位点，分别设计了引物对和探针序列，其SNP位点、引物对和探针序列及其扩增长度具体如表4所示。
表4引物及探针序列
实施例2特异性检验
(1)种间特异性检验
采用实施例1步骤(2)表3中的鼠李糖乳杆菌X253、5株干酪乳杆菌、13株副干酪乳杆菌及16株其他标准或食品常用菌株(即表3中序号为1、7-44的菌株)，进行种间特异性检验，提取所选各菌株的DNA，将核酸浓度均调节至50ng/μL，分别采用表4所列的引物组合物进行qPCR。
qPCR反应体系为：2×Takara Prober Taq mix 10μL，浓度为5μM的上游引物1μL，浓度为5μM的下游引物1μL，浓度为10μM的探针1μL，DNA模板1μL，去离子水补足至20μL。
反应程序为：第一阶段95℃2min；第二阶段95℃5sec，52℃35sec，共40个循环。
每组实验3个平行，以无菌水作为空白对照。
进行特异性检测，3个平行实验的结果如图1所示。由图1可知，利用位于holA基因上的SNP位点设计的引物对(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:12)和探针(SEQ IN NO:3)进行qPCR扩增后，除鼠李糖乳杆菌X253外，所选其它非鼠李糖乳杆菌种的菌株及空白对照均未得到有效的扩增产物，可知该引物组合物可以有效区分鼠李糖乳杆菌X253与其它非鼠李糖乳杆菌种的38种乳酸菌，且Cq值均≤20；而其余3对引物的扩增产物则无法将鼠李糖乳杆菌X253与其它菌株有效区分；结果表明，所选引物组合物种间特异性良好；
(2)种内特异性检验
采用实施例1步骤(2)表3中的鼠李糖乳杆菌种的6种菌株(即表3中序号为1-6的菌株)，进行种内特异性检验，提取所选各菌株的DNA，将核酸浓度均调节至50ng/μL，分别采用表4所列的引物组合物进行qPCR。
qPCR反应体系为：2×Takara Prober Taq mix 10μL，浓度为5μM的上游引物1μL，浓度为5μM的下游引物1μL，浓度为10μM的探针1μL，DNA模板1μL，去离子水补足至20μL。
反应程序为：第一阶段95℃2min；第二阶段95℃5sec，52℃35sec，共40个循环。
每组实验3个平行，以无菌水作为空白对照。
进行特异性检测，实验结果如图2所示。由图2可知，利用位于holA基因上的SNP位点设计的引物对(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:12)和探针(SEQ IN NO:3)进行qPCR扩增后，除鼠李糖乳杆菌X253外，所选其它5种鼠李糖乳杆菌种菌株及空白对照均未得到有效的扩增产物，可知该引物组合物可以有效区分鼠李糖乳杆菌X253与其它5种鼠李糖乳杆菌菌株，且Cq值均≤20；而其余3对引物的扩增产物则无法将鼠李糖乳杆菌X253与其它菌株有效区分；结果表明，所选引物组合物种内特异性良好，确定该组合物作为本发明用于检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物，即引物对中上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为GGTTGGTCGTTTGCCTTATCA；下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为TTCAGTATCCACCAGCCCACTA；探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体为ACTGGCCCATGCTT，探针荧光基团选择5-FAM、淬灭基团选择BHQ1。
实施例3引物组合物的检出限检验
本实施例包括核酸检出限和菌液浓度检出限的检测。核酸灵敏度选取10ng/μL浓度的核酸溶液进行依次稀释，进行qPCR扩增；菌液灵敏度是将鼠李糖乳杆菌X253的培养液依次进行10倍梯度稀释，稀释倍数为108～102CFU/mL，各浓度取1mL提取核酸，进行qPCR检测。每个样品重复3次。以无菌水作为空白对照样品。
为了确定检测的核酸浓度检出限，从10ng/μL的核酸溶液进行依次稀释成1、0.1、0.01、0.001、0.0001ng/μL进行qPCR扩增，结果如表5所示。
表5 DNA浓度检出限
由表5可知，鼠李糖乳杆菌X253核酸浓度检出限检出限为0.001ng/μL。
通过将鼠李糖乳杆菌X253发酵液进行梯度稀释，提取DNA作为模板。每个菌浓度3个平行，同时对菌液进行培养计数，实验结果如表6所示。
表6菌液浓度检出限
由表6可知，菌浓度为103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL时，每个菌浓度的Cq值均＜35，可判定检测结果均为阳性；而菌浓度为102CFU/mL时，Cq值＞35，可判定检测结果均为阴性。以上结果表明该方法的菌液浓度定量检出限为103CFU/mL。
实施例4重复性检验
通过短时间内重复试验来确定重复性,本实施例中方案一与方案一时间间隔7天，分别使用3种不同的DNA浓度进行重复性测试，每次测试重复6次，以无菌水作为空白对照样品，实验结果如表7所示。
表7鼠李糖乳杆菌X253株水平检测重复性验证
由表7可知，使用3种不同的DNA浓度进行重复性测试，DNA浓度为10ng/μL时Cq值的RSD为0.39％，DNA浓度为1ng/μL时Cq值的RSD为0.43％，DNA浓度为0.1ng/μL时Cq值的RSD为0.30％，试验结果表明该方法在重复性良好。
实施例5样品中鼠李糖乳杆菌X253的定性检测
将鼠李糖乳杆菌X253菌株培养至108CFU/mL，以市场上购买的复合菌种乳酸菌发酵乳作为基质，对鼠李糖乳杆菌X253菌体进行梯度稀释，稀释浓度依次为107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL；其中，原复合菌种乳酸菌发酵乳中含有植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌；
每个稀释度的发酵乳样品取2mL，1000rpm，离心5min，除去样品中的蛋白及脂质等杂质；
取离心后上清液1mL，转移至新的EP管，12000rpm离心10min，收集沉淀即为菌体；使用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取菌体DNA，以该DNA为模板进行qPCR扩增，以无菌水作为空白对照，qPCR的条件同实施例4所述，扩增时引物对和探针采用实施例3选定的引物组合物，每个浓度重复3次。
不同稀释度发酵乳qPCR图如图3所示，鼠李糖乳杆菌X253浓度为103-107CFU/mL的待测样Cq值均＜35，可判定鼠李糖乳杆菌X253为阳性。本发明建立的实时荧光定量qPCR的检测方法抗干扰能力较强，在添加其它菌种及基质后仍然是可行的，能够实现模拟样品的定性检测。
实施例6样品中鼠李糖乳杆菌X253的定量检测
S1.标准曲线的制作
取浓度为108CFU/mL的鼠李糖杆菌X253的菌液标准品，进行梯度稀释后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取DNA，并将提取的DNA作为模板进行qPCR；
qPCR的条件同实施例3所述，扩增时引物对和探针采用实施例2选定引物组合物，每个浓度重复3次；
将qPCR扩增得到的Cq值进行线性拟合，以平均Cq值为Y轴，模拟样品的不同稀释倍数的对数值为X轴，建立标准曲线，如图4所示，其线性方程为y＝-3.433x+46.32，R2＝0.9993。
S2.样品中鼠李糖乳杆菌X253的定量测定
称取含有鼠李糖乳杆菌X253与动物双岐乳双歧亚种Bb12的复合菌粉0.1g，加入10mL纯化水，1000rpm转速下离心5min；
取离心后上清液1mL，转移至新的EP管，12000rpm离心10min，收集的沉淀即为菌体；使用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取菌体DNA，以该DNA为模板进行qPCR扩增，以无菌水作为空白对照，qPCR的条件同实施例4所述，扩增时引物对和探针采用实施例2选定引物组合物，每个浓度重复3次，扩增结果如图5所示。
经计算，根据荧光定量qPCR仪输出结果，所测样品Cq均值为25.18，带入标准曲线拟合方程，求得复合菌粉中鼠李糖乳杆菌X253的细菌数量为1.45×109CFU/g。结果表明建立的方法适用于含有大量低聚糖及辅料的菌粉样品。
本发明提供的检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物可用于但不限于对菌粉中对鼠李糖乳杆菌X253的定性定量测定。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (4)
1.一种检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括引物对和探针；
所述引物对，上游引物的核苷酸序列为：ggttggtcgtttgccttatca；
下游引物的核苷酸序列为：ttcagtatccaccagcccacta；
所述探针的核苷酸序列为：actggcccatgctt。
2.根据权利要求1所述的一种检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物的应用，其特征在于，所述引物组合物在定性和/或定量检测鼠李糖乳杆菌X253中的应用。
3.根据权利要求2所述的检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物的应用，其特征在于，所述定性检测鼠李糖乳杆菌X253的方法为：收集样品菌体、提取样品DNA、qPCR扩增、分析、判定；
所述判定的标准包括，qPCR扩增产物起峰且Cq值<35，则样品中鼠李糖乳杆菌X253检测结果为阳性。
4.根据权利要求2所述检测鼠李糖乳杆菌X253的引物组合物的应用，其特征在于，所述定量检测鼠李糖乳杆菌X253的方法包括依次进行的以下步骤：
S1.标准曲线的制作
取鼠李糖杆菌X253菌液标准品，梯度稀释，提取菌液标准品DNA作为模板进行qPCR扩增，线性拟合，建立标准曲线；
S2.样品中鼠李糖乳杆菌X253的定量测定
收集含鼠李糖乳杆菌X253的样品，提取DNA作为模板进行qPCR扩增，对照步骤S1建立的标准曲线，获得样品中鼠李糖乳杆菌X253浓度；
其中，步骤S1和步骤S2中所述qPCR扩增采用权利要求1所述的引物组合物。
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