CN116121415A - 一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量pcr试剂盒、应用及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法。所述多重荧光PCR体系包括3组引物探针组合：青春双歧杆菌引物对及探针、动物双歧杆菌引物对及探针和两歧双歧杆菌引物对及探针，其序列依次为SEQ ID No.1～9。所述引物探针组合仅对各自双歧杆菌菌种的目标片段进行特异性扩增，不会对其他菌种进行非特异性扩增，检测时间短、操作简单、结果可靠，适用于益生菌制品中青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌成分快速检验。

Description

一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法。

背景技术

双歧杆菌(Bifidobacterium)是一类广泛存在于人和禽畜肠道的益生菌，厌氧生长、无孢子形成，与维护肠道微生物平衡、提高机体免疫力、维持宿主健康密切相关。医学上，常用于急慢性腹泻、各种肠炎及肠道菌群失调症的防治、用于炎症性肠病的辅助用药。常见用于益生菌组分的双歧杆菌包括动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等等。经过多年的研究发现，动物双歧杆菌对婴幼儿的营养和预防肠道疾病具有重要作用；青春双歧杆菌则可治疗慢性腹泻、便秘，还有显著的抗衰老作用；两歧双歧杆菌对于治疗肠道炎症以及消化系统紊乱具有独特的效果。

市面上的益生菌制品是指含有大量益生菌的活菌制剂，或者含有其代谢产物或(和)促进生长因子的产品。以由于受到研发生产技术的限制，益生菌制品市场存在产品质量参差不齐的状况。由于缺乏有效的益生菌鉴定技术手段及监管措施，市售益生菌制品存在如益生菌标识与实际使用菌株不一致等现象。因此，急需建立一种能够准确快速鉴别多种益生菌的方法，用以应满足大规模摸底筛查和现场检测的需要。

实时荧光PCR技术是近年来得到广泛应用的快速核酸检测技术，具有灵敏度高、检测周期短、特异性强等优点。目前，常规检测大多使用的是单重实时荧光定量PCR，可同时检测多个目的基因的检测体系较少。然而无论是在常规食品抽检，还是在应对突发和重大食品安全事故中，都需要进行大规模快速检测。因此建立一种可以同时检测多种双歧杆菌的荧光定量PCR体系并开发成试剂盒，具有非常重要的实践意义和实用价值。

细菌16S是用于菌种鉴定的最常用基因序列，但是由于乳杆菌属内许多种的16SrDNA基因序列具有较高同源性，利用该基因仅能鉴定到属而无法准确到种。鉴于此，本发明对青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌共有的热休克蛋白-60(HSP-60)基因部分序列构建系统发育树并进行比对分析，设计种间特异性引物，采用多重荧光定量PCR技术，通过单一体系成功将三者区分开来，从而实现准确快速鉴别三种双歧杆菌的目的。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒、应用及检测方法的技术方案。

本发明具体采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组，所述探针引物组包含分别针对青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和两歧双歧杆菌的热休克蛋白-60(HSP-60)基因的引物对与探针；

其中，针对青春双歧杆菌HSP-60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.1所示的Badol_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.2所示的Badol_hsp60_R，探针为序列如SEQID No.3所示的Badol_hsp60_P；

针对动物双歧杆菌HSP-60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.4所示的Banim_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.5所示的Banim_hsp60_R，探针为序列如SEQ IDNo.6所示的Banim_hsp60_P；

针对两歧双歧杆菌HSP-60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.7所示的Bbifi_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.8所示的Bbifi_hsp60_R，探针为序列如SEQ IDNo.9所示的Bbifi_hsp60_P。

进一步，所述青春双歧杆菌HSP-60基因的探针序列5’端修饰有FAM，所述动物双歧杆菌HSP-60基因的探针序列5’端修饰有HEX，所述两歧双歧杆菌HSP-60基因的探针序列5’端修饰有ROX；所有探针的3’端均修饰有BHQ1。

本发明第二方面提供了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。

进一步，该试剂盒包括反应液A、反应液B和反应液C；反应液A为2×PCR Mix，包含：Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、pH 8.3的Tris-HCl 20mM、MgCl₂ 4mM、KCl 100mM、BSA 2mg/mL；反应液B为Primer Mix，包括三种双歧杆菌的引物Badol_hsp60_F、Badol_hsp60_R、Banim_hsp60_F、Banim_hsp60_R、Bbifi_hsp60_F和Bbifi_hsp60_R，各自浓度为1.7nM；反应液C为Probe Mix，包括探针Badol_hsp60_P、Banim_hsp60_P、Bbifi_hsp60_P，各自浓度为3.3nM。

进一步，该试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为DEPC水，所述阳性对照为根据青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和两歧双歧杆菌目的基因构建的质粒按照1:1:1比例的混合物。

本发明第三方面提供了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测方法，其包括以下步骤：

1)提取待测样本的基因组DNA备用；

2)将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增，PCR反应体系包括如权利要求3-5所述的PCR试剂盒；

3)收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号分析判断是否存在上述三种双歧杆菌。

进一步，所述步骤2)中PCR反应体系具体包括反应液A12.5μL，反应液B 6μL，反应液C 3μL，加入50ng DNA模板，补水至25μL；

PCR程序为按照95℃10s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，40个循环程序进行荧光定量PCR反应；每个循环结束收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过待测样本中某一通道基因的Ct值及扩增曲线进行阳性判断。

进一步，所述步骤3)中判断标准为：

a)若待测样本某基因通道扩增有扩增曲线，且Ct值≤35，则判断待测样本含有该种双歧杆菌；

b)若待测样本某基因通道没有扩增曲线，且Ct值＞35，则判断待测样本不含有该种双歧杆菌；

c)若待测样本某基因通道有扩增曲线，且35＜Ct＜40，则判断为不确定样本，需要对样品进行复测。

本发明第四方面提供了上述引物探针组以及上述试剂盒在以下任意一种中的应用：

(a)检测青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌中至少一种双歧杆菌；

(b)制备用于(a)检测的试剂盒或产品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的多重荧光定量PCR引物探针组合具有很高的特异性，仅对各自菌种的目标片段进行特异性扩增，不会对其他菌种进行非特异性扩增。同时，使用本发明的多重荧光定量PCR检测方法可以一次性检测青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌三个双歧杆菌菌种，极大的提高了检测效率，降低了检测成本；

(2)本发明所涉及方法能快速对青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌三个双歧杆菌菌种进行鉴定，优化了特定PCR反应体系及反应程序，PCR过程仅需45min，特别适用于益生菌制品大规模摸底排查和快速检测的实际应用。

(3)本发明试剂盒组分和配比合理，操作简单、使用方便，最大程度上减少交叉污染。

附图说明

图1为青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌三种双歧杆菌同时阳性扩增曲线。

图2为(A)青春双歧杆菌阳性扩增曲线、(B)动物双歧杆菌阳性扩增曲线、(C)两歧双歧杆菌阳性扩增曲线、(D)空白对照及长双歧杆菌、婴儿双栖杆菌、短双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及嗜酸乳杆菌扩增曲线；

图3为三种双歧杆菌多重荧光定量PCR灵敏度试验；

图4为三种双歧杆菌多重荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：特异性引物探针组合的设计

下载Genebank数据库中青春双歧杆菌(AF210319.2)、动物双歧杆菌(AY004282.2)、两歧双歧杆菌(KY629959.1)的HSP60基因序列，使用Vector NTI软件中AlignX方法比对分析三种双歧杆菌的靶基因序列，选择差异较大的区域作为靶点设计特异性引物及探针，使用NCBI网页PrimerBLAST工具搜索确认所设引物及探针在所有菌种中的特异性。在满足引物和探针设计原则的前提下，确保扩增片段在200bp以内。经过一系列前期筛选，引物和探针筛选结果如下所示：

(1)青春双歧杆菌特异性引物对及探针

上游引物Badol_hsp60_F：5’-CAAGGCCAAGGACGACGTCAA-3’(SEQ ID NO.1所示)；

下游引物Badol_hsp60_R：5’-CAGGCCCTGGCCGTCAG-3’(SEQ ID NO.2所示)；

荧光探针Badol_hsp60_P：

5’-FAM-ACGCTGGCCTGTCCGGCGACGTGGTGATC–BHQ1 -3’(SEQ ID NO.3所示)；

(2)动物双歧杆菌特异性引物对及探针

上游引物Banim_hsp60_F：5’-GAAAAGGTTGAGAAGGACTTCAACC-3’(SEQ ID NO.4所示)；

下游引物Banim_hsp60_R：5’-GAAGCCCTCACCCTCAG-3’(SEQ ID NO.5所示)；

荧光探针Banim_hsp60_P：5’-HEX-ATGCAGGTCTCTCTGGCGCCGTGGTGATCG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.6所示)；

(3)两歧双歧杆菌特异性引物对及探针

上游引物Bbifi_hsp60_F：5’-AAGAAGGCCGAGTCCGCAGAA-3’(SEQ ID NO.7所示)；

下游引物Bbifi_hsp60_R：5’-TGACCCTCCGGCAGCTCG-3’(SEQ ID NO.8所示)；

荧光探针Bbifi_hsp60_P：5’-ROX-GAACTCCGGCGTGTCCGGTGACGTGGTGTTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.9所示)。

实施例2：用于快速鉴别青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒的建立

用于快速鉴别青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括反应液A、反应液B、反应液C、阳性对照、阴性对照、说明书和盒体。

反应液A为2×PCR Mix，组分包含：Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、Tris-HCl(pH 8.3)20mM、MgCl₂ 4mM、KCl 100mM、BSA 2mg/mL；反应液B为Primer Mix,包含三种双歧杆菌的引物Badol_hsp60_F、Badol_hsp60_R、Banim_hsp60_F、Banim_hsp60_R、Bbifi_hsp60_F和Bbifi_hsp60_R,各自浓度为1.7nM；反应液C为Probe Mix，包含探针Badol_hsp60_P、Banim_hsp60_P、Bbifi_hsp60_P,各自浓度为3.3nM。所述阳性对照为根据青春双歧杆菌、动物双歧杆菌以及两歧双歧杆菌的HSP60基因片段构建的质粒按照1：1：1比例的混合物，质粒浓度为1.0ng/μL，对应的Ct值在20左右。所述的阴性对照为DEPC水。

实施例3：多重荧光定量PCR反应体系构建

1)提取待测样品DNA(细菌基因组DNA提取试剂盒或者公认的、具有相同效力的其他提取方法)，-20℃保存备用。

2)经过对多重荧光定量PCR反应体系的条件优化，最终的反应总体系25μL如下：反应液A12.5μL，反应液B 6μL，反应液C 3μL，样品DNA模板50ng，其余用水补足。反应条件为95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，72℃10s，共40个循环。

3)结果判断：若待测样本某基因通道扩增有扩增曲线，且Ct值≤35，则判断待测样本含有该种双歧杆菌；b)若待测样本某基因通道没有扩增曲线，且Ct值＞35，则判断待测样本不含有该种双歧杆菌；c)若待测样本某基因通道有扩增曲线，且35＜Ct＜40，则判断为不确定样本，需要对样品进行复测。

实施例4：多重荧光定量PCR检测体系特异性验证

为了验证本发明所构建的多重荧光定量PCR检测体系的特异性，提取青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双栖杆菌、短双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及嗜酸乳杆菌的细菌基因组DNA，作为PCR反应模板对构建的多重荧光定量PCR检测体系进行特异性验证。

DNA提取、PCR反应体系及反应条件与实施例3相同。多重荧光定量PCR检测体系阳性对照结果如图1所示，可以看到FAM、HEX或ROX通道均有扩增曲线；特异性验证结果如图2所示，(A)青春双歧杆菌、(B)动物双歧杆菌及(C)两歧双歧杆菌分别只在对应的荧光通道有扩增曲线；(D)空白对照以及长双歧杆菌、婴儿双栖杆菌、短双歧杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及嗜酸乳杆菌的在上述三个通道均未有扩增曲线。这表明本发明的多重荧光定量PCR检测体系具有较高的特异性。

实施例5：多重荧光定量PCR检测体系灵敏度验证

取(A)青春双歧杆菌、(B)动物双歧杆菌及(C)两歧双歧杆菌的基因组DNA，用微量紫外分光光度计测定其浓度，并按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×10⁰～1.0×10^-6ng/μL浓度的DNA作为PCR模板，用本发明试剂盒和方法检测。

结果如图3所示，本试剂盒对(A)青春双歧杆菌、(B)动物双歧杆菌及(C)两歧双歧杆菌的最低检出浓度为1.0×10^-5ng/μL；根据Ct值平均值构建的标准曲线如图4所示，三种双歧杆菌的标准曲线斜率分别为2.65、3.15和2.35，相关系数R²均大于0.99。

以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和特征，结果表明本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高的特点，适合用于益生菌制品中青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌的快速检测。

Claims (9)

1.同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组，其特征在于：所述探针引物组包含分别针对青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和两歧双歧杆菌的热休克蛋白-60(HSP-60)基因的引物对与探针；

其中，针对青春双歧杆菌HSP-60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.1所示的Badol_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.2所示的Badol_hsp60_R，探针为序列如SEQ IDNo.3所示的Badol_hsp60_P；

针对动物双歧杆菌HSP-60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.4所示的Banim_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.5所示的Banim_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.6所示的Banim_hsp60_P；

针对两歧双歧杆菌HSP-60基因的上游引物为序列如SEQ ID No.7所示的Bbifi_hsp60_F，下游引物为序列如SEQ ID No.8所示的Bbifi_hsp60_R，探针为序列如SEQ ID No.9所示的Bbifi_hsp60_P。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述青春双歧杆菌HSP-60基因的探针序列5’端修饰有FAM，所述动物双歧杆菌HSP-60基因的探针序列5’端修饰有HEX，所述两歧双歧杆菌HSP-60基因的探针序列5’端修饰有ROX；所有探针的3’端均修饰有BHQ1。

3.一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。

4.如权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于：包括反应液A、反应液B和反应液C；反应液A为2×PCR Mix，包含：Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、pH 8.3的Tris-HCl 20mM、MgCl₂ 4mM、KCl 100mM、BSA 2mg/mL；反应液B为Primer Mix，包括三种双歧杆菌的引物Badol_hsp60_F、Badol_hsp60_R、Banim_hsp60_F、Banim_hsp60_R、Bbifi_hsp60_F和Bbifi_hsp60_R，各自浓度为1.7nM；反应液C为Probe Mix，包括探针Badol_hsp60_P、Banim_hsp60_P、Bbifi_hsp60_P，各自浓度为3.3nM。

5.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于：还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为DEPC水，所述阳性对照为根据青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和两歧双歧杆菌目的基因构建的质粒按照1:1:1比例的混合物。

6.一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取待测样本的基因组DNA备用；

2)将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增，PCR反应体系包括如权利要求3-5所述的PCR试剂盒；

3)收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号分析判断是否存在上述三种双歧杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR反应体系具体包括反应液A12.5μL，反应液B 6μL，反应液C 3μL，加入50ng DNA模板，补水至25μL；

PCR程序为按照95℃10s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，40个循环程序进行荧光定量PCR反应；每个循环结束收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过待测样本中某一通道基因的Ct值及扩增曲线进行阳性判断。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中判断标准为：

a)若待测样本某基因通道扩增有扩增曲线，且Ct值≤35，则判断待测样本含有该种双歧杆菌；

b)若待测样本某基因通道没有扩增曲线，且Ct值＞35，则判断待测样本不含有该种双歧杆菌；

c)若待测样本某基因通道有扩增曲线，且35＜Ct＜40，则判断为不确定样本，需要对样品进行复测。

9.根据权利要求1-2任一所述的引物探针组以及权利要求3-5任一所述的试剂盒在以下任意一种中的应用：

(a)检测青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌中至少一种双歧杆菌；

(b)制备用于(a)检测的试剂盒或产品。

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