CN111139308A

CN111139308A - 引物对及其应用以及特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN111139308A
Application number: CN202010111292.1A
Authority: CN
Inventors: 金君华; 任培豪; 张红星; 谢远红; 刘慧�
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2020-05-12

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及引物对及其应用以及特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒和方法。该引物对包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。通过上述技术方案，本发明实现了对动物双歧杆菌的定性和定量鉴定，且本发明提供的引物对和试剂盒能够特异性地检测动物双歧杆菌，为动物双歧杆菌的进一步研究提供了技术支持。

Description

引物对及其应用以及特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种引物对，该引物对在特异性检测动物双歧杆菌中的应用，一种用于特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒，以及一种定性或定量检测待测样本中动物双歧杆菌的方法。

背景技术

1986年版伯杰氏细菌学鉴定手册将双歧乳杆菌属分为24种。而目前随着分子生物学的发展，细菌分类学发生了显著的变化，从基因水平对细菌种类的鉴定成为最精准可靠的办法，根据DNA的同源性鉴定，双歧杆菌达到32种之多。

动物双歧杆菌是人和许多哺乳动物肠道中的优势菌之一，1899年法国巴斯德研究院的蒂瑟尔(Tissier)首次从母乳喂养的婴儿大便中分离到了该菌，并指出它对乳儿的营养和预防肠道疾病具有重要作用。该菌是人和动物肠道中重要的生理性细菌。参与免疫、营养、消化和保护等一系列的生理过程，发挥着重要的功能。

目前已经有多位学者成功设计了特异性引物对以对目标菌属以及菌种进行了鉴定，如乳杆菌属、梭菌属、普雷沃菌属、拟杆菌属、短双歧杆菌菌种、鼠李糖乳杆菌种。但尚无针对动物双岐菌种进行特异性鉴定。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中尚无针对动物双岐菌种进行特异性鉴定的缺陷，提供一种用于特异性鉴定动物双歧杆菌的引物对，该引物对在特异性检测动物双歧杆菌中的应用，一种用于特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒，以及一种定性或定量检测待测样本中动物双歧杆菌的方法。本发明提供的引物对能够特异性地对动物双歧杆菌进行鉴定。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种引物对，该引物对包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。

本发明第二方面提供了如上所述的引物对在特异性检测动物双歧杆菌中的应用。

本发明第三方面提供了一种用于特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒，所述试剂盒含有PCR扩增试剂和引物对，所述引物对为如上所述的引物对。

本发明第四方面提供了一种定性检测待测样本中动物双歧杆菌的方法，该方法包括：在能够进行PCR扩增的条件下，使用如上所示的引物对对所述待测样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，并对所述扩增产物进行电泳；

若出现目标条带，则判断所述待测样本中存在动物双歧杆菌，若未出现目标条带，则判断所述待测样本中不存在动物双歧杆菌。

本发明第五方面提供了一种定量检测待测样本中动物双歧杆菌的方法，该方法包括：在能够进行PCR扩增的条件下，使用如上所示的引物对对所述待测样品进行实时定量PCR检测，进而获得所述待测样本中动物双歧杆菌的含量。

通过上述技术方案，本发明实现了对动物双歧杆菌的定性和定量鉴定，且本发明提供的引物对和试剂盒能够特异性地检测动物双歧杆菌，为动物双歧杆菌的进一步研究提供了技术支持。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

图1为使用本发明引物对和参照引物对对A12进行扩增的电泳图；其中，M为MAKER，分子量由上到下为最大到最小，大小为500bp-50bp；泳道1、2、3、4、5、6、7、8、a、b、c、d、e、f、g、h、i为对应编号的引物对。

图2为使用本发明引物对h和参照引物对a、b、f对不同乳酸菌进行扩增的电泳图；其中，M为MAKER，分子量由上到下为最大到最小，大小为500bp-50bp，泳道1为动物双岐杆菌A12，泳道2为长双歧杆菌Y13，泳道3为齿双歧杆菌T19，泳道4为两歧双歧杆菌0314，泳道5为H₂O。

图3为本发明提供的引物对h对不同乳酸菌进行扩增的电泳图；其中，M为MAKER，大小由上到下最大和最小为500bp-50bp；泳道1为动物双歧杆菌A12，泳道2为长双歧杆菌Y6，泳道3为长双歧杆菌Y13，泳道4为长双歧杆菌Y16，泳道5为长双歧杆菌Y17，泳道6为齿双歧杆菌T6，泳道7为齿双歧杆菌T11，泳道8为齿双歧杆菌T13，泳道9为齿双歧杆菌T16，泳道10为齿双歧杆菌T19，泳道11为两歧双歧杆菌0305，泳道12为两歧双歧杆菌0314，泳道13为两歧双歧杆菌0320，泳道14为两歧双歧杆菌0325，泳道15为两歧双歧杆菌0326，泳道16为植物乳杆菌YMA13，泳道17为植物乳杆菌YXB26，泳道18为植物乳杆菌YA11，泳道19为植物乳杆菌YDA13，泳道20为植物乳杆菌Zhang-LL，泳道21为植物乳杆菌M11-4，泳道22为植物乳杆菌M18-6，泳道23为鼠李糖杆菌LGG。

图4为在NCBI中对本发明提供的引物对h进行特异性检测的结果。

图5为采用本发明提供的引物对h对动物双歧杆菌进行实时荧光定量PCR所绘制以样品DNA所对应菌落的对数值和Ct值的标准曲线。

图6为采用本发明提供的引物对h在混合体系中对动物双歧杆菌检测区间的测定图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供一种引物对，该引物对包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。

根据本发明，本发明以动物双歧杆菌A12(Bifidobacterium animalis A12)(该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17308)为动物双歧的代表菌株，从而设计了如上的引物对。

根据本发明，已知序列的引物对的合成方法为本领域技术人员所公知，例如可以委托专门的公司(如Invitrogen公司)合成得到，故在此不再赘述。

第二方面，本发明提供了如上所述的引物对在特异性检测动物双歧杆菌中的应用。

根据本发明，当所述引物对用于动物双歧杆菌的特异性检测时，其扩增片段的长度为179bp。

根据本发明，所述动物双歧杆菌优选为动物双歧杆菌A12(Bifidobacteriumanimalis A12)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17308。

第三方面，本发明提供了一种用于特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒，所述试剂盒含有PCR扩增试剂和引物对，所述引物对为如上所述的引物对。

根据本发明，考虑到进行PCR扩增之前还需要进行DNA的提取操作，优选情况下，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。所述DNA提取试剂可以为本领域常规使用的各种用于提取DNA的试剂，例如可以包括Tris-SDS、Tris-饱和酚、酚/仿/异丙醇(25:24:1)、RNase、异丙醇和乙酸钠等。另外，上述各个DNA提取试剂的浓度也可以为本领域常规使用的浓度。

本发明中，只要所述引物对为上述引物对即可实现本发明的目的，PCR扩增试剂是指能使引物和模板发生PCR扩增所用的常规的试剂，对所述PCR扩增试剂没有特殊限定，例如，所述PCR扩增试剂可以包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs，且在所述PCR扩增试剂中，以上各物质的种类和浓度为本领域常规使用的种类和浓度，且均可以通过商购获得。

具体的，所述PCR扩增试剂也可以根据实际的检测需求而进行设定，例如，当进行动物双歧杆菌的定性检测时，所述PCR扩增试剂可以为DNA聚合酶，PCR反应缓冲液、MgCl₂和dNTPs，这些成分可以单独的存在于所述试剂盒中，也可以以Mix的形式存在，其中，在Mix中，各组分的浓度可以为本领域常规使用的浓度，例如，其可以为购自塔克拉生物公司货号为B500010的Mix；当进行动物双歧杆菌的定量检测时，所述PCR扩增试剂可以为荧光定量PCR常规使用的试剂，例如，除了上述成分外，还含有用于荧光定量染料，例如，SYBR Green，同样的，这些成分可以单独的存在于所述试剂盒中，也可以以Mix的形式存在，其中，在Mix中，各组分的浓度可以为本领域常规使用的浓度，例如，其可以为购自塔克拉生物公司货号为RR820L的Mix。

第四方面，本发明提供了一种定性检测待测样本中动物双歧杆菌的方法，该方法包括：在能够进行PCR扩增的条件下，使用如上所示的引物对对所述待测样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，并对所述扩增产物进行电泳；

如上所述的，所述目标条带的大小为179bp。

根据本发明，所述电泳可以为琼脂糖凝胶电泳，对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

根据本发明，在进行待测样本中动物双歧杆菌的定性检测时，优选的，该方法还包括设置阳性对照(例如，动物双歧杆菌A12)，以及阴性对照(如以蒸馏水)，如果阳性对照出现目标条带，而阴性对照不出现目标条带，则认为扩增有效，如果阳性对照不出现条带或者阴性对照出现目标条带，则认为扩增无效，需要重新进行扩增。

第五方面，本发明提供了一种定量检测待测样本中动物双歧杆菌的方法，该方法包括：在能够进行PCR扩增的条件下，使用如上所示的引物对对所述待测样品进行实时定量PCR检测，进而获得所述待测样本中动物双歧杆菌的含量。

根据本发明，所述定量检测时，所述待测样本中动物双歧杆菌的含量优选在10⁵-10¹⁰CFU/g之间，在该优选的情况下，能够对样本中的动物双歧杆菌更加精准的定量。

根据本发明，在第四方面和第五方面中，所述PCR扩增的条件可以为常规的PCR扩增条件，优选的，先将PCR扩增体系在93-95℃下预变性2-5min；然后在如下的程序下进行30-40次循环：93-95℃变性25-35s，57-58.5℃退火8-12s，70-75℃延伸18-22s；最后70-75℃延伸3-10min。更为优选的，先将PCR扩增体系在93.5-94.5℃下预变性2.5-3.5min；然后在如下的程序下进行30-40次循环：93.5-94.5℃变性28-32s，57.5-58℃退火9-11s，71-73℃延伸19-21s；最后71-73℃延伸4-6min。最为优选的，先将PCR扩增体系在94℃下预变性3min；然后在如下的程序下进行35次循环：94℃变性28-32s，57.6℃退火10s，72℃延伸20s；最后72℃延伸5min。

根据本发明，在第四方面和第五方面中，对所述待测样品进行PCR扩增的扩增体系可以为常规PCR扩增体系，例如，可以为20μL体系、25μL体系或50μL体系。优选的，以20μL所述扩增体系计，待测样本的量为0.5-1.5μL，SEQ ID NO:1所示的正向引物的量为0.5-1.5μL，SEQ ID NO:2所示的反向引物的量为0.5-1.5μL，DNA聚合酶预混液的量为8-12μL。进一步优选的，以20μL所述扩增体系计，待测样本的量为0.8-1.2μL，SEQ ID NO:1所示的正向引物的量为0.8-1.2μL，SEQ ID NO:2所示的反向引物的量为0.8-1.2μL，DNA聚合酶预混液的量为9-11μL。最为优选的，以20μL所述扩增体系计，待测样本的量为1μL，SEQ ID NO:1所示的正向引物的量为1μL，SEQ ID NO:2所示的反向引物的量为1μL，DNA聚合酶预混液的量为10μL。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中：

动物双歧杆菌A12(CGMCC No.17308)来自CN 110604749A；

长双歧杆菌Y13(实验室分离并鉴定)

长双歧杆菌Y6(实验室分离并鉴定)

长双歧杆菌Y16(实验室分离并鉴定)

长双歧杆菌Y17(实验室分离并鉴定)

齿双歧杆菌T6(实验室分离并鉴定)

齿双歧杆菌T11(实验室分离并鉴定)

齿双歧杆菌T13(实验室分离并鉴定)

齿双歧杆菌T16(实验室分离并鉴定)

齿双歧杆菌T19(实验室分离并鉴定)

两歧双歧杆菌0314(实验室分离并鉴定)

两歧双歧杆菌0305(实验室分离并鉴定)

两歧双歧杆菌0320(实验室分离并鉴定)

两歧双歧杆菌0325(实验室分离并鉴定)

两歧双歧杆菌0326(实验室分离并鉴定)

植物乳杆菌YMA13(实验室分离并鉴定)

植物乳杆菌YXB26(实验室分离并鉴定)

植物乳杆菌YA11(实验室分离并鉴定)

植物乳杆菌YDA13(实验室分离并鉴定)

植物乳杆菌Zhang-LL(实验室分离并鉴定)

植物乳杆菌M11-4(CGMCC No.16200)

植物乳杆菌M18-6(CGMCC No.16199)

鼠李糖乳杆菌LGG(ATCC No.53103)

基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号DP302-02。

实施例1

本实施例用于说明本发明引物对和参照引物对对A12的特异性

委托生工生物工程有限公司合成如表1所示的各引物对。

表1

注：引物对1-4，a-c以片段A12基因组片段797387-797592(SEQ ID NO:35)为基础进行设计；引物对5-6，d-f以片段A12基因组片段906813-907001(SEQ ID NO:36)为基础进行设计；引物对7-8，g-i以片段A12基因组片段1106489-1106833(SEQ ID NO:37)为基础进行设计。

使用如上的引物对对A12的基因组DNA进行扩增，扩增体系20ul，DNA模板1μl，ddH₂O 7μl，上下游引物各1μl，E_XTaq酶Mix(购自塔克拉生物公司，货号B500010)10μl；反应条件为94℃预变性3min，94℃变形30s，57.6℃退火10s，72℃延伸20s，35次循环，72℃延伸5min，检测A12是否进行特异性扩增，结果如图1所示。

由图1可以看出，引物对a、b、f、h引物表现出了良好的特异性。

实施例2

本实施例用于说明引物对h和参照引物对a、b、f对不同乳酸菌的特异性

分别以动物双岐杆菌A12，长双歧杆菌Y13，齿双歧杆菌T19，两歧双歧杆菌0314的基因组DNA为模板，按照实施例1的扩增条件和扩增体系使用引物对a、b、f、h进行PCR扩增，结果如图2所示。

由图2可以看出，与不同种的双歧杆菌进行定性检测，经检测只有本发明的引物对h表现出良好的特异性，其余引物都出现了不同程度的非特异性扩增。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的引物对的特异性

分别以动物双歧杆菌A12、长双歧杆菌Y13、长双歧杆菌Y6、长双歧杆菌Y16、长双歧杆菌Y17、齿双歧杆菌T6、齿双歧杆菌T11、齿双歧杆菌T13、齿双歧杆菌T16、齿双歧杆菌T19、两歧双歧杆菌0314、两歧双歧杆菌0305、两歧双歧杆菌0320、两歧双歧杆菌0325、两歧双歧杆菌0326、植物乳杆菌YMA13、植物乳杆菌YXB26、植物乳杆菌YA11、植物乳杆菌YDA13、植物乳杆菌Zhang-LL、植物乳杆菌M11-4、植物乳杆菌M18-6和鼠李糖乳杆菌LGG的基因组DNA为模板，按照实施例1的扩增条件和扩增体系使用引物对h进行PCR扩增，结果如图3所示。

由图3可以看出，经过检测发现仅有动物双岐A12出现了特异性扩增，其余菌株均未出现特异性扩增。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的引物对对动物双歧杆菌特异性的进一步验证

在NCBI中进行引物对h的特异性检测，结果如图4(图4-1至图4-7)所示。

由图4可以看出，引物对h仅在动物双歧杆菌菌种之间存在扩增，在其它菌株中不存在扩增，进一步对引物对h进行了验证。

实施例5

本实施例用于说明引物对h扩增效率的计算

通过荧光定量PCR对目标引物对h进行进一步的检测，通过对A12基因组进行梯度稀释，进行定量PCR以进行扩增效率的测定，反应体系为20μl，模板1μl，TBGreenII Mix(购自塔克拉生物公司货号RR820L)10μl，上下游引物各1μl，ddH₂O 6.6μl，ROXII(购自塔克拉生物公司货号RR820L，ROX Reference Dye II。)0.4μl；反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，57.6℃退火30s，72℃延伸30s，45个循环，检测SYBR Green信号，以样品DNA所对应菌落的对数值和Ct值绘制标准曲线，计算扩增效率，结果如图5所示。

由图5可以看出，经过定量检测，通过数据处理得到回归方程为Y＝-3.320X+42.550，斜率为-3.32，相关系数为0.9987，扩增效率计算为100.1，完全符合定量检测标准。

实施例6

本实施例用于说明混合体系动物双歧杆菌检测区间的确定

取0.3g小鼠粪便加入3mL厌氧稀释液(配方：KH₂PO₄4.5g，Na₂HPO₄·12H₂O6.0g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，吐温-80 0.5g，加蒸馏水1000mL,调pH7.4～7.6，溶解后121℃灭菌15min)，制成粪便悬浊液，将活化后的菌体按梯度稀释成10⁴～10⁹CFU/mL，与粪便悬浊液混合，提取基因组，通过荧光定量PCR确定其检测区间，结果如图6所示。

由图6可以看出，经检测确定混合体系中动物双歧杆菌的检测区间为10⁵～10⁹CFU/mL菌体，当菌体浓度低于10⁵CFU/mL看做体系中不含有动物双歧杆菌，完全满足定量检测。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京农学院

<120> 引物对及其应用以及特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒和方法

<130> I61409NXY

<160> 37

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> h上游引物

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cgctcaagca ctgcaatcac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> h下游引物

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<212> DNA

<213> 1-上游引物

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<211> 19

<212> DNA

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<212> DNA

<213> 2-上游引物

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<212> DNA

<213> 2-下游引物

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gacaacagat actcgctact 20

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<212> DNA

<213> 3-上游引物

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agggaaccaa tctcatcaa 19

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<212> DNA

<213> 3-下游引物

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taagcagaac caccgatgt 19

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<212> DNA

<213> 4-上游引物

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ctcgggaggg aaccaatc 18

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<212> DNA

<213> 4-下游引物

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gacaacagat actcgctact 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 5-上游引物

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ccgatgcctg atcttgac 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 5-下游引物

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cgtttgcctt ccgtctta 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 6-上游引物

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ccgatgcctg atcttgac 18

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<212> DNA

<213> 6-下游引物

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gtcgtttgcc ttccgtct 18

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<212> DNA

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tccagattgt tcgcttgtt 19

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<212> DNA

<213> 7-下游引物

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<211> 20

<212> DNA

<213> 8-上游引物

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tttccagatt gttcgcttgt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 8-下游引物

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<211> 20

<212> DNA

<213> a-上游引物

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<212> DNA

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acagtgtagc caccaagacg 20

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<211> 20

<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> c-上游引物

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<212> DNA

<213> c-下游引物

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<212> DNA

<213> d-上游引物

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<212> DNA

<213> d-下游引物

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<212> DNA

<213> e-上游引物

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<212> DNA

<213> e-下游引物

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tacagggtat ccatgcacgc 20

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<212> DNA

<213> f-上游引物

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atatgcctac ggtgtctgcg 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> f-下游引物

<400> 30

tgccaagtcg ttttccaatg c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> g-上游引物

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gtcgcatcgg tgtcgtctta 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> g-下游引物

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gctcgggcga tttgtgaaaa 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> i-上游引物

<400> 33

gctcaagcac tgcaatcaca 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> i-下游引物

<400> 34

tgcccgatcg ctgattatgt 20

<210> 35

<211> 205

<212> DNA

<213> A12基因组片段797387-797592

<400> 35

cagcgatcgg ttgtcctccc ctcgggaggg aaccaatctc atcaatgccg tccgttcgtc 60

atctgcctct gccatgttcg ttcctcacgc ctgcgcatcc atattccgtt gcaatgctag 120

tcgaagagca tgatggacac accatagcgt cgaacatttg ttcgaattcg tcttggtggc 180

tacactgttg tctatgagcg atgac 205

<210> 36

<211> 189

<212> DNA

<213> A12基因组片段906813-907001

<400> 36

gctcctgagg ccgatgcctg atcttgactg atttcgcata catatgaaaa cgggggacgt 60

ggaattccac gtcccccgtt ttcatatgcc tacggtgtct gcgtgcatgg ataccctgta 120

gacaatagtg actgcgcgaa ggcgcagcaa acggaaggca gaatatggca ttggaaaacg 180

acttggcac 189

<210> 37

<211> 345

<212> DNA

<213> A12基因组片段1106489-1106833

<400> 37

attcgcacat gccacgggtc gcatcggtgt cgtcttaagc gctcaagcac tgcaatcaca 60

aggattttcc agattgttcg cttgttttca acacgccgcg caatatcctc acaaaccgca 120

cgcgacaacg acggcgaaaa cgcttgcatt cgttggtatt tcaacgtttc tcgcctttat 180

tcactgattt tccattttca caaatcgccc gagcaatctc ccaaattcgc aaattatgcg 240

cacagattcg ctcacactgt ttcaaaaact gcaaaaaggt cagcgtattc gcgtaacata 300

atcagcgatc gggcacggag accggcctgc aggacagcgc cgaag 345

Claims

1.一种引物对，其特征在于，该引物对包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。

2.权利要求1所述的引物对在特异性检测动物双歧杆菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌A12(Bifidobacterium animalis A12)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17308。

4.一种用于特异性检测动物双歧杆菌的试剂盒，所述试剂盒含有PCR扩增试剂和引物对，其特征在于，所述引物对为权利要求1所述的引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有DNA提取试剂。

6.一种定性检测待测样本中动物双歧杆菌的方法，其特征在于，该方法包括：在能够进行PCR扩增的条件下，使用权利要求1所示的引物对对所述待测样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，并对所述扩增产物进行电泳；

7.一种定量检测待测样本中动物双歧杆菌的方法，其特征在于，该方法包括：在能够进行PCR扩增的条件下，使用权利要求1所示的引物对对所述待测样品进行实时定量PCR检测，进而获得所述待测样本中动物双歧杆菌的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述检测待测样本中动物双歧杆菌的含量在10⁵-10¹⁰CFU/g之间。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述PCR扩增的条件包括：

先将PCR扩增体系在93-95℃下预变性2-5min；

然后在如下的程序下进行30-40次循环：

93-95℃变性25-35s，57-58.5℃退火8-12s，70-75℃延伸18-22s；

最后70-75℃延伸3-10min。

10.根据权利要求6或7所述的方法，其中，对所述待测样品进行PCR扩增的扩增体系包括：以20μL所述扩增体系计，待测样本的量为0.5-1.5μL，SEQ ID NO:1所示的正向引物的量为0.5-1.5μL，SEQ ID NO:2所示的反向引物的量为0.5-1.5μL，DNA聚合酶预混液的量为8-12μL。