CN105483250A - 双歧杆菌的实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

双歧杆菌的实时荧光pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：步骤一：以双歧杆菌标准菌株的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测扩增产物的荧光信号；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增双歧杆菌的特异性引物对和双歧杆菌的特异性探针。本发明的双歧杆菌的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测食品中是否按标示添加双歧杆菌提供了一种很好的方法，具有较好的应用前景。

Description

双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种食品中双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法。
背景技术
双歧杆菌是一类存在于人体中非常重要的益生菌群，是人体健康的重要指标之一，于1899年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离出来的专性厌氧菌。研究证实双歧杆菌具有平衡肠道菌群、降胆固醇、延缓衰老及抗肿瘤等生理功能。目前，有关双歧杆菌的微生态制剂的研究已成为一大热点，并广泛应用于食品、保健和医疗等领域。
GB4789.34-2012食品安全国家标准规定了双歧杆菌的检验鉴定标准，该标准利用传统培养基进行细菌形态和生化鉴定，并结合气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物，但此方法耗时耗力，难以在实际检测中推广，不能充分满足对含有双歧杆菌食品中双歧杆菌溯源和符合性的执法检验和整治监管的需要。因此有必要建立一种准确客观的检测双歧杆菌的新方法。
发明内容
本发明首要目的在于提供一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，以及检测试剂盒的应用。本发明的第三个目的在于提供一种双歧杆菌的实时荧光PCR的引物对和探针。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
步骤一：以双歧杆菌标准菌株的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤二：检测扩增产物的荧光信号；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增双歧杆菌的特异性引物对和双歧杆菌的特异性探针，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系为：2XHRqPCRMasterMix12.5μL，引物各1.25μL，探针0.625μL，ddH2O7.375μL，DNA模板2μL；
反应的条件为：95℃，5min；95℃，10s58℃，45s，45个循环。
作为本发明的第二个方面，一种双歧杆菌的检测试剂盒，含有以下试剂：
(a)扩增双歧杆菌的特异性引物对；
(b)双歧杆菌的特异性探针；
其中，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
根据本发明，所述检测试剂盒还包括：
(c)标准参照物。
本发明的检测试剂盒可用于检测食品中添加的双歧杆菌。
作为本发明的第三个方面，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
本发明的有益效果是：
1、可快速、简便地检测食品中是否存在双歧杆菌；
2、其特异性好，且灵敏度高，特别适用于各类益生菌发酵乳、婴幼儿配方奶粉等食品中是否按标识添加双歧杆菌的检测。
附图说明
图1为实时荧光PCR引物特异性试验扩增曲线图。
图2为实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。
图3为实时荧光PCR检出限试验扩增曲线图。
图4(A)和图4(B)为25个标示含双歧杆菌食品的实时荧光PCR扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本发明的实验材料和仪器如下：
(1)标签标识含有双歧杆菌酸奶、发酵乳、婴幼儿配方奶粉和食品均为市售产品。
(2)8株双歧杆菌标准菌株。其中：动物双歧杆菌BB-12由上海市质量监督检验技术研究院提供；乳双歧杆菌HN019、乳双歧杆菌Bi-07由丹尼克斯公司提供；青春双歧杆菌CICC6070、婴儿双歧杆菌CICC6069、长双歧杆菌CICC6186、短双歧杆菌CICC6079和两歧双歧杆菌CICC6071购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
(3)嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌等13株乳酸菌，与双歧杆菌具有同源性，以及大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌这三种可能存在于食品中的治病菌。所述13株近源乳酸菌和3种食源性致病菌的来源详见表3。
(4)TianGenDP302-02细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司(TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD,Beijing,China)。
(6)引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成(HuiruiBiotechnologyCo.,LTD，Shanghai，China)。
(7)HRqPCRMasterMix(货号：SJ-2101B)试剂购自上海辉睿生物科技有限公司(HuiruiBiotechnologyCo.,LTD，Shanghai，China)。
(8)试验相关仪器：紫外分光光度计NanovuePlus(GEHealthcare，UnitedKingdom)；实时荧光PCR仪ABIViia7(AppliedBiosystemsInc.,USA)；实时荧光PCR仪ABI7300(AppliedBiosystemsInc.,USA)；核酸蛋白分析仪；分析天平；离心机。
实施例1双歧杆菌等其它标准菌株DNA提取及酸奶、配方奶粉等食品中益生菌DNA提取
(1)标准菌株培养物：取细菌培养液1-5mL，10000rpm离心1min，尽量洗净上清，保留沉淀。
(2)酸奶等液体发酵乳：吸取1mL酸奶于2mL离心管，加入750μL去离子水、100μL18％柠檬酸钠和50μL1mol/L氢氧化钠。4℃，12000r/min离心5min，弃上清，保留沉淀。
(3)配方奶粉等固体样品：称取5g样品于50mL离心管，加入20mL去离子水溶解样品，再依次加入10mL18％柠檬酸钠和10mL1mol/L氢氧化钠。4℃，12000r/min离心15min，弃上清，保留沉淀。
(4)采用TianGenDP302-02细菌基因组DNA提取试剂盒对双歧杆菌、嗜热链球菌等其它标准菌株培养物DNA进行提取。
(5)采用TianGenDP302-02细菌基因组DNA提取试剂盒对益生菌发酵乳、婴儿配方奶粉、益生菌固体饮料等其它食品中益生菌DNA进行提取。
上述(1)～(5)的DNA浓度采用紫外分光光度仪NanovuePlus测定，模板量控制在30ng/反应以上，OD260/280控制在1.8至2.0之间。
实施例2引物对和探针的设计
(1)本实施例的引物对和探针的序列见表1：
表1引物及探针序列
(2)本实施例的实时荧光PCR反应体系见表2：
其中，TaqMan实时荧光PCR反应程序为：95℃，5min；95℃，10s58℃，45s，45个循环。
表2Taqman实时荧光PCR反应体系
实施例3双歧杆菌实时荧光PCR扩增的引物和探针特异性检测
选取6种共8株双歧杆菌标准菌株，11种共13株近源乳酸菌，以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌这三种可能存在于食品中治病菌一起抽提总DNA并纯化，抽提情况见表3，以双歧杆菌标准菌株DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照，利用表2选取的扩增体系对引物进行特异性试验。扩增结果如图1。
表3标准菌株DNA抽提情况
结论：引物和探针仅对8株双歧杆菌标准菌株DNA扩增阳性，有明显S型扩增曲线，对其余13种近源乳酸菌和3种食源性致病菌扩增阴性，提示该引物和探针特异性好。
实施例4实时荧光PCR灵敏度检测
将实施例3抽提得到的青春双歧杆菌CICC6070基因组DNA浓度调整为100ng/μL，梯度稀释成10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、5pg/μL、1pg/μL共五个浓度梯度，各2μL进行PCR扩增，扩增Ct值见表4。扩增曲线见图2。
表4实时荧光PCR灵敏度试验Ct值
结论：可以看出随着双歧杆菌浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，在模板使用量为10pg时，有明显S型扩增曲线，检出灵敏度达到10pg。
同样的，实施例3抽提得到的其余7株双歧杆菌标准菌株实时荧光PCR灵敏度检测的结果与青春双歧杆菌CICC6070的结果一致，此处不再一一列举。
实施例5实时荧光PCR检出限试验
选取巴氏杀菌纯牛奶作为食品基质以及青春双歧杆菌CICC6070制备混合样品。首先将青春双歧杆菌CICC6070培养物稀释到109CFU/mL，取1mL培养物加入到9mL纯牛奶中，混合均匀后按上述方法用纯牛奶依次十倍稀释至10CFU/mL，获得青春双歧杆菌CICC6070浓度分别为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL共8个梯度的系列稀释品。分别抽提DNA后，利用表2选取的扩增体系进行荧光PCR扩增，扩增Ct值见表5。扩增曲线见图3。
表5实时荧光PCR检出限试验Ct值
结论：可以看出随双歧杆菌浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，浓度为104CFU/mL的模板有明显的S型扩增曲线，检出限达到104CFU/mL。
同样的，其余7株双歧杆菌标准菌株的实时荧光PCR检出限试验结果与青春双歧杆菌CICC6070一样，此处不一一列举。
实施例6实例验证
随机在上海家乐福、乐购等超市购买标签标示有双歧杆菌的酸奶、奶粉等食品共25个，提取总DNA，抽提情况见表6。以双歧杆菌标准菌株DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照，25个样品各取100ng进行扩增试验，扩增曲线见图4。
表625个标示含双歧杆菌食品DNA抽提情况
结论：可以看出有5个样品(1、7、8、9、11号样品)没有出现S型曲线，结果表明该批超市抽取样品中检出没有双歧杆菌，与标签不符；其余20个样品出现S型曲线，表明该批超市抽取样品中检出双歧杆菌。
本发明建立了双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，针对双歧杆菌特异基因设计引物和探针，仅需结合实时荧光扩增曲线图，3小时就能准确检测到食品中是否含有双歧杆菌，灵敏度达到10pg，检出限达到104CFU/mL。
综上所述，本发明设计的双歧杆菌的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测微生态食品中是否添加双歧杆菌提供了一种很好的方法，在发酵乳、婴幼儿配方奶粉、乳酸菌保健食品领域的检测把关上，具有较好的应用前景。而且，所述特异性引物对和探针可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试剂盒，所述试剂盒除了所述特异性引物对和探针外，还可以包括标准参照物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一：以双歧杆菌标准菌株的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤二：检测扩增产物的荧光信号；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增双歧杆菌的特异性引物对和双歧杆菌的特异性探针，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系为：2XHRqPCRMasterMix12.5μL，引物各1.25μL，探针0.625μL，ddH2O7.375μL，DNA模板2μL；
反应的条件为：95℃，5min；95℃，10s58℃，45s，45个循环。
3.一种双歧杆菌的检测试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：
(a)扩增双歧杆菌的特异性引物对；
(b)双歧杆菌的特异性探针；
其中，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：
(c)标准参照物。
5.一种如权利要求3或4所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测食品中添加的双歧杆菌。
6.一种如权利要求1所述的双歧杆菌的特异性引物对和探针，其特征在于，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
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