CN117625820A - 一种双歧杆菌属快速检测及菌种同步鉴定的pcr-膜芯片法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双歧杆菌属快速检测及菌种同步鉴定的PCR‑膜芯片法，属于分子生物学分析领域。本发明筛选了不同双歧杆菌种属对应靶向基因，并对应设计了面向五种不同双歧杆菌种的特征引物和内参基因；利用尼龙膜芯片材料制备对应双歧杆菌菌种的PCR‑模芯片，并基于PCR‑模芯片开发鉴定体系。本发明的PCR‑模芯片法实现了长双歧杆菌婴儿亚种、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌菌种的快速检测和稳定区分，检出限达到0.01 ng核酸样本，重复性和特异性强度显著，大大缩减了不同双歧杆菌菌种检出和鉴定区分的时间和步骤流程，为保健食品品质监控和掺假掺伪等提供了一种快速有效的检测新方法。

Description

一种双歧杆菌属快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片法

技术领域

本发明涉及一种双歧杆菌属快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片法，属于分子生物学分析领域。

背景技术

双歧杆菌属（Bifidobacterium）细菌，革兰氏染色阳性，是人和动物肠道中重要核心菌群和有益生理菌群。随着近三十年来微生态学和医学的突破性进展，双歧杆菌维护人体肠道健康的作用越来越被重视。该菌属具有维持人体肠道微生态平衡、抑制病原菌入侵、调节机体免疫、降低胆固醇等作用，在食品、保健品和药品等领域广泛应用，备受消费者青睐。常见双歧杆菌保健品类型多样，包括了胶囊类、冲剂类、发酵乳类、片剂类等，部分还会与其他益生菌一起使用。但是，由于双歧杆菌属于专性厌氧菌，且对温度敏感性高，在实际产品开发和储运流通过程中，极容易出现失活现象。此外，市场上也发生过利用其他革兰氏阳性菌冒充双歧杆菌属进行销售现象。当前，研究发现双歧杆菌属有32个菌种，但国家规定可用于食品的双歧杆菌属仅包括了青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌婴儿亚种等5种。开展针对性的菌种识别鉴定工作对保障益生菌行业健康发展势在必行。

目前鉴别各类双歧杆菌种属的标准方法通常为培养基分离培养和形态、生化鉴定技术，检测周期长，使得造活性双歧杆菌检测的时效性差，对市场监管工作产生了不利的影响。基因膜芯片技术在基于反向斑点杂交的理论基础上，将待测靶标基因的特异性序列作为探针规定在尼龙载体上，并结合多对带生物素标记的引物对待测靶标基因进行扩增，通过酶反应显色产生肉眼可识别的颜色信号。该技术在结合多重PCR技术后，可实现一次性数十种靶标的检测鉴定，已被证实可用于病原体、突变基因筛查等方面工作，具有特异性高、耗时短等特点。然而，目前该技术在保健食品中的菌种鉴定和快速检测方面鲜有报道，特别是在以双歧杆菌种为代表的厌氧型革兰氏阳性菌快速检测和菌种鉴定方面未见报道，有待进一步创新。

发明内容

在此基础上，本发明技术在克服传统标准平板技术的前处理复杂和不适合菌种鉴定的背景下，结合多重PCR技术在菌种鉴定方面的可行性基础上，通过确定5种双歧杆菌菌种特异性PCR引物等相关信息，针对性开展特异性膜芯片设计和开发，利用人工合成的碱基序列作为生物探针规定在合适载体上，运用了高通量扩增手段，通过酶促反应产生可视化信号，实现了双歧杆菌不同种属的快速准确鉴定，为相关食品检验检疫提供技术参考和理论支撑。

本发明的第一个目的是提供一种用于双歧杆菌菌种检测的成套引物和探针组合，所述双歧杆菌菌种包括短双歧杆菌Bifidobacterium breve、两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longumsubsp.infantis、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis和动物双歧杆菌动物亚种Bifidobacterium animalssubsp. Animal；所述成套引物和探针组合包括如下：

（1）用于检测两歧双歧杆菌的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）用于检测青春双岐杆菌的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.4和5所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.6所示；

（3）用于检测短双歧杆菌的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.7和8所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.9所示；

（4）用于检测动物双歧杆菌动物亚种的引物和探针，所述引物的序列如SEQ IDNO.10和11所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.12所示；

（5）用于检测长双歧杆菌婴儿亚种的引物和探针，所述引物的序列如SEQ IDNO.13和14所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.15所示。

在一种实施方式中，还包括内标引物和内标探针所述内标引物的序列如SEQ IDNO.16和17所示，所述内标探针的序列如SEQ ID NO.18所示。

在本发明的一种实施方式中，所述成套引物和探针组合的反向引物5’端带有标记。

在本发明的一种实施方式中，所述反向引物5’端的标记为生物素、FAM或TAMRA中的任一。

在本发明的一种实施方式中，所述成套引物和探针组合的探针的5’端进行修饰。

在本发明的一种实施方式中，采用磷酸酯化对探针的5’端进行修饰。

本发明还提供了一种基因芯片，含有所述成套引物和探针组合。

本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述成套引物和探针组合和/或所述基因芯片。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中还含有阴性探针和阳性探针，所述阳性探针的序列如SEQ ID NO.19所示，所述阴性探针的序列如SEQ ID NO.20所示。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中还含有PCR反应试剂。

在一种实施方式中，所述PCR反应试剂包括PCR反应预混液Premix Ex Taq，或，PCRBuffer、dNTPs、Taq酶、MgCl₂。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒在进行检测时，所述成套引物和探针组合中的引物等比例混合。

在本发明的一种实施方式中，所述成套引物和探针组合的浓度为10 μmol/L。

本发明还提供了一种双歧杆菌属快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片方法，所述方法不以疾病的诊断为目的，所述菌种包括短双歧杆菌Bifidobacterium breve、两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longumsubsp.infantis、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis和动物双歧杆菌动物亚种Bifidobacterium animalssubsp. Animal；所述方法包括以下步骤：

步骤1：待测样本DNA提取：培养待测样本，并提取DNA；

步骤2：待测样本PCR扩增和特异分析：以步骤1的DNA为模板，加入所述成套引物和探针组合中的6对上下游引物和PCR反应试剂，进行PCR扩增；

步骤3：膜芯片的制备：吸取所述成套引物和探针组合中的5条探针以及阴性探针和阳性探针依次轻点在尼龙膜上，做好顺序记录；完成后将尼龙膜放至80℃烘箱中烘烤1 h~2 h，待其冷却至室温后方可裁剪装至杂交卡盒中，用于杂交反应；

步骤4：PCR产物变性：将步骤2的PCR产物置于95 ℃变性5 min后立即取出放置冰上低温放置，备用；

步骤5：去活化：1mL去活化液加入杂交盒，37℃孵育8min后吸取液体，然后加入1mL去活化清洗液，60℃洗脱5min；

步骤6：杂交反应与清洗：将步骤2的PCR扩增产物与1 mL杂交液充分混合后加入含有膜芯片的杂交卡盒内，并在水平摇床45℃下孵育10 min；吸出杂交液并加入预热的杂交清洗液，水平摇床50℃下振荡洗涤2次，每次清洗时间3 min；

步骤7：酶孵育与清洗：吸除剩余清洗液，加入酶标液，42℃水平摇床，振荡孵育30min，吸除酶标液后，加入预热的酶标清洗液1，在水平摇床42℃振荡清晰5 min，重复2次，然后用预热的酶标清洗液2，水平摇床37℃振荡清晰3 min，重复2次；

步骤8：显色与清洗：完成后，吸除剩余清洗液，加入1mL显色液，37℃下静置5 min，吸除多余显色液后随后加入1mL去离子水，37℃下洗涤2次，每次3 min，进行显色分析。

在本发明的一种实施方式中，步骤2中，所述引物的浓度为0.2 μM，6对上下游引物等比例混合。

在本发明的一种实施方式中，步骤2中，所述PCR扩增的程序设置为50℃下反应2min；95℃下反应10min；95℃下30s，60℃下30s、72℃下15s，循环30次；72℃下延伸5 min；4℃保温。

在本发明的一种实施方式中，步骤8中，显色分析过程中要求对应靶标显色，灰度值在40以上，其余靶标探针不显色。混合模板下，所有均需显色，且尽量各靶点显色均一。

有益效果：

（1）发明公开了一种双歧杆菌属快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片方法，根据反向斑点杂交技术原理，将5种双歧杆菌菌种靶标基因对应的特异性序列固定在尼龙膜芯片上，分析酶-底物混合反映的显色信号和信号强度，进行准确区分。PCR-模芯片探针布点及实物如图1所示；

（2）本发明构建的双歧杆菌快速检测及菌种同步鉴定体系，表现出了对双歧杆菌种属的高度专一性检测，开发的专项多重PCR引物Mix能够消除其他杂菌的干扰，同时鉴定区分不同菌种类型，克服了传统检测方法在检测时效性和鉴别流程方面的不足，对当前保健食品产业健康有序发展具有重要意义；

（3）本发明建立的双歧杆菌快速检测及菌种同步鉴定方法，对双歧杆菌综合检出限为0.01 ng核酸样本，检出限以上的样本，包括混合样本均能产生阳性显色，精确度高，特异性强；

（4）本发明构建的双歧杆菌快速检测及菌种同步鉴定体系，能快速准确区分常见的5种双歧杆菌菌种，建立包括了长双歧杆菌婴儿亚种、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌菌种在内的益生菌快速筛查方法，为益生菌检测和菌种鉴定提供了一种快速有效的新手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明双歧杆菌快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片探针布局图和实物图；

图2为实施例1不同退火温度下引物扩增条带图；

图3为非特异性引物扩增条带图；

图4为实施例1制备不同菌种类型的特异性引物扩增条带图；

图5为实施例1中PCR-模芯片各阳性核酸检测结果靶点图；

图6为五种双歧杆菌标准菌种核酸提取物的检测限测试图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例：基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做进一步详细的说明。

TPY液体培养基：用于双歧杆菌的增菌培养。10.0 g/L 水解酪蛋白，5.0 g/L 植物胨，2.0 g/L酵母粉，5.0 g/L 葡萄糖，0.5 g/L L-半胱氨酸，2.0 g/L 磷酸氢二钾，0.5 g/L氯化镁，0.15 g/L氯化钙，0.0001 g/L 氯化铁，1.0 吐温80，pH 6.5。

MRS培养基：用于双歧杆菌的分离培养或计数。10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L牛肉浸粉，4.0 g/L酵母浸粉，20.0 g/L葡萄糖，2.0 g/L磷酸氢二钾，2.0 g/L柠檬酸三铵，5.0 g/L醋酸铵，0.2 g/L 硫酸镁，0.05 g/L 硫酸锰，15.0 g/L 琼脂，1.0 g/L 吐温80，pH 6.2。

实施例1：多重PCR引物及探针设计

引物特异性筛选参照图3和4所示。以不同靶标基因片段开展扩增实验。结果表明，在短双歧杆菌的鉴定基础上，以Hsp60为靶标基因发现在其他不同菌种上均有表现；类似的，青春双歧杆菌（RecA）、动物双歧杆菌动物亚种（16S-23S rDNA ITS）、长双歧杆菌婴儿亚种（16S-23S rDNA ITS）、两岐双歧杆菌（RecA）均出现条带不清晰，无特异性等特征，证明了对应菌种的靶标基因不符合设计要求（图3）。

在优化靶标基因片段后，分别选取短双歧杆菌Bifidobacterium breve（16S-23SrDNA ITS）、两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum（HSp60）、长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longumsubsp.infantis（grpE）、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis（16S-23S rDNA ITS）、动物双歧杆菌动物亚种Bifidobacterium animals subsp. animal（RecA）作为双歧杆菌菌种的鉴定基因，内参基因选择细菌保守序列16SrDNA，利用Primer Premier 5.0开展对应的引物设计：

步骤1：确定5种常见的双歧杆菌鉴别靶标基因：分离提取5种对应明确的双歧杆菌菌种，并进行基因序列测定，结合NCBI Nucleotide上对已知真菌基因和序列，完成不同菌种靶标基因的确定，为保证菌种分析结果足够准确，本发明中局部序列区域差异要求超过50%；

步骤2：PCR引物设计：利用Primer Premier 5.0软件进行特异引物设计，考虑到在实际操作过程中，与非特异性扩增序列的同源性不能完全避免。为确保特异性，本发明中引物与非特异扩增序列的同源性设计要求低于70%，长度设计控制在15-30碱基对之间，G+C段含量控制在50±10%范围，反向引物5‘端以生物素标记；

步骤3：特异探针设计：利用BLAST进行序列比对，确保探针序列在目标序列上的高度特异性，确定合适长度（20-25个碱基对）和GC含量（50±10%范围），采用磷酸酯化对探针的5'端进行修饰，基于NCBI等相关数据库，设计特异性和合适的探针，并结合PrimerExpress等进行辅助优化；

在反向斑点原理基础上，反向引物5’端以生物素进行标记，采用磷酸酯化对探针5’端进行修饰，具体信息见表1。所有引物探针由南京金斯瑞生物科技公司合成。

表1 多重PCR引物及探针设计信息

实施例2：引物探针的特异性验证

1、材料与方法

1、1 菌株

双歧杆菌属：两歧双岐杆菌 CICC 6071、青春双岐杆菌 CICC 6070、短双岐杆菌CICC 6079、动物双岐杆菌CICC 24926、长双歧杆菌婴儿亚种 CICC 6079，长双岐杆菌长亚种 CICC 6068；

非双歧杆菌属：鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimuriumATCC 14028。

以上菌株均由南京市食品药品监督检验院微生物实验室保藏。

1、2 细菌DNA提取及PCR扩增

挑选6种双歧杆菌标准菌株和非双歧杆菌属沙门氏菌接种至TPY液体培养基中培养过夜，并利用无菌生理盐水将菌种梯度稀释至1×10⁶CFU/mL，分别取1-5 mL放入干净灭菌离心管中，以12000 r/min的速度离心2分钟，倒掉上清液，然后分别提取细菌基因组DNA作为模板。

采用的细菌基因组DNA提取试剂盒，按照革兰氏阳性菌的提取方式进行提取。提取后的基因组DNA用Nanodrop 2000测定质量，一般要求核酸浓度在20 ng/μL以上，A260/A280介于1.8~2.0之间。

PCR扩增体系（20μL）：Premix Ex Taq(Probe qPCR) 10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板200ng，最后用水补足至20μL。

退火温度选择：退火温度是影响引物扩增的重要因素，本发明中分别在不同退火温度（54℃、56℃、58℃、60℃、62℃和64℃）下进行PCR扩增反应。

在优化后的PCR扩增程序操作下，完成PCR扩增。并采用针对各菌株设计的特征引物对所有已知菌种作为待测靶标模板进行扩增和特异性分析。

PCR扩增程序设置为50℃下反应2min，循环1次；95℃下反应10min，循环1次；95℃下30s，分别在54℃、56℃、58℃、60℃、62℃或64℃下30s、72℃下15s，循环30次；72℃下延伸5 min；4℃保温。

2、结果

2.1 最优退火温度确定：从图2中可以看出，不同退火温度下引物特征差异明显。其中54℃、56℃、58℃条件下条带不够清晰，类似，62℃和64℃退火温度下条带边缘模糊。总体来看，在60℃条件下引物表达最为清晰，可视为最优退火温度。

2.2 特异性验证：应用PCR进行引物探针的特异性验证，分别提取双歧杆菌属（两歧双岐杆菌、青春双岐杆菌、短双岐杆菌、动物双岐杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、长双岐杆菌）和非双岐杆菌属菌株的基因组DNA，并以此为模板，应用实施例1中的引物探针分别进行PCR扩增，同时以ddH₂O代替DNA作为空白对照组。图4表明每种双岐杆菌仅能扩出目的基因的条带。同属的其它双岐杆菌及非双歧杆菌属的阴性对照菌均无扩增，证明实施例1中提供的5组引物探针具有良好的特异性，与其他菌株无交叉反应，可用于多重PCR体系的构建。

实施例3：双歧杆菌快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片法

在实施例1所述多重PCR引物和探针的基础上，本发明开发了用于检测上述5种双歧杆菌的PCR-膜芯片及检测试剂盒。所述PCR-膜芯片包括载体和固定在载体上的探针，所述探针包括实施例1中设计的特异性探针，此外，还含有内参基因探针、阳性探针和阴性探针。

（1）尼龙膜的预处理

采用尼龙膜(美国Pall公司)剪裁成固定大小1.1 cm×1.1 cm的模块，并置于超纯水中浸泡20 min，重复两次；再用转膜缓冲液（20×SSC，pH 7.0，无菌）浸泡15min，取出后吸水纸吸取表面多余水分后，转至烘箱60°C下烘干15 min，恢复室温后备用。

（2）膜芯片制备

采用尼龙膜材料制备膜芯片，吸取0.1 μL碳酸氢钠稀释的浓度为10μM的探针，按图1进行膜芯片探针布局，并依次将内参探针（10 μmol/L，SEQ ID NO.18）、实施例1中设计的检测靶标探针（10 μmol/L，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQID NO.15）、阳性探针（5 μmol/L，SEQ ID NO.19）以及阴性探针（5 μmol/L，SEQ ID NO.20）轻点在步骤（1）处理过的尼龙膜上，做好顺序记录；完成后将尼龙膜放至80℃烘箱中烘烤1.5 h左右，待其冷却至室温后可修剪装至杂交卡盒中，用于组装检测试剂盒。

（3）检测试剂盒的制备

所述试剂盒中含有表1所述的引物对，步骤（2）中的膜芯片、Premix Ex Taq(ProbeqPCR)和灭菌水。

实施例4 试剂盒的应用

以实施例3制备的试剂盒进行5种双歧杆菌的鉴定：

步骤1、细菌DNA提取挑选6种双歧杆菌标准菌株和非双歧杆菌属沙门氏菌接种至TPY液体培养基中培养过夜，并利用无菌生理盐水将菌种梯度稀释至1×10⁶CFU/mL，分别取1-5mL放入干净灭菌离心管中，以12000r/min的速度离心2分钟，倒掉上清液，然后分别提取细菌基因组DNA。

采用的细菌基因组DNA提取试剂盒，按照革兰氏阳性菌的提取方式进行提取。提取后的基因组DNA用Nanodrop 2000 测定质量，一般要求核酸浓度在20 ng/μL以上，A260/A280 介于1.8~2.0之间。

步骤2、PCR扩增

多重PCR扩增体系（20μL）：Multiplex PCR Master Mix 根据不用厂家产品要求确定，多重引物Mix 每条引物2μmol/L 2μL，DNA模板200ng，最后用水补足至20μL。所述多重引物Mix由实施例1中表1中的6对引物等比例混合而成（最终PCR体系每条引物0.2μmol/L）。

PCR扩增程序设置为50℃下反应2min，循环1次；95℃下反应10min，循环1次；95℃下30s，60℃下30s、72℃下15s，循环30次；72℃下延伸5 min；4℃保温。

PCR产物变性：将扩增得到的PCR产物于95℃反应5 min使其解链，然后立即取出放置冰上低温放置，备用

步骤3、杂交与显色

将步骤2获得的PCR扩增产物进行杂交，杂交流程按照表2所述进行操作。杂交结束后，观察各靶标探针显色结果并对比同一靶标不同探针间显色强弱。

去活化液：100 mmol/L NaOH；

去活化清洗液：含0.1% SDS的2×SSPE；

杂交液：含0.1% SDS的2×SSPE；

杂交清洗液：含0.5% SDS的2×SSPE；

酶标液：含0.5% SDS的2×SSPE；

第一酶标清洗液：含0.5% SDS的2×SSPE；

第二酶标清洗液：2×SSPE；

显色液：含0.15 mg/mL BCIP，0.30 mg/mL NBT， 100 mmol/L TrisHCL，5 mmol/LMgCl₂， pH为9.5。

表2 杂交流程表

实施例5 特异性验证

为了评估实施例3设计的一种双歧杆菌快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片法，采用混标和市售产品进行特异性和检出限测试。

按照实施例4的方法对不同混标体系进行检测，结果如图5所述，该体系在不同混标体系结果下只有对应的靶标点呈现显色情况，结果单一且特异。

将市售样本梯度稀释至1.0、0.1、0.01 ng/核酸样本，按照实施例4的方法进行检测，结果如图6所示，通过肉眼观察可实现结果0.01 ng/核酸样本的双歧杆菌检出限。由此可知，构建的检测方法特异性高且检出灵敏程度好。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种用于双歧杆菌菌种检测的成套引物和探针组合，其特征在于，所述双歧杆菌菌种包括短双歧杆菌Bifidobacterium breve、两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longumsubsp. infantis、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis和动物双歧杆菌动物亚种Bifidobacterium animals subsp. Animal；所述成套引物和探针组合包括如下：

（1）用于检测两歧双歧杆菌的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）用于检测青春双岐杆菌的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.4和5所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.6所示；

（3）用于检测短双歧杆菌的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.7和8所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.9所示；

（4）用于检测动物双歧杆菌动物亚种的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.10和11所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.12所示；

（5）用于检测长双歧杆菌婴儿亚种的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.13和14所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.15所示。

2.根据权利要求1所述的成套引物和探针组合，其特征在于，还包括内标引物和内标探针，所述内标引物的序列如SEQ ID NO.16和17所示，所述内标探针的序列如SEQ ID NO.18所示。

3.根据权利要求1或2所述的成套引物和探针组合，其特征在于，所述成套引物和探针组合的反向引物5’端带有标记。

4.根据权利要求3所述的成套引物和探针组合，其特征在于，所述反向引物5’端的标记为生物素、FAM或TAMRA中的任意一种。

5.一种基因芯片，其特征在于，含有权利要求1~4任一所述成套引物和探针组合。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1~4任一所述成套引物和探针组合和/或权利要求5所述基因芯片。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有阴性探针和阳性探针，所述阳性探针的序列如SEQ ID NO.19所示，所述阴性探针的序列如SEQ ID NO.20所示。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PCR反应试剂。

9.一种双歧杆菌属快速检测及菌种同步鉴定的PCR-膜芯片方法，其特征在于，利用权利要求1~4任一所述成套引物和探针组合，或权利要求5所述基因芯片，或权利要求6~8任一所述试剂盒进行菌种的鉴定，所述方法不以疾病的诊断为目的，所述菌种包括短双歧杆菌Bifidobacterium breve、两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longumsubsp. infantis、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis和动物双歧杆菌动物亚种Bifidobacterium animals subsp. Animal。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1：待测样本DNA提取：培养待测样本，并提取DNA；

步骤2：待测样本PCR扩增和特异分析：以步骤1的DNA为模板，加入所述成套引物和探针组合中的6对上下游引物和PCR反应试剂，进行PCR扩增；

步骤3：膜芯片的制备：吸取所述成套引物和探针组合中的6条探针以及阴性探针和阳性探针依次轻点在尼龙膜上，做好顺序记录；完成后将尼龙膜放至80℃烘箱中烘烤1 h~2h，待其冷却至室温后方可裁剪装至杂交卡盒中，用于杂交反应；

步骤4：PCR产物变性：将步骤2的PCR产物置于95 ℃变性5 min后立即取出放置冰上低温放置，备用；

步骤5：去活化：1mL去活化液加入杂交盒，37℃孵育8min后吸取液体，然后加入1mL去活化清洗液，60℃洗脱5min；

步骤6：杂交反应与清洗：将步骤2的PCR扩增产物与1 mL杂交液充分混合后加入含有膜芯片的杂交卡盒内，并在水平摇床45℃下孵育10 min；吸出杂交液并加入预热的杂交清洗液，水平摇床52℃下振荡洗涤2次，每次清洗时间3 min；

步骤7：酶孵育与清洗：吸除剩余清洗液，加入酶标液，42℃水平摇床，振荡孵育30 min，吸除酶标液后，加入预热的酶标清洗液1，在水平摇床42℃振荡清晰5 min，重复2次，然后用预热的酶标清洗液2，水平摇床37℃振荡清晰3 min，重复2次；

步骤8：显色与清洗：完成后，吸除剩余清洗液，加入1mL显色液，37℃下静置5 min，吸除多余显色液后随后加入1mL去离子水，37℃下洗涤2次，每次3 min，进行显色分析。