KR101753243B1 - 비피도박테리움 롱검 bori의 특이 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 비피도박테리움 롱검 bori의 검출방법 - Google Patents

비피도박테리움 롱검 bori의 특이 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 비피도박테리움 롱검 bori의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI의 검출 방법에 관한 것으로, 여러 유사 유산균들로부터 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있다.

Description

비피도박테리움 롱검 BORI의 특이 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 비피도박테리움 롱검 BORI의 검출방법 {Primer set for specific detection of Bifidobacterium longum BORI and method for detection of Bifidobacterium longum BORI thereby}
본 발명은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 특이 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 비피도박테리움 롱검 BORI의 검출방법에 관한 것이다.
요구르트를 비롯한 여러 발효식품에서, 발효식품의 맛과 기능성을 좌우하는 발효 균주의 중요성은 매우 크다. 따라서, 발효 균주, 즉 종균의 관리 및 추적은 품질 관리 및 유지 측면에서 대단히 중요한하다.
식품으로부터 특정 미생물(예, 발효 균주)을 확인 및 모니터하는 방법으로는 평판배양법이 대표적이다. 하지만, 평판배양법은 배양 시간이 오래 걸리고, 선택 배지를 사용해야 하며, 배양 조건을 정해주어야 한다는 단점이 있다. 특히, 평판배양법에 의해서 유산균을 식별하기에는 유산균들 간 영양요구성과 배양조건이 거의 비슷하기 때문에 상호 간 구별이 매우 힘든 문제점이 있다.
이에 평판 배양법의 대한 대안으로 PCR을 근간으로 하는 방법이 개발되고 있는데, RAPD, PCR-RFLP, 16S rDNA-based PCR이 알려져 있고, 혼합 과정 중 미생물 측정 방법으로 PCR 조각을 DGGE하는 방법이 알려져 있다. 또한, RAPD법의 한계를 극복하기 위하여 최근 KEGG와 같은 게놈 뉴클레오타이드 데이터 (genome neocleotide data)를 이용하여 특이 검출을 위한 프라이머 세트 개발도 진행되고 있다.
PCR 방법은 평판배양법 등의 이전 방법에 비하여 민감하고, 선택적이다. 또한, 빠르고, 경제적이며, 편리한 특징이 있는데, 특히 리얼 타임 PCR을 이용한 방법은 정량적 계산이 가능하고, 비슷한 미생물 간의 구별이 가능한 특징이 있다.
대한민국 특허공개번호 제10-2006-0078096호(공개일자 2006년 07월 05일)에는, 종래 김치 및 절임류 등에서 많이 발견되는 젖산균의 동정에 있어서 생화학적 방법이 안고 있는 문제, 즉 시간이 많이 소요되고 부정확한 단점을 극복하여 신속하고도 정확한 균종의 동정을 가능하게 하는 "김치 젖산균 동정용 프라이머 및 이들의 조합으로 구성되는 42개의 프라이머 세트"가 기재되어 있다.
본 발명은 급성설사 및 장염을 일으키는 주된 원인체로 알려진 로타바이러스를 억제하는 활성이 우수한 유산균으로 알려진 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI(특허등록번호 10-0492455)의 특이 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI의 검출방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 특이 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용할 경우, 여러 유산균으로부터 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)를 특이적으로 선별할 수 있다.
본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출 키트를 제공한다. 본 발명의 검출 키트에는 본 발명의 프라이머 세트 외에 검출을 위해 필요한 다른 공지 성분들을 포함할 수 있다. 그 예로는 PCR (polymerase chain reaction)을 위해 사용되는 각종 버퍼나, 효소 등이 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 프라이머로 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 검출방법에 있어서, PCR 수행시, 상기 서열번호 1에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 프라이머로 사용하는 것을 제외한 나머지 기술적 사항은 공지의 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 검출방법에 있어서, 상기 검출방법은, 바람직하게 여러 유산균들이 혼재되어 있는 검체로부터 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)를 검출하는 것일 수 있다. 이때, 상기 검체는 일 예로 식품 또는 분변일 수 있다. 또한, 상기 식품은 일 예로 유제품일 수 있다. 또한, 상기 분변은 사람 또는 동물의 분변일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 이용할 경우, 여러 유사 유산균들로부터 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있다. 또한, 리얼 타임 PCR에도 사용 가능하도록 설계되어 균의 정량적 확인에도 용이하게 이용될 수 있다.
이는 궁극적으로 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI를 이용한 발효식품에서 종균인 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI의 관리 및 추적이 가능함을 의미하고, 결국 제품의 품질 관리에 본 발명의 프라이머 세트가 유용하게 활용될 수 있음을 의미한다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 여러 유산균 및 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI를 대상으로 PCR을 수행한 결과이다.
본 발명에서는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI의 Draft sequence를 ㈜ 비피도로부터 받아 NCBI 뉴클레오타이드 BLAST를 통해 다른 균주와의 시퀀스 상동성을 검토하였다. 찾아낸 200 bp의 BORI 특이 시퀀스를 기반으로 NCBI 프라이머 블라스트 (primer blast)를 이용하여 설계된 최종 산물 (final product)이 80 bp인 프라이머 한 세트 (서열번호 1 및 서열번호 2)를 선택하였다.
본 발명에서는 리얼 타임 PCR에 이용 될 수 있는 프라이머 세트를 선택하였으며, 여러 유사 유산균들로부터 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) BORI를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시 예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: PCR을 이용한 비피도박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum ) BORI 특이 프라이머의 검증]
(1) 실험 대상 균주 확보
본 실시예에서 사용한 균주는 상업용 균주 및 장내 유산균으로, 인체 장내로부터 분리하거나, ATCC 및 KCTC로부터 분양받아 사용하였다.(표 1)
연번 균주명 출처
1 Bifidobacterium longum BORI KCCM-10492 ㈜비피도
2 Bifidobacterium longum RD47 ㈜비피도
3 Bifidobacterium lactis RD65 ㈜비피도
4 Bifidobacterium sp. RD72 ㈜비피도
5 Bifidobacterium longum RD01 ㈜비피도
6 Bifidobacterium sp. RD79 ㈜비피도
7 Bifidobacterium longum RD03 ㈜비피도
8 Bifidobacterium sp. RD80 ㈜비피도
9 Bifidobacterium bifidum KCTC3202 ㈜비피도
10 Bifidobacterium bifidum KCTC3418 ㈜비피도
11 Bifidobacterium bifidum KCTC3440 ㈜비피도
12 Bifidobacterium bifidum BGN4 ㈜비피도
13 Bifidobacterium subtile ㈜비피도
14 Bifidobacterium breve ㈜비피도
15 Bifidobacterium adolescentis ㈜비피도
16 Bifidobacterium catenulatum ㈜비피도
17 Lactobacillus plantarum ㈜비피도
18 Lactobacillus rhamnosus ㈜비피도
19 Lactobacillus lactis ㈜비피도
20 Lactobacillus bulgaricus ㈜비피도
21 Enterococcus faecium ㈜비피도
22 Streptococcus thermophilum ㈜비피도
(2) PCR 수행
먼저, 시판되는 DNA 분리 키트를 사용하여, 상기 표 1의 균주들의 염색체 DNA를 순수하게 분리하였다. 그 다음 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 수득된 단편들을 비교 분석하였다. 프라이머 외의 PCR 조건은 PCR 프로토콜에서 제시하는 통상의 조건을 이용하였다.
프라이머 세트 이름 서열 (5'→3') 서열번호 방향 bp PCR을 통해 생성되는 단편의 크기
프라이머 세트 TTT CAC AGC GAA GCA ACG AAG 1 정방향 21 80
TTT CAC AGC GAA GCA ACG AAG 2 역방향 23
(3) 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과
비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI를 제외한 나머지 균주들에 대해서는 PCR 생성물(product)인 DNA 단편(fragment)의 밴드가 나타나지 않았다.
<110> YEON SUNG INDUSTRY FOUNDATION <120> Primer set for specific detection of Bifidobacterium longum BORI and method for detection of Bifidobacterium longum BORI thereby <130> YP-16-203 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 tttcacagcg aagcaacgaa g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 tttcacagcg aagcaacgaa g 21

Claims (7)

  1. 서열번호 1에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 특이 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출 키트.
  3. 서열번호 1에 기재된 핵산 서열 및 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 프라이머로 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 검출방법은,
    여러 유산균들이 혼재되어 있는 검체로부터 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)를 검출하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 검체는,
    식품 또는 분변인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 식품은,
    유제품인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 분변은,
    사람 또는 동물의 분변인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI (기탁번호 KCCM-10492)의 검출방법.
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