KR101193410B1 - 락토바실러스 속 균종의 동정방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 속 균종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 락토바실러스 속 균종에 특이적인 염기서열을 가지는 하나 이상의 프라이머와 락토바실러스 속 균종에 공통적인 염기서열을 가지는 하나 이상의 프라이머를 이용하여 다중 PCR 방법을 통해 검사체 내의 락토바실러스 속 균종을 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이 지역의 염기서열을 이용하여 각 균종에 특이적으로 제작한 것으로, 상기 프라이머를 이용하여 검사체 내에 혼재되어 있는 락토바실러스 속 균주를 신속, 정확하게 동정할 수 있어 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 이용한 건강식품 및 의약품의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
도 1a는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머 및 공통적 프라이머의 설계 계획 및 예상 PCR 증폭 산물의 크기를 나타낸 그림이다.
Reu: 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
Cas: 락토바실러스 카제이(L. casei) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
Bul: 락토바실러스 불가리쿠스(L. delbrueckii subsp. bulgaricus) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
Gas: 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
Aci: 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
Par: 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
Pla: 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
Rha: 락토바실러스 람노서스(L. casei subsp. rhamnosus) 균종 특이 프라이머 부착 위치,
REV: 서열번호 9로 기재되는 락토바실러스 속 균종 공통 프라이머 부착 위치, 및
FOR: 서열번호 10으로 기재되는 락토바실러스 속 균종 공통 프라이머 부착 위치
도 1b는 락토바실러스 속 표준균주의 염색체 DNA를 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 조합을 사용하여 PCR을 수행한 전기영동 사진이다.
Aci: 락토바실러스 애시도필러스, Bul: 락토바실러스 불가리쿠스,
Cas: 락토바실러스 카제이, Gas: 락토바실러스 가쎄리,
Hel: 락토바실러스 헬베티쿠스, Pla: 락토바실러스 플란타룸,
Reu: 락토바실러스 루테리, Par: 락토바실러스 파라카제이,
Rha: 락토바실러스 람노서스,
9-1(0.6 kb): 서열번호 9 및 서열번호 1로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.60 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
2-10(0.18kb): 서열번호 2 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.18 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
3-10(0.71 kb): 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.71 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
9-4(0.28 kb): 서열번호 9 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.28 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
9-6(0.43 kb): 서열번호 9 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.43 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
8-10(1.09 kb): 서열번호 8 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 1.09 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과,
9-5(0.65 kb): 서열번호 9 및 서열번호 5로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.65 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과, 및
9-7(0.45 kb): 서열번호 9 및 서열번호 7로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 0.45 kb에 상응하는 크기의 PCR 증폭 산물의 생산결과
도 2는 8종의 락토바실러스 속 표준균주의 염색체 DNA 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
레인 1: 락토바실러스 애시도필러스, 레인 2: 락토바실러스 불가리쿠스,
레인 3: 락토바실러스 카제이, 레인 4: 락토바실러스 가쎄리,
레인 5: 락토바실러스 플란타룸, 레인 6: 락토바실러스 루테리,
레인 7: 락토바실러스 람노서스, 레인 8: 락토바실러스 파라카제이,
레인 M: 100 bp DNA 사이즈 마커.
도 3은 락토바실러스 속 8종의 표준균주 콜로니의 불균등 조합된 혼합물 및 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 사용하여 다중 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.
레인 1: 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 루테리,
레인 M: 100 bp DNA 사이즈 마커,
레인 2: 락토바실러스 카제이,
레인 3: 락토바실러스 플란타룸,
레인 4: 락토바실러스 애시도필러스 및 락토바실러스 파라카제이,
레인 5: 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 불가리쿠스,
레인 6: 락토바실러스 불가리쿠스,
레인 7: 락토바실러스 가쎄리,
레인 8: 락토바실러스 루테리 및 락토바실러스 플란타룸
도 4는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주 포함 제품으로부터 분리한 균주의 유전계통수(Phylogenetic tree)에서의 종의 위치를 나타낸 계통도이다.
본 발명은 락토바실러스 속 균종의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 락토바실러스 속 균종에 특이적인 프라이머 및 락토바실러스 속 균종에 공통적인 프라이머를 이용하여 검사체 내의 락토바실러스 속 균주를 검출하고 동정하는 방법에 관한 것이다.
요구르트에서 분리된 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)의 정장효과가 인정되면서 유산균에 대한 관심이 증대하고 이에 따른 연구가 계속적으로 진행되어 왔지만, 국내에서의 유산균 관련 연구는 아직까지 미미한 상태이다. 오래전부터 유럽의 여러 국가에서 유제품 및 치즈 등으로부터 다양한 유산균주가 분리되었으며, 일본에서 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 개발된 이래 다양한 의약품 및 기능성 식품으로써 유산균이 많이 사용되고 있다. 최근에는 미국에서도 장 정착성 및 내산성이 우수한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG의 제품화가 성공한 이후 유산균에 대한 연구는 전 세계에서 활발하게 진행되고 있으며 성인병 예방 및 면역 증강에 의한 항암효과 등이 우수한 기능성 프로바이오틱(probiotic) 유산균의 분리와 개발에 대한 관심이 계속적으로 증폭되고 있다. 프로바이오틱 유산균은 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품, 캡슐제제 등에 사용되고 있으며 향후 프로바이오틱 유산균 개발 기술은 기술 집약형 방식으로 전개되어 이들 제품의 규모는 지속적으로 증가할 것으로 예상된다. 국내 상황도 마찬가지여서 대부분의 균주를 수입에 의존하고 있는 발효유 시장만 놓고 볼 때 2001년 현재 매출은 9,300억원이며 매년 10% 씩 꾸준한 성장세를 보여 2002년에는 12,000억 원대가 될 것으로 추산되어 고기능성 프로바이오틱 유산균주를 이용한 제품의 시장성은 무한하다고 할 수 있다(McCann et al., J. Food. Pretect., 1996, 59, 41-45).
락토바실러스는 간균으로써 호모(homo) 유산발효성과 헤테로(hetero) 유산발 효성을 모두 가지고 있으며, 동?식물체 및 발효유제품 등 다양한 분리원에서 발견되는 통성혐기성 균종이다. 락토바실러스는 젖산, 초산과 같은 유기산 생성과 그에 따른 pH 저하에 의한 항균작용과 H2O2와 디아세틸(diacetyl) 등의 항균성 대사산물 및 다양한 단백질성 고분자 물질인 박테리오신(bacteriocin)의 생성에 의해 식품 부패 미생물과 다른 병원성 미생물의 생육을 억제하는 것으로 알려져 있어서 요구르트나 발효유 제조 혹은 건강식품 및 의약품으로도 널리 사용된다. 또한, 락토바실러스의 발효에 의해 생성되는 유기산은 부패 방지를 위한 식품첨가물뿐만 아니라 수술용 제봉사의 원료가 되는 폴리락틱산(polylactic acid)과 그 밖에 아세트알데히드(acetealdehyde), 아크릴릭산(acrylic acid), 2,3-펜타디온(2,3-pentadione) 등 다양한 합성물질의 재료로써 사용된다(Porro et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65, 4211-4215).
지금까지 알려진 락토바실러스 속 균종에는 90 여종이 있으며, 현재 프로바이오틱 균주로써 상용화되고 있는 균주는 일부에 불과하다. 이들 중 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus; L. delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus; L. casei subsp. rhamnosus), 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 등이 대부분을 차지한다. 이 밖에도 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus), 락토바실러스 존소니이(L. johnsonii; L. acidophilus subsp. johnsonii), 락토바실러스 훼르멘텀(L. fermentum) 등이 최근 기능성 프로바이오틱 균주로 개발되고 있지만 이들은 기존의 프로바이오틱 균종인 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 등과 유사한 균종에 속한다.
락토바실러스에 대한 계통분류학적 분류를 위해 현재까지는 현미경적 소견과 그람염색법, 카탈라제 시험법, 생육 시험법, 당 이용성 등을 포함한 생리특성시험 및 이를 포괄하는 생화학적 방법인 API 시험키트를 이용하였다. 그러나 상기와 같은 분류 방법은 데이터베이스의 한계성을 가지며 재현성이 떨어지고 모호한 동정 결과를 많이 도출하기 때문에 원하는 균주를 특이적으로 동정하기 위한 방법이 절실히 요구된다.
상기와 같은 문제점을 보완하기 위해 분자생물학적 동정 및 특성 분석법을 이용하기 시작하였으며(Tenover et al.,
J. Clin. Microbiol., 1995, 33(9), 2233-2239, 1995), 최근에는 PCR 및 다양한 전기영동방법 등이 보고 되고 있다(Walter et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67(6), 2578-2585). 이 중 현재 많이 연구되고 있는 것은 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA) 분석법으로, 상기 방법은 10개 내외의 염기서열로 구성된 임의의 프라이머(random primer)를 사용한 일종의 유전자지문분석(fingerprinting) 기법이다(Cusick et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 66(5), 2227-2231). RAPD를 이용해서 얻은 유전자지문형(fingerprint pattern)은 게놈 유전자(genomic DNA)에 따라 고유하게 나타남으로써 미생물의 분리, 동정 및 특성 분석이 가능하다(Kaufman et al., Appl. Environ. Microbiol., 1997, 65(4), 1268-1273). 그러나 아직까지는 PCR 조건에 따른 재현성 문제와 속, 종 및 그 이하의 균주간 비교를 위해 적합한 프라이머의 확립이 부족하여 이에 대한 연구가 진행 중이다(Wang et al., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62(4), 1241-1247). 최근에는 종 특이 프라이머를 이용한 PCR 기법(species specific PCR, 이하 "SS-PCR"이라 약칭함)을 사용하고 있는데, 상기 방법은 게놈 유전자의 특정 부위가 종간 염기서열에 있어서 차이가 있다는 점을 이용하여 종 특이적인 프라이머를 사용한 유전자 증폭을 통하여 특정 종에서만 특이적인 PCR 산물을 생산하게 하는 원리이다(Matsuki et al., Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65(10), 4506-4512). SS-PCR의 주요 대상 유전자로 많이 연구된 것은 16S, 23S rRNA 및 16S-23S rRNA 사이 지역(interspacial region)으로 이들에 관한 염기서열 정보는 다양한 웹기반의 데이타베이스들에 공개되어 있다(Naimi et al., Microbiol., 1997, 143(6), 823-834). 이들 염기서열 내의 변이 지역을 프라이머 대상 부위로 이용하여 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus)를 포함한 유산균 속내의 종 분류가 가능함이 다수 보고 되었다(Angeletti et al., J. Clin. Microbiol., 2001, 39(2), 794-797; Walter et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(1), 297-303). 또한, 장내환경 등 여러 균주가 혼재된 상태에서 원하는 종들의 SS-PCR 프라이머를 혼합하여 사용함으로써 원하는 균주들의 존재 유무를 신속, 정확하게 확인하거나 균주들을 분류, 동정하는 다중 PCR(multiplex PCR) 기법들도 최근 많이 보고되고 있다(Lee, et al., FEMS Microbiol. Letters., 2000, 193, 243-47).
그러나 현재까지 알려진 16S rRNA와 23S rRNA 등을 기반으로 하는 다양한 다중 PCR 방법을 사용하여도 16S rRNA에서의 종특이 변이 지역의 제한성 및 23S rRNA 지역에 관한 정보의 부족과 염기서열 길이의 한계 등으로 단일 PCR 반응을 통한 다수의 락토바실러스 종의 분류 및 동정은 불가능한 실정이다(Song, et al.,
FEMS Microbiol. Letters., 2000, 187, 167-173).
이에, 본 발명자들은 종 특이적 프라이머를 이용한 PCR 기법을 사용하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 정확하고 간편하게 동정하기 위해 연구하던 중, 다양한 균종의 염기서열 데이터를 바탕으로 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역을 포함하는 염기서열들을 사용하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종 공통적 서열 및 균종 특이적 서열을 확보하였으며 이를 이용하여 180 bp에서 1090 bp에 이르는 다양한 크기의 PCR 산물이 생성될 수 있도록 다중 PCR 프라이머 세트를 제작하였다. 이 프라이머 세트를 사용할 경우 단일 PCR 반응을 통하여 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종을 간편하고 정확하게 동정할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 PCR 방법을 통해 검사체 내의 락토바실러스 속 균종을 검출하고 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 PCR 방법을 통해 검사체 내의 락토바실러스 속 균종을 검출하고 동정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제공한다.
본 발명의 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 또는 16S rRNA와 23S rRNA 사이지역 유전자를 이용하여 제작한 것으로, 상기 유전자의 특정 부분의 염기 서열 또는 이것과 상동하는 염기 서열이다. 서열번호 1 내지 서열번 호 8로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종 특이적인 프라이머이며, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종에 공통적인 프라이머이다.
서열번호 1로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 애시도필러스 속 균주의 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:22128340, 6537241, 1771113 및 1771109 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 2로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 불가리쿠스 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:15982695, 15982694, 15982693, 2588893, 43981 및 175022 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 3으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이 및 락토바실러스 람노서스 16S rRNA 유전자 염기서열(각각 GI:14583099, 1848057, 1848056, 1848055, 1848054, 1848053, 1848052, 1843428, 1843427, 20257220, 12382750, 6996495, 43970, 175023, 7621525, 7621504, 1808583, 7159888, 7159887, 6996530, 7621503 등; GI:6552383, 6537239 등; GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 4로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) 균종의 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 가쎄리 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열(GI:6537236 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 5로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 파라카제이 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:6552383, 6537239 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 6으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 플란타룸 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:6537237, 20086379, 20086378, 20086376, 20086375, 20086372, 3046893, 2738840, 3420786 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 7로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 균종의 23S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 람노서스 23S rRNA 유전자 염기서열(GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 제조하였다.
서열번호 8로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 루테리 16S rRNA 유전자 염기서열(GI:3420786, 388037 등)을 이용하 여 제조하였다.
서열번호 9로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 기재한 8종의 프로바이오틱(probiotic) 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 제조하였다.
서열번호 10으로 기재되는 프라이머는 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열에 해당하는 것으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 기재한 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 제조하였다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용한 다중 PCR(multiplex PCR) 방법을 통해 락토바실러스 속 균종을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 속 균종을 동정하는 방법은
1) 검사체 및 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머와 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 가지는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머를 이용하여 다중 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
2) 단계 1을 통한 PCR 산물의 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1에 있어서, 검사체는 락토바실러스 속 균주를 포함하고 있는 시료의 일부를 직접 검사체로 사용할 수도 있으며, 적당한 배지에 배양하여 수득된 콜로니 자체를 사용하거나 콜로니로부터 분리된 염색체 DNA를 사용할 수 있다. 시료는 락토바실러스 속 균주를 함유하는 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품 및 캡슐제제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 염색체 DNA는 공지의 DNA 추출법에 의해 콜로니로부터 분리될 수 있으며, PCR 반응의 주형으로 사용할 때에는 약 0.01 ㎍ 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, PCR 반응 주형으로 사용하기 위해서 균주의 콜로니는 1 ×105 cfu 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하며, 시료를 직접 검사체로 사용할 경우 상기와 동일한 콜로니 이상을 포함하도록 적절하게 희석한 현탁액으로부터 간단한 처리를 통해 얻은 균체를 사용할 수도 있다. 또한, 검사체로 사용하는 균주의 염색체 DNA 또는 균주의 콜로니는 단독으로 사용하거나 이들의 혼합으로 사용할 수 있다. PCR 반응은 통상적인 방법에 따라 실시한다.
상기 단계 2에 있어서, PCR 산물의 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 측정하는 것은 통상적인 방법, 예를 들어 젤 전기영동법을 통해 수행할 수 있다. 본 발명에서 제조한 프라이머는 락토바실러스 속 균종마다 각각 다른 크기의 PCR 증폭산물을 형성하도록 제조된 것이기 때문에 PCR 반응을 통해 증폭된 산물의 크기를 비교하면 검사체 내에 포함되어 있는 다양한 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 동시에 동정할 수 있다.
즉, 서열번호 1 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 애시도필러스, 서열번호 2 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 불가리쿠스, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 가쎄리, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머쌍을 이용하여 락토바실러스 루테리, 서열번호 6 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 플란타룸, 서열번호 7 및 서열번호 9 또는 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 람노서스, 서열번호 5 및 서열번호 9 또는 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 파라카제이 및 서열번호 3 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 카제이를 동정할 수 있다. 또한, 상기 각 균주에 해당하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하는 다중 PCR(multiplex PCR) 반응을 수행함으로써 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 플란타 룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 파라카제이 및 락토바실러스 카제이로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균종을 동시에 동정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 단일한 종의 락토바실러스 속 균주 염색체 DNA와 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 각 균주 특이적으로 증폭된 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었다(도 2 참조). 또한, 여러 종의 균주가 혼합된 락토바실러스 균주 콜로니와 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 혼합액을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 균주가 혼합되어 있어도 각 균종 특이적으로 증폭된 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었다(도 3 참조).
본 발명의 락토바실러스 속 균종의 동정방법은 여러 종류의 락토바실러스가 혼재되어 있더라도 단일 PCR 반응을 통해 종의 분포 및 동정을 신속하고 정확하게 수행할 수 있어 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종을 이용한 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강 보조식품, 정장약품 및 캡슐제제의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 락토바실러스 속 균종 탐지용 프라이머의 제조
락토바실러스 속 균종을 탐지하기 위한 PCR 방법을 수행하는데 사용되는 프라이머를 작성하기 위해 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA, 23S rRNA 및 16S rRNA와 23S rRNA사이 지역 유전자에 대한 대량의 서열정보를 이용하여 녹는점(Tm) 값이 50℃를 넘도록 길이를 조절하고 헤어핀(haipin)구조나 다이머(self-dimer)가 생성되지 않는 범위로 각 종에 따른 특이적인 염기서열 및 공통 염기서열을 탐색하여 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) 23S rRNA 유전자의 염기 서열(GI:22128340, 6537241, 1771113 및 1771109 등)을 이용하여 서열번호 1로 기재되는 프라이머를 제작하고, 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus) 16S rRNA 유전자의 염기서열(GI:15982695, 15982694, 15982693, 2588893, 43981 및 175022 등)을 이용하여 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 제작하였다. 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 16S rRNA 유전자의 염기서열(각각 GI:14583099, 1848057, 1848056, 1848055, 1848054, 1848053, 1848052, 1843428, 1843427, 20257220, 12382750, 6996495, 43970, 175023, 7621525, 7621504, 1808583, 7159888, 7159887, 6996530, 7621503 등; GI:6552383, 6537239 등; GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 제조하였다. 락토바실러스 가쎄리(L. gasseri) 16S rRNA 유전자와 23S rRNA 유전자 사이지역 염기서열(GI:6537236 등)을 이용하여 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 제작하고, 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 23S rRNA 유전자의 염기서열(GI:6552383, 6537239 등)을 이용하여 서열번호 5로 기재되는 프라이머를 제작하였다. 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 23S rRNA 유전자의 염기서열(GI:6537237, 20086379, 20086378, 20086376, 20086375, 20086372, 3046893, 2738840, 3420786 등)을 이용하여 서열번호 6으로 기재되는 프라이머, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 23S rRNA 유전자의 염기서열(GI:20086370, 6537244, 6815814 등)을 이용하여 서열번호 7로 기재되는 프라이머를 제작하고, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 16S rRNA 유전자의 염기서열(GI:3420786, 388037 등)을 이용하여 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 제작하였다.
또한, 상기에서 제작한 종 특이적인 프라이머와 함께 PCR을 수행하기 위한 나머지 프라이머로 상기 8가지 종의 염기서열에 존재하는 공통적인 서열을 탐지하는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 프라이머와 쌍으로 PCR 반응을 하기 위한 정방향의 프라이머로 상기에 기재한 8종의 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 서열번호 9로 기재되는 프라이머를 제작하였고, 역방향의 프라이머로 상기 8종의 락토바실러스 속 균종의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 제작하였다.
상기에서 제조한 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머가 부착되는 위치 및 PCR 증폭시 예상되는 증폭 산물의 크기를 도 1a에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이 락토바실러스 람노서스 (0.45 kb)는 락토바실러스 플란타룸(0.43 kb)과 증폭되는 산물의 크기가 비슷하고, 락토바실러스 파라카제이 (0.65 kb)는 락토바실러스 애시도필러스(0.6 kb)와 증폭되는 산물의 크기가 비슷하기 때문에 이를 구분하기 위해 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 람노서스를 증폭할 수 있는 또 다른 프라이머로 락토바실러스 카제이를 증폭하는 프라이머와 동일한 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 제작하였다.
<실시예 2> 락토바실러스 속 균종 탐지용 프라이머를 이용한 락토바실러스 속 표준균주의 탐지
종특이 및 종공통 프라이머를 이용한 PCR 증폭산물이 종별 특이성을 가지는지 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 각각의 종특이 프라이머 및 종공통 프라이머 쌍을 이용하여 8종의 락토바실러스 표준균주의 염색체로부터 얻어진 DNA를 주형으로한 종특이 중합효소 연쇄반응(species specific PCR, SS-PCR) 분석을 실시하였다. 구체적으로, 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종의 표준균주인 락토바실러스 애시도필러스(ATCC 4356), 락토바실러스 불가리쿠스(ATCC 11842), 락토바실러스 카제이(ATCC 334), 락토바실러스 가쎄리 (ATCC 33323), 락토바실러스 파라카제이(ATCC 25302), 락토바실러스 플란타룸(ATCC 14917), 락토바실러스 루테리(ATCC 3594) 및 락토바실러스 람노서스(ATCC 7469)로부터 바마넨 등의 방법에 의해 염색체를 분리하였다(Varmanen et al., Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, 1831-1836). 상기에서 분리한 염색체 DNA 0.25 ㎍과 종특이 및 종공통 프라이머를 각각 125 p㏖ 혼합하여 96℃에서 5분간 가열하고, 61℃에서 1분간 단일 가닥의 염색체 DNA와 프라이머를 결합시킨 후 68℃에서 2분간 중합반응을 시키고, 94℃ 에서 30초, 61℃에서 20초, 68℃에서 40초 중합반응을 총 35회 수행한 뒤 마지막으로 68℃에서 7분간 반응시켰다. 상기 반응은 각 균주를 증폭하기 위한 프라이머 쌍 이외에도 나머지 균주를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로도 동일하게 PCR 반응을 수행하여 각 균주 특이적으로 PCR 증폭 산물이 나오는지를 확인하고자 하였다. 최종 생성된 PCR 반응물 20 ㎕를 취하여 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색하여 증폭된 PCR 산물의 밴드 양상을 관찰하였다. 상기에서 락토바실러스 종을 구별하기 위해 사용한 PCR 프라이머 쌍 및 반응후 수득된 PCR 산물의 크기는 표 1에 나타내었으며 실제 9종의 표준균주에 대하여 8종 각 균종 특이 단일 프라이머 쌍을 이용한 PCR 결과는 도 1b와 같다.
그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 상기 도 1a에 기재된 반응 후 수득될 PCR 산물의 크기와 동일하게 각 균주의 DNA로부터 증폭된 PCR 산물을 얻을 수 있었으며(표 1 및 도 1b), 다른 균종 특이적 프라이머를 사용한 PCR에서는 증폭된 PCR 산물을 얻을 수 없어 본 발명에서 제조한 서열번호 1 내지 서열번호 8로 기재되는 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머가 프로바이오틱 락토바실러스 균종을 탐색하는데 유용한 프라이머 임을 알 수 있었다.
| 검출 미생물 | 프라이머 | 증폭산물의 크기 (kb) |
|
| 정방향 | 역방향 | ||
| 락토바실러스 애시도필러스 | 서열번호 9 | 서열번호 1 | 0.60 |
| 락토바실러스 불가리쿠스 | 서열번호 2 | 서열번호 10 | 0.18 |
| 락토바실러스 가쎄리 | 서열번호 9 | 서열번호 4 | 0.28 |
| 락토바실러스 루테리 | 서열번호 8 | 서열번호 10 | 1.09 |
| 락토바실러스 플란타룸 | 서열번호 9 | 서열번호 6 | 0.43 |
| 락토바실러스 람노서스 | 서열번호 9 | 서열번호 7 | 0.45 |
| 서열번호 3 | 서열번호 10 | 0.71 | |
| 락토바실러스 파라카제이 | 서열번호 9 | 서열번호 5 | 0.65 |
| 서열번호 3 | 서열번호 10 | 0.71 | |
| 락토바실러스 카제이 | 서열번호 3 | 서열번호 10 | 0.71 |
<실시예 3>
프라이머 혼합액을 이용한 프로바이오틱 락토바실러스 속 표준균주의 탐지
균주의 동정을 단회의 PCR로 수행하기 위해 한 종의 균주에 대해 나머지 8종의 여러 종류의 프라이머를 하나의 반응에서 동시에 반응시킴으로써 효율적으로 종을 동정할 수 있는 다중 PCR(Multiplex PCR) 방법을 수행하였다. 본 발명에서 다중 PCR이라 함은 단일 종의 균주를 다종의 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하거나, 다종의 균주를 다종의 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 것을 뜻한다. PCR 방법은 상기 실시예 2에서 수행한 것과 동일하며, PCR을 수행하기 위한 프라이머는 한 균주의 염색체 DNA에 대해 모든 균주를 탐색하기 위한 프라이머(표 1)를 동일한 비율로 혼합하여 다중 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 다중 PCR을 수행한 후의 PCR 산물은 도 1a에 기재된 예상 PCR 산물 크기와 동일하였다(도 2). 상기 결과로부터 본 발명에서 제작한 종특이 다중 프라이머 혼합액을 사용한 PCR 반응은 프로바이오틱 락토바실러스 표준균주 모두에 대해 종특이 PCR 증폭산물을 특이적으로 생산하므로, 본 발명의 종특이 프라이머는 종특이 다중 PCR 수행에 있어 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4> 혼합 균주로부터 락토바실러스 속 균주의 탐지
<4-1> 균주의 콜로니를 이용한 다중 PCR
다중 PCR 방법을 이용하여 락토바실러스 속 균종을 간편하게 검색하기 위해서는 균주의 염색체 DNA를 추출하는 것이 번거롭기 때문에 배양한 균주의 콜로니(bacterial colony)로부터 직접 PCR 반응이 가능하여야 한다. 이를 확인하기 위해 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 속 표준균주의 콜로니를 각각 멸균수에 혼탁시킨 현탁액을 PCR 반응을 위한 검사체로 사용하고, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재되는 프라이머의 혼합액을 이용하여 다중 PCR을 수행하였다.
그 결과, 각 균주의 콜로니를 멸균수에 혼합한 현탁액(탁도가 600nm 파장에서 1.0) 1 ㎕를 주형으로 한 PCR 산물은 각 균주에서 분리한 0.15 ㎍의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물의 결과와 거의 동일하게 나왔으며, 단일 균주의 콜로니를 사용한 PCR에서는 8종의 표준균주 모두 1 ×105 cfu의 농도까지 각 종별 특이밴드를 생산해 내었다. 결과적으로 600 nm 파장에서 0.8-1.0의 탁도인 균주의 현탁액을 PCR 반응의 총 부피에 대해 1/10로 사용하였을 경우에 8종 표준균주 모두에서 도 2와 동일한 증폭산물을 생산함을 알 수 있었다.
<4-2> 혼합 균주 콜로니를 이용한 다중 PCR 수행
상기 실시예 <4-1>에서 균주의 콜로니를 PCR 반응의 주형으로 사용하여도 염색체 DNA를 주형으로 한 다중 PCR과 동일한 결과를 보임을 확인하였기 때문에, 균주의 콜로니를 PCR 반응의 검사체로 사용할 때에 균주의 콜로니를 혼합하여 다중 PCR을 수행하여도 균주 특이적으로 PCR 증폭되는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 8종의 프로바이오틱 락토바실러스 표준균주들의 콜로니들을 2, 3종 또는 6종까지 불균등한 비율로 혼탁시킨 세포 현탁액(OD600nm=1.0)을 PCR 반응의 주형으로 하여 전체 PCR 반응액의 1/10로 첨가한 후 다중 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 상기 실시예 2에서 기재된 바와 동일하게 수행하였다.
그 결과, 사이즈 마커의 각 밴드와 비교하였을 때 여러 종류의 락토바실러스 균주가 혼합되어 있어도 도 1a에 기재된 예상 PCR 증폭 산물과 동일하게 각 종별 특이 밴드를 재현성 있게 증폭함을 알 수 있었다(도 3). 따라서, 본 발명의 프라이머는 균주를 혼합하여 수행하는 다중 PCR 방법에도 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5> 다중 PCR을 이용한 락토바실러스 균종 동정의 정확도 검사
상기 실시예 1 내지 실시예 4를 통해 다중 프라이머를 이용한 PCR 반응을 이용하여 8종의 락토바실러스 표준균주들을 모두 정확하게 특이적으로 탐지하는 것이 가능함을 확인하였다. 다음으로 이러한 다중 PCR을 통해 증폭된 PCR 산물이 실제 탐색하고자 하는 균종의 염색체 DNA를 증폭한 것인지 확인함으로써 균주 동정의 정확도를 검사하고자하였다. 구체적으로, 표준균주이거나 혹은 KCTC(Korean collection for type cultures)로부터 분양받은 락토바실러스 속의 여러 종에 속하는 총 29개의 분양주(표 2)에 대하여 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재된 프라이머의 혼합액을 이용한 다중 PCR을 실시하였으며, 각각의 균주들에 대해서는 생화학적 동정방법인 API 검사법(Chang, et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 27(1), 23-27)을 병행하여 락토바실러스 속 균종 동정의 정확도를 측정하였다.
다중 PCR에 의한 균주 동정 결과, 락토바실러스 애시도필러스(ATCC 1039), 락토바실러스 아밀로보루스(L. amylovorus)(ATCC 33620) 및 락토바실러스 존소니이(L. johnsonii)(JCM 1022) 의 3 균주에서 다른 결과를 보여 평균 89.7%의 정확도를 보였다. 또한, API 검사법에 의한 균주 동정 결과, 락토바실러스 아밀로필러스(L. amylophilus)(DSM 20533), 아밀로보루스(ATCC 33620), 락토바실러스 카제이(ATCC 334), 락토바실러스 카제이(ATCC 393), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 19992), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 33323), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 9857), 락토바실러스 헬베티쿠스(L. helveticus)(ATCC 15009), 락토바실러스 젠세니이(L. jensenii)(ATCC 25258), 락토바실러스 존소니이(JCM 1022), 락토바실러스 루테리(ATCC 23272) 및 락토바실러스 루테리(LMG 13090)의 12균주에서 다른 결과를 보여 58.6 %의 정확도를 보였다. API 검사법이 데이터베이스에 포함되지 않는 균주들에 대해서도 근처의 유연 균주로 표시됨을 감안하여도, 다중 PCR 동정법과 API 검사법은 락토바실러스 애시도필러스(ATCC 1039), 락토바실러스 아밀로보루스(ATCC 33620), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 19992), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 33323), 락토바실러스 가쎄리(ATCC 9857), 락토바실러스 헬베티쿠스(ATCC 15009), 락토바실러스 존소니이(JCM 1022) 등 7균주에서 차이를 보여 75.9%(22/29)의 일치도를 나타내었다(표 2). 상기 결과들을 종합할 때, API 검사법이 다중 PCR 방법에 의한 결과에 비하여 동정의 신뢰도가 떨어짐을 알 수 있었다. 이는 API 검사법이 균주의 배양과정에서 함유하고 있는 다양한 효소의 활성 정도를 검사액의 색도의 변화로 측정하는 것이므로 반응 시간의 차이에 따른 검사액 색도의 차이 변화에 따라 판정 결과가 모호할 수 있으며 또한 판정을 위해 사용되는 데이터베이스의 제한성이 존재하는 등 실험 결과의 정확도가 떨어지기 때문으로 생각된다. 이에 반하여 다중 PCR 방법은 균주의 유전자 차이 여부에 근거하는 것으로 8균주의 프로바이오틱 락토바실러스 종에 대해서는 정확한 동정이 가능함을 볼 수 있었다.
| 분양 균주 명 | 다중 PCR | API 검사법 | |||
| 종 (species) |
아종 (subspecies) |
균주*
(strain) |
동정 결과* | 동정 결과* | 정확도*
(ID; %) |
| L. acidophilus | ATCC 4356T | L. acidophilus | L. acidophilus | 99.8 | |
| L. acidophilus | ATCC 832 | L. acidophilus | L. acidophilus | 99.8 | |
| L. acidophilus | ATCC 1039 | L. gasseri | L. acidophilus | 89.2 | |
| L. amylophilus | DSM 20533T | - | L. crispatus | 63.7 | |
| L. amylovorus | ATCC 33620T | L. gasseri | L. crispatus | 98.9 | |
| L. casei | casei | ATCC 334T | L. casei | L. paracasei | 78.0 |
| L. casei | casei | ATCC 393 | L. casei | L. paracasei | 68.6 |
| L. crispatus | JCM 5808 | - | L. crispatus | 99.6 | |
| L. crispatus | JCM 5810 | - | L. crispatus | 98.9 | |
| L. curvatus | ATCC 25601T | - | L. curvatus | 95.4 | |
| L. delbrueckii | bulgaricus | ATCC 11842T | L. delbrueckii | L. delbrueckii | 94.3 |
| L. delbrueckii | delbrueckii | ATCC 9649T | L. delbrueckii | L. delbrueckii | 99.8 |
| L. delbrueckii | lactis | ATCC 21051T | L. delbrueckii | L. delbrueckii | 78.7 |
| L. fermentum | ATCC 14931T | - | L. fermentum | 99.4 | |
| L. gasseri | ATCC 19992 | L. gasseri | L. acidophilus | 99.5 | |
| L. gasseri | ATCC 33323T | L. gasseri | L. acidophilus | 97.8 | |
| L. gasseri | ATCC 9857 | L. gasseri | L.acidophilus | 89.6 | |
| L. helveticus | ATCC 15009T | - | L. acidophilus | 88.7 | |
| L. jensenii | ATCC 25258T | - | L. crispatus | 63.2 | |
| L. johnsonii | JCM 1022 | L. gasseri | L. acidophilus | 99.3 | |
| L. paracasei | paracasei | ATCC 25302T | L. paracasei | L. paracasei | 77.9 |
| L. paracasei | paracasei | ATCC 27216 | L. paracasei | L. paracasei | 82.5 |
| L. paracasei | tolerans | ATCC 25599T | L. paracasei | L. paracasei | 89.8 |
| L. plantarum | ATCC 10012 | L. plantarum | L. plantarum | 75.3 | |
| L. plantarum | ATCC 14917T | L. plantarum | L. plantarum | 97.3 | |
| L. rhamnosus | ATCC 7469T | L. rhamnosus | L. rhamnosus | 99.8 | |
| L. reuteri | ATCC 23272T | L. reuteri | L. fermentum | 92.6 | |
| L. reuteri | LMG 13090 | L. reuteri | L. fermentum | 99.2 | |
| L. salivarius | salicinius | ATCC 11742T | - | L. salivarius | 92.5 |
상기에서 T는 표준균주를 의미하고, - 는 다중 PCR 결과 PCR 증폭 산물이 없음을 의미한다. ID는 API 결과에 대한 정확도로 데이터베이스에 있는 미생물 종과의 관계에서 얼마나 가까운 성질을 가지고 있는지에 대한 결과로써 ID %가 높을수록 확률적으로 거의 근접한 미생물로 판단한다.
또한, 상기 API 결과에서는 락토바실러스 카제이와 락토바실러스 파라카제이를 유사균주으로 규정하기 때문에 모두 동일하게 락토바실러스 파라카제이라고 표기되었다.
<실시예 6> 동정된 락토바실러스 속 균주의 확인 실험
상기 실시예 5에서 다중 PCR을 수행한 결과 어떠한 증폭 산물도 생산해 내지 않은 9개의 균주들에 대한 결과(표 2)가 PCR 진행 여부와 상관없는 결과인지 확인하기 위하여, 프로바이오틱 락토바실러스 속에 공통적인 프라이머쌍을 사용한 PCR을 진행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 5의 29개의 락토바실러스 속 균주들을 동시에 확인하기 위해 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종 특이 프라이머인 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 프라이머 및 표 2에 기재된 29개의 균주를 이용하여 상기 실시예와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 29개의 락토바실러스 속 이외에도 다른 속인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, ATCC 6051), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum ATCC 29521), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve, ATCC 15700), 비피도박테리움 인펀티스(Bifidobacterium infantis, ATCC 15697), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum, ATCC 15707), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis, ATCC 19433) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium ATCC 19434)를 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 상기 29개의 모든 균주에서 락토바실러스 특이적인 PCR 증폭산물을 생산해 내었으며, 대조군인 바실러스, 비피도박테리움 및 엔테로코커스는 PCR 증폭산물을 생산하지 않았다. 따라서, 다중 PCR을 이용한 프로바이오틱 락토바실러스 균주 동정법은 락토바실러스 속 균주만을 특이적으로 검출함을 알 수 있었다.
<실시예 7> 프로바이오틱 락토바실러스 함유 균제품으로부터 락토바실러스 균주의 동정
본 발명의 다중 PCR을 이용하여 시판되는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종 함유 제품으로부터 락토바실러스 속 균주를 동정할 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 6종류의 프로바이오틱 락토바실러스 균주 함유 제품으로부터 균주를 분리한 후 이 균주에 대해 다중 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행 방법은 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일하게 수행하였다. 또한, 각각의 균주에 대해서는 API 검사법을 병행하여 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 기재된 염기서열을 가지는 프라이머 혼합액을 이용한 다중 PCR 결과와 비교하여 락토바실러스 속 균종 동정의 정확도를 측정하였다.
그 결과, 다중 PCR 동정은 분양 균주의 목록과 3 균주에서만 동일한 결과를 보였으며, 이러한 결과는 API 검사법의 결과와도 유사하였다. API 검사법은 데이터베이스에 포함되지 않는 균주들에 대해서도 근처의 유연 균주으로 표시됨을 감안할 때 다중 PCR 동정법과 API 검사법은 83.3%(5/6)의 일치도를 보였다(표 3).
| 락토바실러스 함유 균제품 | 다중 PCR | API 검사법 | ||
| 제품명 | 표시 균주 명 (Species) |
동정 결과 | 동정 결과* | 정확도*
(ID; %) |
| A | L. acidophilus | L. acidophilus | L. acidophilus | 98.9 |
| B | L. acidophilus | L. acidophilus | L. acidophilus | 99.9 |
| C | L. acidophilus | L. gasseri | L. acidophilus | 68.3 |
| D | L. acidophilus | L. rhamnosus | L. paracasei | 78.6 |
| E | L. acidophilus | L. rhamnosus | L. rhamnosus | 97.6 |
| F | L. rhamnosus | L. rhamnosus | L. rhamnosus | 99.8 |
상기에서 ID는 API 검사 결과에 대한 정확도로 데이터베이스에 있는 미생물 종과의 관계에서 얼마나 가까운 성질을 가지고 있는지에 대한 결과로써 ID %가 높을수록 확률적으로 거의 근접한 미생물로 판단한다.
상기 API 결과에서는 락토바실러스 카제이와 락토바실러스 파라카제이를 유사균주으로 규정하기 때문에 모두 동일하게 락토바실러스 파라카제이라고 표기되었다.
<실시예 8> 락토바실러스 속 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석
상기 실시예 7에서 수행한 프로바이오틱 락토바실러스 균주 함유 제품에 표기되어 있는 함유 균주명 (표시 균주명)과 다중 PCR 동정, 그리고 API 검사 결과가 모두 다른 제품에 대하여 정확한 동정을 수행하기 위해 이들 중 C제품으로부터 분리된 균주(이하 'C'라 약칭함)와 D제품으로부터 분리된 균주 (이하 'D'라고 약칭함)의 분자생물학적 동정을 실시하였다. 이를 위하여 C와 D를 각각 MRS 고체 배지(DifcoTM Lactobacilli MRS Broth, Difco 및 1.5% 한천)에 접종하여 37℃에서 2일간 배양하여 활성화시킨 후 지름 2 ㎜ 정도의 단일 콜로니(colony)를 취하여 600 ㎚ 파장에서 0.8-1.0 정도의 탁도를 가지도록 상기 콜로니를 멸균수에 현탁시켜 -20℃에 저장하여 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 균주 각각의 16S rRNA 유전자를 분리하기 위해 상기 멸균수에 현탁된 샘플을 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되는 프라이머를 1:1 비율로 섞은 혼합 프라이머와 결합시켜 콜로니 PCR 방법으로 증폭시켰다. 상기 증폭된 16S rRNA 유전자 분획물을 1% TAE 완충액(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)을 사용하여 0.75% 아가로스 겔 상에서의 전기영동 방법으로 분리하였다. 전기영동이 끝난 겔을 에티듐-브로마이드 염색 및 UV 조사한 후 원하는 DNA 단편이 있는 젤을 일정한 크기로 절단하였고, 유전자크린 키트(Gene Clean Kit, Bio101)를 사용하여 DNA를 정제하고 BamHI과 XhoI 제한효소로 이중 절단하여 pcDNA3.1/Hygro(+)(5.6 kb) 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 연결하였다. C와 D의 16S rRNA 유전자가 pcDNA3.1/Hygro(+) 플라스미드 벡터에 연결된 플라스미드(각각 7.1 kb)로 대장균 숙주세포를 형질전환 시킨 후 형질전환 된 세포만을 선별하여 대량 배양함으로써 원하는 플라스미드를 대량 확보하였다. 확보된 플라스미드는 다시 유전자크린 키트로 정제하였으며 16S rRNA 유전자 단편은 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 기재되는 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 반응은 싸이클 시퀀싱 키트(cycle sequencing kit, Perkin Elmer)와 염료 종결제(dye terminator)를 사용하여 실시하였고, 자동 DNA 서열 분 석기(ABI prism 310 automatical DNA sequencer)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 또한, 분석한 염기서열을 이미 알려진 균주의 16S rRNA 유전자 염기 서열과의 유사성을 비교하기 위해 블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program : National Institute of Biotechnology Information)으로 비교하였다. 또한, 실제적인 분자생물학적 동정을 위하여 GenBank에 등록된 9개의 속과 락토바실러스속 내의 85개의 종 그리고 락토바실러스 애시도필러스와 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 젠세니이 등을 포함하는 애시도필러스 군의 33개 균주에 대한 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후 계통수(phylogenic tree)에서의 위치를 판별하였다. 다중 서열 정렬 프로그램(multiple sequence alignment program)은 ClustalX를 사용하였다.
그 결과, C와 D의 16S rRNA 유전자는 각각 1,531 bp와 1,528 bp 길이를 가지고 있었다. 블라스트 유사성 조사 검색 결과, C는 락토바실러스 가쎄리 균주인 BLB1b(GI: 7621501), DSM 20243(GI: 175028), KC5a(GI: 7621522), KC36a(GI: 7621508), KC26(GI: 7621513), BLB3(GI: 7621499), KC29(GI: 7621514), TL33a(GI: 7621530)와 99.1-99.7%로 평균 99.5%의 높은 유사도를 나타내었다. 이에 반하여, 락토바실러스 애시도필러스 균주인 ATCC 4356, NCDO 1748, BMF6Lb6과는 평균 90.8%의 상동성을 나타내어 상기 균주는 락토바실러스 가쎄리로 판단되었다. 또한 계통수 위치 판별 결과, C의 16S rRNA 유전자는 락토바실러스 가쎄리에 가장 가까운 위치에 배치되었다(도 4).
또한, D의 염기서열은 락토바실러스 람노서스 균주인 F11(GI: 7621503), ATCC 7469(GI: 1848056), DSM 20021(GI: 175023)과 각각 99.5, 99.3, 98.4%의 상동성으로 평균 99.1%의 상동성을 보였다. 이에 반하여, 락토바실러스 애시도필러스 균주인 ATCC 4356, NCDO 1748, BMF6Lb6과는 평균 82.3%의 상동성을 나타내어 D 균주는 락토바실러스 람노서스로 판단되었으며, 계통수에서의 위치 판별 결과 계통수 상에서 D의 16S rRNA 유전자는 락토바실러스 람노서스에 가장 가까운 위치에 배치되었다(도 4).
따라서, 16S rRNA 유전자를 이용한 분자생물학적 동정결과 C는 락토바실러스 가쎄리로 D는 락토바실러스 람노서스로 판정할 수 있었으므로, 제품의 표시 균주명과 API 시험법 그리고 다중 PCR 동정법 중 PCR 결과만이 분자생물학적 동정과 정확히 일치함을 알 수 있었다. 이러한 이유는 표시 균주명은 비교적 오래된 동정법 및 동정기준을 이용하였기 때문일 것으로 생각되며, API 결과는 그 데이터베이스의 제한성과 배양결과의 미묘한 차이에서 비롯된 데이터 분석의 오류에 기인한 것으로 사료된다. 이에 반하여 다중 PCR 방법은 8종의 락토바실러스 종들 간 정확한 유전자의 차이에 근거한 방법으로써 유사균주 내역 그리고 균주의 배양상태 및 사멸 여부에 상관없이 항상 동일한 결과를 나타내는 동정 방법이므로 이 방법을 사용할 경우 기존의 동정법보다 휠씬 신속하고 정확하며 재현성 있는 결과를 제공함을 알 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 속 균종에 특이적인 프라이머를 이용한 다중 PCR 방법은 락토바실러스 속 균종을 간편하고 신속, 정확하게 동정할 수 있으므로, 프로바이오틱 락토바실러스 속 균주를 이용한 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강 보조식품, 정장약품 및 캡슐제제의 원료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
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lactobacillus species
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<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. acidophilus reverse primer
<400> 1
aactatcgct tacgctacca ctttgc 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. bulgaricus forward primer
<400> 2
ctgtgctaca cctagagata ggtgg 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus forward primer
<400> 3
tggtcggcag agtaactgtt gtcg 24
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. gasseri reverse primer
<400> 4
atttcaagtt gagtctctct ctcttctcgg 30
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L paracasei reverse primer
<400> 5
ccggccagct atgtattcac tgaca 25
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. plantarum reverse primer
<400> 6
ctagtggtaa cagttgatta aaactgctgg g 31
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. rhamnosus reverse primer
<400> 7
gcggttatgc gatgcgaatt tctattatt 29
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. reuteri forward primer
<400> 8
acctgattga cgatggatca ccagt 25
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus species reverse primer
<400> 9
ccaccttcct ccggtttgtc a 21
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus species forward primer
<400> 10
agggtgaagt cgtaacaagg tagcc 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus specific forward primer
<400> 11
ggaaacagrt gctaataccg 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus specific reverse primer
<400> 12
cyctcaaaac traacaaagt ttc 23
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ID8-F
<400> 13
gggggatcca gagtttgatc ctggctca 28
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ID8-R
<400> 14
gggctcgagt accttgttac gacttcacc 29
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7-F
<400> 15
taatacgact cactataggg 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BGH-R
<400> 16
tagaaggcac agtcgagg 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ID13S-F
<400> 17
taactacgtg ccagcagc 18
Claims (7)
- 락토바실러스 속 균종 특이적 프라이머로서,서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드; 및락토바실러스 속 균종 공통적 프라이머로서,서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 혼합물을 포함하되,여기서,ⅰ) 락토바실러스 애시도필러스는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되고,ⅱ) 락토바실러스 불가리쿠스는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되며,ⅲ) 락토바실러스 가쎄리는 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되며,ⅳ) 락토바실러스 루테리는 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되며,ⅴ) 락토바실러스 플란타룸은 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드 로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되며,ⅵ) 락토바실러스 람노서스는 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되며,ⅶ) 락토바실러스 파라카제이는 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되며,ⅷ) 락토바실러스 카제이는 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 동정되는 것을 특징으로 하는,락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 루테리로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 락토바실러스 속 균종 동정용 조성물.
- 삭제
- 1) 검사체를 주형으로 하고, 제 1항의 조성물을 이용하여 다중 PCR을 수행한 후, PCR 반응 산물을 얻는 단계; 및2) 상기 얻어진 PCR 반응 산물이ⅰ) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 0.6 kb이면 락토바실러스 애시도필러스이고;ⅱ) 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 0.18 kb이면 락토바실러스 불가리쿠스이고;ⅲ) 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 0.28 kb이면 락토바실러스 가쎄리이고;ⅳ) 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 1.09 kb이면 락토바실러스 루테리이고;ⅴ) 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 0.43 kb이면 락토바실러스 플란타룸이고;ⅵ) 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 0.45 kb 및 0.71 kb이면 락토바실러스 람노서스이고;ⅶ) 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 0.64 kb 및 0.71 kb이면 락토바실러스 파라카제이이고; 및ⅷ) 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 쌍으로 증폭되고, 크기가 0.71 kb이면 락토바실러스 카제이로 동정하는 것을 특징으로 하는,단일 PCR 반응을 통한 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 루테리로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 락토바실러스 속 균종의 동정 방법.
- 제 3항에 있어서, 검사체는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종을 포함하고 있는 시료로부터 배양한 균주의 콜로니 또는 균주로부터 분리한 염색체 DNA인 것을 특징으로 하는 단일 PCR 반응을 통한 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 루테리로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 락토바실러스 속 균종의 동정 방법.
- 삭제
- 제 4항에 있어서, 시료는 프로바이오틱 락토바실러스 속 균종을 함유하는 발효유, 유아식, 유제품, 축산 농가 사료, 화장품, 건강보조식품, 정장약품 및 캡슐제제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단일 PCR 반응을 통한 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 가쎄리, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 루테리로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 락토바실러스 속 균종의 동정 방법.
- 삭제
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