KR101961648B1 - 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법 - Google Patents
바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출용 조성물 및 검출 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 특이적 프라이머 세트를 이용한 일반적인(conventional) PCR 또는 실시간(real-time) PCR 수행을 통해, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 김치와 같은 다양한 발효식품, 토양 등에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정성, 정량 분석과 밀도 변화의 모니터링 등에 효과적으로 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 특이적 프라이머 세트를 이용한 일반적인(conventional) PCR 또는 실시간(real-time) PCR 수행을 통해, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 김치와 같은 다양한 발효식품, 토양 등에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정성, 정량 분석과 밀도 변화의 모니터링 등에 효과적으로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출용 조성물 및 검출 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출방법에 관한 것이다.
바실러스(Bacillus) 속은 그람 양성(gram-positive), 포자 형성(spore-forming) 균으로, 발효에 의해 생육 가능한 호기성(aerobic)의 간균(rodshaped) 형태 박테리아(bacteria)이다. 바실러스 속 중 몇 가지 종 집단(group)은 병원성이 없고(non-pathogenic), 배양하기 간단하며, 프로테아제(protease), 아밀라제(amylase) 및 셀룰라아제(cellulase)와 같은 산업 분야에 유용한 효소(enzyme)를 분비한다(Arbige MV et.al., American Society for Microbiology, p.871-895, 2003). 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 그룹에는 밀접한 관련이 있는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)(Smith NR et.al., J Gen Microbiol ., 34:269-272, 1964; Nakamura LK et.al., Int J Syst Bacteriol., 49:1211-1215, 1999), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)(Skerman VBD et.al., Int J Syst Bacteriol ., 30:225-420, 1980), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)(Priest FG et.al., Int J Syst Bacteriol ., 37:69-71, 1987), 바실러스 애트로패우스(Bacillus atrophaeus)(Nakamura LK, Int J Syst Bacteriol ., 39:295-300, 1989), 바실러스 모자벤시스(Bacillus mojavensis)(Roberts MS et.al., Int J Syst Bacteriol ., 44:256-264, 1994), 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)(Roberts MS et.al., Int J Syst Bacteriol ., 46:470-475, 1996), 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. spizizenii)(Nakamura LK et.al., Int J Syst Bacteriol., 49:1211-1215, 1999)가 포함되어 있다.
생화학적 시험방법(biochemical test)이나 지방산 메틸 에스테르 프로파일링(fatty acid methyl ester profiling)에 기반을 둔 고전적 동정 및 검출 방법은 정확성이 떨어지고 많은 노동력이 요구되어 신속한 스크리닝 목적을 위해서는 적용할 수가 없다. 이러한 바실러스 서브틸리스 관련 종은 지방산 조성 분석(fatty acid composition analysis), 제한 효소 분석(restriction digest analysis) 및 DNA-DNA 혼성 분석(DNA-DNA hybridization analysis)에 의해 서로 구별될 수 있으나, 표현형 특성에 의해 구별하기는 매우 어렵다(Roberts MS et.al., Int J Syst Bacteriol., 44:256-264, 1994; Nakamura LK et.al., Int J Syst Bacteriol ., 49:1211-1215, 1999). 16S rRNA 서열을 유전자 검출 표적으로 사용하는 것이 고려 되어져 왔다. 그러나, 현재까지 알려진 수많은 바실러스 종은 다른 속(genera)에 비해 상당히 보존된 16S rRNA 서열을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이 분류학적 표지(taxonomic marker)의 사용은 일반적으로 인정되는 기준(criteria)에 따라 종 판별 및 검출에는 적합하지 않다(Stackebrandt E et.al., Int J Syst Bacteriol., 44:846-849, 1994). 이러한 비정상적인 유사성은 '바실러스 16S rRNA 그룹 I(Bacillus 16S rRNA group I)'의 멤버(member)에 대해 존재하는데, 상기 멤버는 바실러스 애트로패우스(B. atrophaeus)에 대한 16S rRNA 수준에서 99.3%의 유사성을 나타내고, 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(B. amyloliquefaciens)에 대한 98.3%의 유사성을 나타내는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)를 포함한다(Ash C et.al., Int J Syst Bacteriol ., 41:343-346, 1991).
한편, 산업적으로 유용한 미생물은 인간에게 유용한 항생제, 포도주, 빵, 맥주, 유제품, 곤충구제 및 효소를 포함한 많은 유용 물질을 생산하기 때문에 보다 정확한 동정 및 검출이 필요하다. 이러한 대표적인 유용 미생물로서 바실러스 서브틸리스 관련 균종을 예로 들 수 있는데, 바실러스 서브틸리스 관련 균종은 단순 유기 화합물(당, 아미노산, 유기산)을 호흡기질로 이용하여 탄수화물을 발효할 수 있으며, 이들의 최적온도는 30℃ 내지 45℃이나 일부 균종이 65℃에서도 성장하는 것으로 보고되었다. 바실러스 서브틸리스 균종은 공기 존재하에서 포도당을 대사하여 많은 양의 2,3-부탄디올(2,3-butanediol)을 생성할 수 있으나 혐기적 조건하에서는 포도당을 대사할 수 없다. 또한, 바실러스 서브틸리스 관련 균종은 산업적으로 유용한 항생제(Antibiotics)인 바시트라신(Bacitracin)을 생산하는데, 상기 항생물질은 폴리펩티드(Polypeptide) 군에 속하는 것으로 세균 세포벽인 펩티도글리칸(Peptidoglycan)의 합성을 저해함으로써 항생작용을 나타낸다. 아울러, 바실러스 서브틸리스 관련 종은 프로테아제(protease)라는 효소를 분비하여 단백질의 가수분해 반응(Hydrolysis)을 촉매함으로써 세척제 및 사진으로부터 은을 회수하기 위한 젤라틴(Gelatin) 제거제의 생산에 이용되고 있다.
전술한 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 관련 균종은 산업적으로 매우 유용한 미생물이기 때문에 더욱 정확한 동정 및 검출이 필요하다. 하지만, 탄수화물 자화능 분석법, 지방산 분석법 및 16S rRNA 유전자 분석법을 포함한 기존의 미생물 동정 및 검출방법은 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 정확한 동정에 적합하지 못하다. 우선, 탄수화물 자화능 분석법 및 지방산 분석법은 그 정확성이 매우 낮을 뿐만 아니라 최근에 발견된 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 경우 그 상업용 데이터베이스가 구축되어 있지 않아 바실러스 서브틸리스 관련 균종을 정확히 동정 및 검출할 수 없다. 또한, 16S rRNA 유전자 분석법의 경우 바실러스 서브틸리스 관련 종간의 16S rRNA 유전자염기서열의 유사도가 99% 이상으로 변이도가 매우 낮아 동정 및 검출에 사용하는 것이 불가능하다. 따라서, 바실러스 서브틸리스 관련 균종의 정확한 동정을 위해서는 16S rRNA 유전자 이외에 비교 가능한 계통학적 거리에 분포되어 있으면서 비교적 잘 보존되어 온 염기서열을 이용해야 한다. 이러한 목적으로 사용 가능한 유전자로는 양성자 전달 ATPase(Proton-traslocating ATPase), DNA 중합효소(DNA polymerase), RNA 중합효소(RNA polymerase), 히스톤-유사 단백질(Histone-like protein), 페레독신(ferredoxin) 및 DNA 자이레이즈 등이 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis), 특히 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자만을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 검출방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
Arbige MV et.al., American Society for Microbiology, p.871-895, 2003
Smith NR et.al., J Gen Microbiol., 34:269-272, 1964
Nakamura LK et.al., Int J Syst Bacteriol., 49:1211-1215, 1999
Skerman VBD et.al., Int J Syst Bacteriol., 30:225-420, 1980
Priest FG et.al., Int J Syst Bacteriol., 37:69-71, 1987
Nakamura LK, Int J Syst Bacteriol., 39:295-300, 1989
Roberts MS et.al., Int J Syst Bacteriol., 44:256-264, 1994
Roberts MS et.al., Int J Syst Bacteriol., 46:470-475, 1996
Stackebrandt E et.al., Int J Syst Bacteriol., 44:846-849, 1994
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; b) 상기 단계 a)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 c) 상기 단계 b)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 검출하는 단계;를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출용 키트를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출용 조성물 및 검출 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 특이적 프라이머 세트를 이용한 일반적인(conventional) PCR 또는 실시간(real-time) PCR 수행을 통해, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 김치와 같은 다양한 발효식품, 토양 등에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정성, 정량 분석과 밀도 변화의 모니터링 등에 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 BAB-1(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BAB-1) 균주의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자의 blastn 서치(search) 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 본 발명의 표 1에 기재된 다양한 바실러스 속 균주를 대상으로 PCR 증폭 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 여기에서, M은 사이즈 마커(size marker)이며, 전기영동 사진 상단에 표시되어 있는 번호는 본 발명의 표 1의 각 바실러스 속 균주에 해당하는 번호이다. 여기에서, 33은 주형(template)이 없는 대조군으로서 증류수를 사용한 것이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 특이성 분석을 위해 본 발명의 표 1에 기재된 다양한 바실러스 속 균주를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A)는 바실러스 속 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 주형(template) 샘플(1 내지 32)의 증폭 사이클(cycle) 수에 따른 형광 세기를 나타낸 것이고, (B)는 바실러스 속 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 주형(template) 샘플(1 내지 32)의 융해 곡선 분석 결과를 나타낸 것이고, (C)는 바실러스 속 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 주형(template) 샘플(1 내지 32)의 융해 피크 분석 결과를 상대적 형광 단위 [-d(RFU)/dT]로 나타낸 것이다. 여기에서, 33은 주형(template)이 없는 대조군으로서 증류수를 사용한 것이며 낮은 피크(low peak)를 나타내고, 높은 피크(high peak)는 증폭된 생성물을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 민감도 분석을 위해 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선(standard curve)을 나타낸 도이다. 구체적으로, (A)는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스로부터 수득한 게놈 DNA(genomic DNA)를 단계 희석하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선을 나타낸 것이고, (B)는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스로부터 수득한 증폭 산물을 벡터에 삽입, 형질전환한 균주에서 얻은 복제 DNA(cloned DNA)를 단계 희석하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선을 나타낸 것이고, (C)는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 세포 현탁액을 단계 희석하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 4℃에서 발효, 보관한 김치 시료 내에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정량 분석을 위해 상기 김치 시료로부터 수득한 총(total) DNA를 대상으로 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 Ct 값 변화 그래프, 즉, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 밀도 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 15℃ 및 25℃에서 발효, 보관한 김치 시료 내에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정량 분석을 위해 상기 김치 시료로부터 수득한 총(total) DNA를 대상으로 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 Ct 값 변화 그래프, 즉, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 밀도 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 LMG7135(Bacillus subtilis subsp. subtilis LMG 7135) 균주가 접종된 토양 시료 내에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정량 분석을 위해 상기 토양 시료로부터 수득한 총(total) DNA를 대상으로 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 Ct 값 변화 그래프, 즉, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 밀도 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 본 발명의 표 1에 기재된 다양한 바실러스 속 균주를 대상으로 PCR 증폭 반응을 수행한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 여기에서, M은 사이즈 마커(size marker)이며, 전기영동 사진 상단에 표시되어 있는 번호는 본 발명의 표 1의 각 바실러스 속 균주에 해당하는 번호이다. 여기에서, 33은 주형(template)이 없는 대조군으로서 증류수를 사용한 것이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 특이성 분석을 위해 본 발명의 표 1에 기재된 다양한 바실러스 속 균주를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A)는 바실러스 속 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 주형(template) 샘플(1 내지 32)의 증폭 사이클(cycle) 수에 따른 형광 세기를 나타낸 것이고, (B)는 바실러스 속 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 주형(template) 샘플(1 내지 32)의 융해 곡선 분석 결과를 나타낸 것이고, (C)는 바실러스 속 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 주형(template) 샘플(1 내지 32)의 융해 피크 분석 결과를 상대적 형광 단위 [-d(RFU)/dT]로 나타낸 것이다. 여기에서, 33은 주형(template)이 없는 대조군으로서 증류수를 사용한 것이며 낮은 피크(low peak)를 나타내고, 높은 피크(high peak)는 증폭된 생성물을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 민감도 분석을 위해 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선(standard curve)을 나타낸 도이다. 구체적으로, (A)는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스로부터 수득한 게놈 DNA(genomic DNA)를 단계 희석하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선을 나타낸 것이고, (B)는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스로부터 수득한 증폭 산물을 벡터에 삽입, 형질전환한 균주에서 얻은 복제 DNA(cloned DNA)를 단계 희석하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선을 나타낸 것이고, (C)는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 세포 현탁액을 단계 희석하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 4℃에서 발효, 보관한 김치 시료 내에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정량 분석을 위해 상기 김치 시료로부터 수득한 총(total) DNA를 대상으로 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 Ct 값 변화 그래프, 즉, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 밀도 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 15℃ 및 25℃에서 발효, 보관한 김치 시료 내에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정량 분석을 위해 상기 김치 시료로부터 수득한 총(total) DNA를 대상으로 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 Ct 값 변화 그래프, 즉, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 밀도 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 LMG7135(Bacillus subtilis subsp. subtilis LMG 7135) 균주가 접종된 토양 시료 내에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정량 분석을 위해 상기 토양 시료로부터 수득한 총(total) DNA를 대상으로 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 수행한 실시간 PCR 결과로부터 도출한 Ct 값 변화 그래프, 즉, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 밀도 변화를 나타낸 도이다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출용 조성물 및 검출 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출방법에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)"는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 아종으로, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 바실러스(Bacillus) 속에 속한다.
상기 용어 "아종(subsepcies)"은 종(種)을 다시 세분한 생물 분류 단위로, 한 종에 속하는 집단 중 표현형적으로 비슷한 집단들의 모임이다.
상기 바실러스 속은 그람 양성(gram-positive), 포자 형성(spore-forming) 균으로, 발효에 의해 생육 가능한 호기성(aerobic)의 간균(rodshaped) 형태 박테리아(bacteria)이며, 프로테아제(protease), 아밀라제(amylase) 및 셀룰라아제(cellulase)와 같은 산업 분야에 유용한 효소(enzyme)를 분비하고, 김치와 같은 다양한 발효식품, 토양 등에 존재한다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응효소(즉, DNA 폴리머레이즈) 및 중합반응을 위한 시약의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 크기, 융해 온도(melting temperature, Tm) 값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내의 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지 등을 충분히 고려하고, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출 시 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.
상기 프라이머 세트는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)를 특이적으로 검출하는 것으로, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스가 바실러스(Bacillus) 속 외의 다른 속 또는 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 다른 종에 속하는 균주들과 혼입되어 있는 경우에도 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)만을 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 유전자 중 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 증폭시키도록 제작된 것으로 종 특이적으로 높은 민감도로 검출이 가능하다. 본 발명에 따른 프라이머 세트로 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 유전자를 증폭 시 LysR 패밀리 전사 조절자 유전자 외의 다른 유전자는 증폭되지 않으며, 310 bp의 LysR 패밀리 전사 조절자 유전자가 뚜렷하게 검출되므로 정확하고 용이한 검출이 가능하다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머는 각각 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 310 bp 크기의 핵산 단편을 증폭시키기 위한 정방향(forword) 프라이머(BS310F) 및 역방향(reverse) 프라이머(BS310R)이다.
구체적으로, 상기 프라이머는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(GenBank accession No. NC_020832.1 gi|472328503:2503683-2504567, protein ID = WP_041517952.1)의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자(서열번호 3)에 특이적인 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자 유전자의 염기서열 위치 440번 내지 749번으로 이루어진 310 bp 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 및 blastx 프로그램을 이용하여 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 서열정보를 탐색하고, 상기 특이 핵산 서열을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머 세트를 이용하여 일반(conventional) PCR 및 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)를 비롯하여 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 10111)만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 2 및 도 3).
또한, 상기 실시간(real-time) PCR 증폭 반응 분석을 통해, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 경우 증폭 사이클(cycle)을 20회 반복하였을 때, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 10111)에 비해 형광 세기가 현저히 증가함을 확인하였고, 증폭 사이클 수에 따라 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 3의 A).
본 발명에 따른 프라이머 세트는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머 세트는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 35S, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAs에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth . Enzymol . 68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862), 및 미국특허 제4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물에는 상기 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 PCR 조성물은 목적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)이 포함될 수 있다.
상기 PCR 완충용액에는 이에 제한되지는 않으나, 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아미이드 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 추가로 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출방법을 제공한다:
a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 검출하는 단계.
본 발명에서 있어서, 상기 단계 a)의 시료는 이에 제한되지는 않으나, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스가 존재하는 김치와 같은 다양한 발효식품, 토양 등일 수 있다.
상기 단계 a)에서 시료로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자가 적절히 선택 가능하다.
상기 단계 b)의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 단계 b)의 PCR은 실시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 c)에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 b)에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인(conventional) PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 PCR 증폭은 통상적인 PCR 증폭 반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 일반적인 PCR 증폭 반응(conventional PCR) 또는 실시간 PCR 증폭 반응(real-time PCR)을 이용할 수 있고, 실시간 PCR 증폭 반응을 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다. 일반적인 PCR 증폭 반응은 특정 DNA를 증폭한 후에 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 PCR 증폭 반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 구체적인 PCR 증폭 방법은 당업자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어 "PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응)"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다. PCR 분석 방법으로써 최근 실질적으로 이용되고 있는 실시간(real-time) PCR법은 특이 프라이머와 표지물질이 연결된 프로브를 이용하여 PCR 증폭 시 프로브로부터 표지물질이 해리되어 형광 발색의 양을 측정하는 원리로, 정량적으로 도입 유전자의 양을 분석할 수 있는 장점이 있다.
상기 "프로브(probe)"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자(혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
구체적으로, 상기 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6):357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3~15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플 리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
본 발명에 따라 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지물질로 표지될 수 있으며 상기 표지물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 구체적인 PCR 조건으로는 95℃에서 5분간 열처리하여 초기 변성시킨 후, 95℃에서 1분간 변성(denaturation) 단계; 67℃에서 30초간 어닐링(annealing) 단계; 72℃에서 1분간 합성(extension) 단계를 총 35회 반복하고 72℃에서 10분간 반응시킬 수 있다. 상기 반응 온도 및 반응 시간 조건은 당업자가 적절하게 변형하여 수행할 수 있다.
상기 PCR 증폭 산물을 검출하는 방법은 이 기술 분야에 널리 알려져 있다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 증폭 산물의 크기 분석 방법으로는 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다.
더하여, 증폭 산물의 염기서열 분석 방법으로는 당업계에 공지된 염기서열 분석방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 그 서열 부분을 직접 결정하는 방법으로서 자동염기서열분석기를 사용하거나 생거법(sanger sequencing) 또는 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PCR에 의한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출의 최소 DNA 양은 게놈 DNA(genomic DNA)에서 500 내지 5,000,000 fg(femtogram)(5 ng(nanogram))일 수 있고, 복제 DNA(cloned DNA)에서 5 내지 5,000,000 fg(5 ng)일 수 있으며, 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)에서 균체 농도 OD600이 0.1 × 10-3 내지 0.1 × 100 unit일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 실시간 PCR에 의한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 500 fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 500 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출 감도가 매우 높은 것이다.
상기 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자 유전자의 DNA는 게놈 DNA(genomic DNA)와 복제 DNA(cloned DNA)를 포함한다.
상기 실시간 PCR에 의한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자 유전자 검출의 최소 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)에서의 균체 농도 OD600이 0.1 × 10-3 내지 0.1 × 100 unit인 것이 바람직하고, 최소 OD600이 0.1 × 10-3 unit이어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 검출용 키트는 실시간 PCR용 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 검출용 키트에 의한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출의 최소 DNA 양은 게놈 DNA(genomic DNA)에서 500 내지 5,000,000 fg(femtogram)(5 ng(nanogram))일 수 있고, 복제 DNA(cloned DNA)에서 5 내지 5,000,000 fg(5 ng)일 수 있으며, 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)에서 균체 농도 OD600이 0.1 × 10-3 내지 0.1 × 100 unit일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 검출용 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있으며, 상기 시약은 이 기술 분야에서 널리 공지된 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라아제, dNTPs, 및 버퍼일 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자(서열번호 3)의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 프라이머는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주를 포함하는 시료에서만 증폭 산물을 생성하여 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하며, 김치와 같은 다양한 발효식품, 토양 등에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
바실러스
서브틸리스
아종
서브틸리스
(
Bacillus
subtilis
subsp
.
subtilis
)를 포함한 다양한
바실러스
속 균주 준비 및 배양 조건
본 발명에서 사용된 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)을 포함한 기타 미생물은 벨기에의 BCCMTM(the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms)와 KACC(Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea)에서 분양받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하여 나타내었다. 하기 표 1의 바실러스(Bacillus) 속 균주들은 NA 배지로 30℃에서 각각 이틀 배양하였다.
| No. | Bacterial strain | Source | Biological origin |
| 1 | Bacillus subtilis subsp. subtilis | LMG 7135T | N.D. |
| 2 | Bacillus subtilis | KACC 10111 | N.D. |
| 3 | Bacillus subtilis | KACC 10113 | Soil |
| 4 | Bacillus subtilis | KACC 10114 | Adenine and phenylalanine-requiring mutant |
| 5 | Bacillus subtilis | KACC 11994 | Rhizosphere of Brassica napus |
| 6 | Bacillus subtilis subsp. spizizenii | LMG 19156T | N.D. |
| 7 | Bacillus amyloliquefaciens | LMG 12331 | N.D. |
| 8 | Bacillus amyloliquefaciens | KACC 10116 | Takamine bacterial amylase concentrate |
| 9 | Bacillus amyloliquefaciens | KACC 17029 | Soil |
| 10 | Bacillus amyloliquefaciens | KACC 17030 | Soil |
| 11 | Bacillus amyloliquefaciens | KACC 17031 | Soil |
| 12 | Bacillus amyloliquefaciens | KACC 17032 | Soil |
| 13 | Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens | LMG 12325 | N.D. |
| 14 | Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens | LMG 12326 | N.D. |
| 15 | Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum | LMG 26770T | N.D. |
| 16 | Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum | LMG 12384 | N.D. |
| 17 | Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum | LMG 17599 | N.D. |
| 18 | Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum | LMG 22478 | N.D. |
| 19 | Bacillus methylotrophicus | LMG 27586T | N.D. |
| 20 | Bacillus licheniformis | LMG 12363T | N.D. |
| 21 | Bacillus pumilus | LMG 18928T | N.D. |
| 22 | Bacillus sonorensis | LMG 21636T | N.D. |
| 23 | Bacillus vallismortis | LMG 18725T | N.D. |
| 24 | Bacillus atrophaeus | KACC 12090T | Soil |
| 25 | Bacillus alveayuensis | KACC 13323T | Deep sea sediment of the Ayu Trough(4000m below sea level) in the western Pacific Ocean |
| 26 | Bacillus pocheonensis | KACC 14006T | Soil, ginseng field |
| 27 | Bacillus kribbensis | KACC 14005T | Soil |
| 28 | Bacillus circulans | KACC 14392T | Soil |
| 29 | Bacillus firmus | KACC 10897T | N.D. |
| 30 | Bacillus jeotgali | KACC 17399T | Jeotgal |
| 31 | Bacillus niabensis | KACC 11279T | N.D. |
| 32 | Bacillus litoralis | KACC 12148T | Sea water |
* KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea; LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms(BCCMTM), Belgium
* T Type strain.
* N.D., Not determined.
실시예
2: 다양한
바실러스
속 균주의 총(total) DNA 추출
상기 실시예 1에서 배양하여 수득한 바실러스 속 균주의 총 DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 게놈 DNA(genomic DNA) 추출 키트(DNeasy® Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.
실시예
3:
바실러스
서브틸리스
아종
서브틸리스
특이적
프라이머
세트 제작
바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 BAB-1(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BAB-1) 균주의 유전체 정보(GenBank accession No. NC_020832.1 gi|472328503:2503683-2504567, protein ID = WP_041517952.1) 중 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자(서열번호 3)를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 프라이머 세트를 제작하였다(도 1 및 표 2).
하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)에서 310 bp 크기의 단편을 증폭하는 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 프라이머 세트를 제작하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 프라이머 방향 | 서열(5'→3') |
| 1 | BS310F | 정방향 | 5'-GGC CTA TTG AAC ACC CTG ATT TA-3' (23mer) |
| 2 | BS310R | 역방향 | 5'-CGG ATG CGG CCT TCT TTT TC-3' (20mer) |
상기 프라이머 세트는 GenBank에 등록된 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 BAB-1(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BAB-1) 균주의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인한 후 제작하였다(도 1).
실시예
4:
바실러스
속 균주에 대한
바실러스
서브틸리스
아종
서브틸리스
특이적
프라이머
세트의 특이적 검출 확인
상기 실시예 3에서 제작한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 특이적 검출 확인을 위한, PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였다. PCR 증폭 반응은 10× Hot Taq buffer, dNTP 각각 10 pM, 상기 실시예 3에서 제작한 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 프라이머 각각 20pM, IncloneTM Hot Taq DNA polymerase 1.25 unit(Inclone biotech, korea)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25㎕의 양으로 수행하였다. 이때, 상기 실시예 1의 다양한 바실러스 속 균주로부터 수득한 게놈 DNA(genomic DNA) 양은 상기 PCR 혼합액에 약 25ng이 되도록 첨가하였다. PCR 증폭 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃에서 60초, 67℃에서 30초, 72℃에서 60초로 35회(35 cycles) 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭 반응 후 10㎕의 PCR 증폭 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.
바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 32종의 다양한 바실러스 속 균주(표 1)를 대상으로 PCR 증폭 반응을 실시한 결과, 하기 도 2에 나타낸 바와 같이, 32종의 다양한 바실러스 속 균주 중 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)에 대해서만 특이적으로 310 bp 크기의 핵산 단편이 증폭된 것을 확인하였다(도 2의 Lane 1).
한편, 생물학적 기원이 결정되지 않은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KACC 10111)의 경우에도 310 bp 크기의 핵산 단편이 증폭된 것을 확인하였는데, 아종 단위까지 동정 되지 않은 기탁 균주로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KACC 10111) 기탁 균주 또한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스임을 알 수 있었다(도 2의 Lane 2).
실시예
5:
바실러스
속 균주에 대한
바실러스
서브틸리스
아종
서브틸리스
특이적 프라이머 세트의 실시간
PCR
(real-time
PCR
) 특이성 분석
상기 실시예 4에서 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 32종의 다양한 바실러스 속 균주(표 1)를 대상으로 일반적인(conventional) PCR을 수행하여, 다양한 바실러스 속 균주 중에서 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 한편, 아종 단위까지 동정 되지 않은 기탁 균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 10111) 또한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)임을 확인하였다.
이에, 보다 더 용이하고 신속 정확하게 실시간으로 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 10111)를 특이적으로 검출할 수 있는지를 확인하고자, CFX96 실시간 PCR 시스템(CFX96 Real-time PCR system; Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하여 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 실시하였다. 실시간 PCR 증폭 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 상기 실시예 3에서 제작한 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 각각 5pM을 함유하는 실시간(real-time) PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 이때, 32종의 다양한 바실러스 속 균주(표 1)로부터 수득한 게놈 DNA(genomic DNA) 양은 상기 실시간(real-time) PCR 혼합액에 약 5ng이 되도록 첨가하였다. 실시간(real-time) PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃에서 5초, 67℃에서 30초로 40회(40 cycles) 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응하였다. 이후, 융해 곡선(melting curve)과 융해 피크(melting peak)를 도출하기 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다. 이때, 융해 피크 그래프는 각 온도에서 상대적 형광 단위(Relative Fluorescence Uints; RFU)로 나타내었다. 즉, 증폭된 생성물의 유도체(derivatives)의 상대적 형광 단위 [-d(RFU)/dT]는 온도 함수로 나타내었다.
실시간 PCR 증폭 반응을 실시하여 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 10111)에 대한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 특이성을 분석한 결과, 하기 도 3에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) DNA 샘플(No.1)과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 10111) DNA 샘플(No.2)에서만 83.5℃의 특정 온도에서 융해 피크(melting peak)가 확인되었다. 한편, 주형(template)이 없는 대조군(33, 증류수) 및 상기 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KACC 10111)를 제외한 나머지 바실러스 속 균주들(No. 3-33)의 경우 융해 피크가 낮거나 없음을 확인하였다(도 3의 C).
따라서, 융해 피크(melting peak)는 상보적으로 결합한 두 가닥의 DNA가 온도가 증가함에 따라 DNA 가닥이 서로 분리되는 순간의 온도를 나타내는 것으로, 83.5℃의 특정 융해 온도에서 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis), 구체적으로 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 특이적으로 명확하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
6:
바실러스
속 균주에 대한
바실러스
서브틸리스
아종
서브틸리스
특이적
프라이머
세트의 실시간
PCR
(real-time
PCR
) 민감도 분석
상기 실시예 5에서 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 특이성 분석을 위해 다양한 바실러스 속 균주를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR 수행한 결과, 83.5℃의 특정 융해 온도에서 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis), 구체적으로 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 특이적으로 명확하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스에 대한 민감도를 분석하고자, CFX96 실시간 PCR 시스템(CFX96 Real-time PCR system; Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하여 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 실시하였다. 실시간 PCR 증폭 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 상기 실시예 3에서 제작한 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 프라이머 각각 5pM을 함유하는 실시간(real-time) PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 이때, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 LMG7135(Bacillus subtilis subsp. subtilis LMG 7135) 균주로부터 수득한 게놈 DNA(genomic DNA)와 복제 DNA(cloned DNA) 양은 상기 실시간(real-time) PCR 혼합액에 10배씩 희석하여 5ng(nanogram) 내지 5fg(femtogram)이 되도록 첨가하였다. 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension) 또한 균체 농도 OD600이 0.1 × 100 내지 0.1 × 10-3 unit이 되도록 10배씩 희석하여 상기 실시간(real-time) PCR 혼합액에 첨가하였다(표 3). 실시간(real-time) PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃에서 5초, 67℃에서 30초로 40회(40 cycles) 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응하였다. 이후, 융해 곡선(melting curve)와 융해 피크(melting peak)를 도출하기 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.
| Cloned DNA | Genomic DNA | Cell suspension | |||
| Weight/㎕ reaction mix | Ct ± SD (n = 3) |
Weight/㎕ reaction mix | Ct ± SD (n = 3) |
cell densityb | Ct ± SD (n = 3) |
| 5 ng (1.39×109copies) |
11.29 ± 0.18 | N.D. a | N.D. | N.D. | N.D. |
| 500 pg (1.39×108copies) |
14.59 ± 0.06 | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
| 50 pg (1.39×107copies) |
18.05 ± 0.12 | 5 ng | 17.86 ± 0.07 | N.D. | N.D. |
| 5 pg (1.39×106copies) |
21.41 ± 0.14 | 500 pg | 21.15 ± 0.19 | 0.1 × 100 | 20.65 ± 0.09 |
| 500 fg (1.39×105copies) |
24.81 ± 0.19 | 50 pg | 24.83 ± 0.03 | 0.1 × 10-1 | 23.30 ± 0.02 |
| 50 fg (1.39×104copies) |
28.34 ± 0.24 | 5 pg | 28.33 ± 0.48 | 0.1 × 10-2 | 26.74 ± 0.26 |
| 5 fg (1.39×103copies) |
31.60 ± 0.45 | 500 fg | 31.55 ± 0.54 | 0.1 × 10-3 | 29.93 ± 0.72 |
a N.D., Not determined.
b Optical density at 600㎚ unit of cells.
실시간 PCR 증폭 반응을 실시하여 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스에 대한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 민감도를 분석한 결과, 하기 도 4에 나타낸 바와 같이, 표준 곡선(standard curve)의 R2 값(> 0.99)과 E 값이 적정 범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출의 최소 DNA 양은 게놈 DNA(genomic DNA)에서 500 fg, 복제 DNA(cloned DNA)에서 5 fg, 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)에서 균체 농도 OD600이 0.1 × 10-3 unit임을 확인하였다(표 3).
따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스, 구체적으로 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
7: 발효 식품 시료 및 토양 시료에 대한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 실시간 PCR(real-time PCR) 분석
상기 실시예 4 내지 실시예 6을 통해 본 발명의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스, 구체적으로 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인하였다.
이에, 실질적으로 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스가 존재하는 발효 식품 시료 및 토양 시료로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 검출하고자, 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 실시하여 정량 분석하였다.
실시예 7-1: 김치 시료에 대한
바실러스
서브틸리스
아종
서브틸리스
특이적 프라이머 세트의 실시간
PCR
(real-time
PCR
) 분석
바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스가 존재하는 김치 시료로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 검출하고자, 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 실시하여 정량 분석하였다.
구체적으로, 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃ 및 25℃에서 발효, 보관하였다. 이때, 정량 분석을 위해 4℃에서 발효, 보관한 경우에는 김치 국물 30㎖씩을 일주일 간격으로 채취하였으며, 15℃ 및 25℃에서 발효, 보관한 경우에는 김치 국물 30㎖씩을 하루 간격으로 채취하였다. 한편, 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈(Daehan, Korea)를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다. 거즈로 거른 김치 국물 1㎖을 1.5㎖용 튜브(tube)에 담고 13,000rpm으로 10분간 원심분리한 후, 아래에 수집된 펠렛(pellet)을 이용하여 MPbio(OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 총(total) DNA를 추출하였다. 이후, 상기 추출한 총(total) DNA를 이용하여 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 실시하였다. 실시간(real-time) PCR 증폭 반응은 CFX96 실시간 PCR 시스템(CFX96 Real-time PCR system; Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR 증폭 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 상기 실시예 3에서 제작한 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 각각 5pM을 함유하는 SYBR-Green 실시간(real-time) PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 이때, 김치 시료로부터 수득한 총(total) DNA 양은 상기 실시간(real-time) PCR 혼합액에 약 5ng이 되도록 첨가하였다. 실시간(real-time) PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃에서 5초, 63℃에서 30초로 40회(40 cycles) 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응하였다. 이후, 융해 곡선(melting curve)과 융해 피크(melting peak)를 도출하기 위해 65℃~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다. 융해 곡선(melting curve)과 융해 피크(melting peak) 도출 결과에 따른 특이 곡선(curve) 및 피크(peak) 각각 확인하였으며, 김치 시료로부터 검출된 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 밀도 변화를 하기 도 5 및 도 6에 정리하여 나타내었다.
바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트인 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2)를 사용하여 4℃에서 발효, 보관한 포기김치와 백김치 시료로부터 각각 수득한 총(total) DNA를 대상으로 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 수행하고, 이로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 밀도 변화를 분석해 본 결과, 포기김치의 경우, Ct 값(threshold cycle)이 30.74에서 처음 검출되었으며, 그 이후부터는 Ct 값이 30.14 ~ 33.18 사이에서 밀도가 일정하게 유지됨을 확인하였다. 한편, 백김치의 경우에는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스가 전혀 검출되지 않았다(도 5).
또한, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트인 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2)를 사용하여 15℃와 25℃에서 발효, 보관한 포기김치와 백김치 시료로부터 각각 수득한 총(total) DNA를 대상으로 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 수행하고, 이로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 밀도 변화를 분석해 본 결과, 15℃에서 발효, 보관한 포기김치의 경우, Ct 값이 27.68에서 처음 검출되었으며, 그 이후부터는 Ct 값이 27.68 ~ 31.22 사이에서 밀도가 일정하게 유지됨을 확인하였다. 또한, 25℃에서 발효, 보관한 포기김치의 경우, Ct 값이 28.44에서 처음 검출되었고, 그 이후부터는 Ct 값이 28.44 ~ 31.99 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 이에 반해 15℃와 25℃에서 각각 발효, 보관한 백김치의 경우에는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스가 전혀 검출되지 않았다(도 6).
실시예
7-2: 토양 시료에 대한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트의 실시간 PCR(real-time PCR) 분석
바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스가 존재하는 토양 시료로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 검출하고자, 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 실시하여 정량 분석하였다.
구체적으로, 증류수 100㎖에 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 LMG7135(Bacillus subtilis subsp. subtilis LMG 7135) 균주의 OD600 값이 0.001이 되도록 첨가하고, 상기 균주가 포함된 증류수 100㎖을 멸균된 토양 100g과 건초를 포함한 멸균된 토양 100g에 각각 접종하여 일주일 간격으로 채취하였다. 상기 채취한 토양 시료는 MPbio(OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 총(total) DNA를 추출하였다. 이후, 상기 추출한 총(total) DNA를 이용하여 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 실시하였다. 실시간(real-time) PCR 증폭 반응은 CFX96 실시간 PCR 시스템(CFX96 Real-time PCR system; Bio-Rad laboratories, Inc., USA)을 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR 증폭 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 상기 실시예 3에서 제작한 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 각각 5pM을 함유하는 SYBR-Green 실시간(real-time) PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 이때, 토양 시료로부터 수득한 총(total) DNA 양은 상기 실시간(real-time) PCR 혼합액에 약 5ng이 되도록 첨가하였다. 실시간(real-time) PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃에서 5초, 67℃에서 30초로 40회(40 cycles) 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응하였다. 이후, 융해 곡선(melting curve)과 융해 피크(melting peak)를 도출하기 위해 65℃~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다. 융해 곡선(melting curve)과 융해 피크(melting peak) 도출 결과에 따른 특이 곡선(curve) 및 피크(peak) 각각 확인하였으며, 토양 시료로부터 검출된 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 밀도 변화를 하기 도 7에 정리하여 나타내었다.
바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 특이적 프라이머 세트인 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2)를 사용하여 각각 멸균된 토양 시료 및 건초를 포함한 멸균된 토양 시료로부터 수득한 총(total) DNA를 대상으로 실시간(real-time) PCR 증폭 반응을 수행하고, 이로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 밀도 변화를 분석해 본 결과, 멸균된 토양의 경우, Ct 값(threshold cycle)이 27.20에서 처음 검출되었으며, 그 이후부터는 Ct 값이 30.86까지 밀도가 서서히 감소됨을 확인하였다. 한편, 건초를 포함한 멸균된 토양 시료의 경우에는 Ct 값 31.28에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값이 25.04까지 증가됨을 확인하였다(도 7).
상기 일련의 결과를 통하여, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis)의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자(서열번호 3)의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 BS310F(서열번호 1)와 BS310R(서열번호 2) 프라이머는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 검출을 위한 PCR 프라이머 세트로 이용 가능하다는 것을 알 수 있었다. 이에, 김치와 같은 다양한 발효식품, 토양 등에 존재하는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.
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ggcctattga acaccctgat tta 23
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cggatgcggc cttctttttc 20
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<223> LysR family transcriptional regulator
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atgaatattc agttgttaca ggtttttctc actactgctc gtgaaggcag tatttccaag 60
gctgctcaga ctttaaatta tgcacaatcg aatgtaacga ataagataca acaactagaa 120
aacgatttac agacaaaatt attctatcgc catagtcgag gaatcacact tactccccca 180
gggcaaattc ttgtttctta ctcagagaaa attctacata cgattgaaga agctagagca 240
gccatgggcg aatcatccgc gccttctggg ccactgcgta taggatcaat ggaaacaaca 300
gctgcagttt ggcttcctca actccttgca cattataata acctctatcc aaatgttgat 360
ttgaacctag taaccggtcc tacggaacaa caaatacaag cagttttaca ttatgagtta 420
aacggcgctt ttatttcagg gcctattgaa caccctgatt tagttcaaga aaaggtattg 480
gatgaagaga tggttcttgt tacaagcgct tcacaccctg tgatttcttc cattcaggat 540
gttcaaacac aaacaatgct tgtattccgt gaaggatgct cttacagagc aaagctcaat 600
catatcctgc aagaagaagg tttattacct ataaaattaa tggaatttgg catacttgaa 660
gcgatcattg gctgtgtaag cgccggcttg gggatttcac tgctgcctcg ttcaatcatt 720
gcttcgcatg aaaaagaagg ccgcatccgc agccacacta tctctgacaa atattctttc 780
gtatcaacca tgtttataag gcggaaagac actttaatta cccctgcttt atctgctttt 840
ttaacgcata tgagggatca ttttcaggta aagaggccag attaa 885
Claims (8)
- 서열번호 3의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 특이적으로 검출하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출용 조성물.
- 삭제
- a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 특이적으로 검출하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 실시간 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물로부터 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스를 검출하는 단계;를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출방법으로서,
상기 실시간 PCR에 의한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자 유전자 검출의 최소 DNA 양은 게놈 DNA(genomic DNA)에서 500 내지 5,000,000 fg(5 ng)이고, 복제 DNA(cloned DNA)에서 5 내지 5,000,000 fg(5 ng)이며, 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)에서 균체 농도 OD600이 0.1 × 10-3 내지 0.1 × 100 unit인 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 3의 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자(LysR family transcriptional regulator) 유전자를 특이적으로 검출하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스(Bacillus subtilis subsp. subtilis) 검출을 위한 실시간 PCR용 키트로서,
상기 실시간 PCR에 의한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 LysR 패밀리 전사 조절자 유전자 검출의 최소 DNA 양은 게놈 DNA(genomic DNA)에서 500 내지 5,000,000 fg(5 ng)이고, 복제 DNA(cloned DNA)에서 5 내지 5,000,000 fg(5 ng)이며, 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)에서 균체 농도 OD600이 0.1 × 10-3 내지 0.1 × 100 unit인 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 검출을 위한 실시간 PCR용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170145878A KR101961648B1 (ko) | 2017-11-03 | 2017-11-03 | 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020170145878A KR101961648B1 (ko) | 2017-11-03 | 2017-11-03 | 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법 |
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Family
ID=65949729
Family Applications (1)
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| KR1020170145878A KR101961648B1 (ko) | 2017-11-03 | 2017-11-03 | 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스의 검출방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210033369A (ko) * | 2019-09-18 | 2021-03-26 | 대한민국(농촌진흥청장) | 바실러스 서브틸리스 근연종의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 근연종 동정 방법 |
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-
2017
- 2017-11-03 KR KR1020170145878A patent/KR101961648B1/ko active IP Right Grant
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| KR102292711B1 (ko) | 2019-09-18 | 2021-08-23 | 대한민국 | 바실러스 서브틸리스 근연종의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 바실러스 서브틸리스 근연종 동정 방법 |
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