KR102437524B1

KR102437524B1 - 바실러스 리체니포미스의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 바실러스 리체니포미스의 검출방법

Info

Publication number: KR102437524B1
Application number: KR1020200178517A
Authority: KR
Inventors: 박동석; 조희정; 진용주
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-08-31
Also published as: KR20220087960A

Abstract

본 발명은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 토양 및 김치 등의 발효식품 등에서 발견되는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치 및 토양 내 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.

Description

바실러스 리체니포미스의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 바실러스 리체니포미스의 검출방법 {Specific primer set for Bacillus licheniformis and method for detecting Bacillus licheniformis using thereof}

본 발명은 바실러스 리체니포미스의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 바실러스 리체니포미스의 검출방법에 관한 것이다.

바실러스(Bacillus) 속 균주들은 내생 포자를 가지고 있는 그람(Gram) 양성 세균으로, 많은 물질들을 세포 외부로 분비하는 것으로 보고되어 있어 각종 효소나 유용 화합물의 산업적 생산을 위한 숙주균으로 활발히 이용되고 있으며, 최근에는 iturin계 물질을 생산하여 항진균 활성을 나타내는 균주도 보고된 바 있다. 항진균 활성 균주의 식물병원성 진균에 대한 작용 기작으로는 진균 외막가수분해 효소를 이용한 용균작용, 항진균성 항생물질에 의한 항생작용(antibiosis), 그리고 siderophore에 의한 경쟁적 길항작용(competitive antagonism) 등이 알려져 있다. 이러한 항진균 활성 기작은 수많은 유전자들에 의해서 조절되어지며, 최근 항진균 기작과 관련된 물질을 합성하는 유전자들도 일부 보고되고 있다.

바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 균주는 유해 미생물에 대해 강한 항균 활성을 지니고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으며 바이오제닉 아민의 높은 분해 활성을 나타내 항균용으로 식품 등에 활용 가능하며, 우수한 단백질 분해 활성을 가져 동물 폐기물의 처리 및 비료 자원화 등에 유용하다 (대한민국 등록특허 제10-1379230호, 대한민국 공개특허 제 10-2012-0075696 호).

따라서 토양 등의 시료로부터 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 검출하고 이를 활용한 비료 또는 농약을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)는 김치와 같은 발효물에도 존재하는데, 종래에는 이 균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 그러나, 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 김치에 존재하여 발효에 중요한 역할을 하는 미생물이 시료의 준비과정이나 배양과정에서 사멸될 수 있으며, 미생물이 배양된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, ribosomal RNA (rRNA) 오페론 서열, 특히 16S rRNA 유전자를 기반으로 하는 종의 식별은 그 서열이 큰 차이가 없으므로 구별하기 어렵기 때문에 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있다.

대한민국 등록특허 10-2000463 호

본 발명의 목적은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 만을 정확하게 검출하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 특이적인 프라이머 세트 및 이의 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별 용도를 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하고자 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별용 조성물을 제공한다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 3으로 표시되는 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 판별방법을 제공한다.

상기 시료는 김치 또는 김치 국물일수 있다. 로 할 수 있다.

상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응을 포함할 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 실시간(real-time) PCR을 포함할 수 있다.

상기 증폭 산물은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정으로 검출될 수 있다.

본 발명은 토양뿐만 아니라 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치, 토양 내 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.

도 1은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 Blastn 검색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호1 및 2의 프라이머(Bali203F/Bali203R)를 사용한 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다. M은 사이즈 마커(1 kb DNA plus ladder; Gibco BRL)이고, 레인 1 내지 4는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)이며, 레인 5 내지 36은 표 1에 나열된 바와 같은 바실러스속 속하는 균주들을 포함한다. 레인 37은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 3은 표 1에 기재된 36종의 미생물을 대상으로, 종-특이적인 Bali203F/Bali203R 프라이머 세트를 이용한 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 유래의 N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE 단백질(cell surface protein)을 코딩하는 유전자의 실시간 PCR 결과이다. 도 3에서 멜팅-피크는 약 82.5℃의 융점(Tm)에서 증폭된 산물을 나타낸다. 레인 37은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 4는 표준 희석 계열에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸 것이다. 표준 곡선은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 표준 희석의 교차점으로 알려진 threshold cycles (Ct)로부터 생성된다. 모든 곡선은 R2>0.99인 것으로 입증되었다. a. 게놈 DNA, b. 클론 DNA, c. 세포 현탁액.
도 5는 4 ℃에서 발효된 염장 배추 김치에서 분리된 총 DNA에서 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
도 6는 15℃에서 발효된 염장 배추 김치에서 분리된 총 DNA에서 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명의 용어 "프라이머 세트(a pair of primers)"란 판별 대상 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트를 이루어 반응하여 PCR 산물을 합성한다. 이때, 상기 정방향과 역방향 프라이머 세트가 결정되면 이로부터 합성되는 PCR 생성물의 크기를 예측할 수 있다.

상기 프라이머들은 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 의 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE(N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE) 유전자를 (등록번호 : GenBank Accession No. 52348547, 서열번호3) 유전자에 특이적인 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함한다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 서열번호 3으로 표시되는 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 판별용 키트는 PCR 분석 또는 real-time PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 상기 각 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 판별방법을 제공한다.

상기 시료는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별용 키트를 포함한 유산균 또는 유산균을 포함한 발효식품, 유제품 등 식품으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로 김치 또는 김치 국물을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론(cloned) DNA를 포함한다.

상기 DNA는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8:297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil(Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasyⓡBlood & Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany)를 이용할 수 있다.

상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP), Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응, 또는 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 출원 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 증폭 반응으로 실시간(Real time) PCR을 수행한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술로, PCR 생산물의 증가가 타겟 주형의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다.

종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법)와 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.

상기 실시간 PCR에 의한 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE 단백질을 코딩하는 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5 ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 5 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 종만을 특이적으로 검출하며, 게놈 DNA와 클론 DNA는 각각 50 fg 및 5 fg, 세포 현탁액에서는 2.07 × 10² (CFU/㎖)에서도 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

따라서 본 발명의 따른 판별방법은 구체적으로 게놈 DNA 시료를 50 fg 이상, 클론 DNA는 5 fg 이상, 세포 현탁액은 2.07 × 10² (CFU/㎖) 이상의 농도에서 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법의 하나로서, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 젤 전기영동 또는 아가로스 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 전술한 실시예에서, 본 발명의 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 종만을 특이적으로 검출하였다(도 2, 표 1 참조). 또한, 게놈 DNA와 클론 DNA는 각각 50 fg 및 5 fg, 세포 현탁액에서는 2.07 × 10² (CFU/㎖)에서도 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

또한, 본 발명의 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)에 특이적이고 민감성이 높다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트는 실시간 PCR 방법을 통해 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 정량, 정성 분석과 김치 내에서 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 밀도 변화를 신속, 정확하게 판단할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

<실시예 1> 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)에 특이적인 프라이머 제작

(1) Bacterial strain과 배양 조건

바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 균주 및 기타 바실러스속 균주(총 36종의 균주)는 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC)에서 분양 받았다. 각 바실러스 종(Bacillus species) 균주들은 NA, R2A배지로 30℃에서 각각 이틀 배양하였다.

표 1은 PCR 특이성 검사에 사용한 바실러스속 균주의 목록 및 후술한 실험예 예 따른 프라이머 검출결과를 나타낸 것이다.

No.	균주 (Bacterial strain)	Source	Biological origin	프라이머 검출
1	Bacillus licheniformis	LMG12363^T	N.D.	+
2	Bacillus licheniformis	KCTC1659	우유(milk)	+
3	Bacillus licheniformis	KCTC1731	N.D.	+
4	Bacillus licheniformis	KCTC3047	N.D.	+
5	Bacillus paralicheniformis	KACC18426^T	청국장(Cheonggukjang)	-
6	Bacillus subtilis subsp. subtilis	LMG7135^T	N.D.	-
7	Bacillus subtilis	KACC10111	N.D.	-
8	Bacillus subtilis	KACC10113	토양(Soil)	-
9	Bacillus subtilis	KACC10114	Adenine and phenylalanine- requiring mutant	-
10	Bacillus subtilis	KACC11994	Rhizosphere of Brassicanapus	-
11	Bacillus subtilis subsp. spizizenii	LMG19156^T	N.D.	-
12	Bacillus amyloliquefaciens	LMG12331	N.D.	-
13	Bacillus amyloliquefaciens	KACC10116	Takamine bacterial amylase concentrate	-
14	Bacillus amyloliquefaciens	KACC17029	토양(Soil)	-
15	Bacillus amyloliquefaciens	KACC17030	토양(Soil)	-
16	Bacillus amyloliquefaciens	KACC17031	토양(Soil)	-
17	Bacillus amyloliquefaciens	KACC17032	토양(Soil)	-
18	Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens	LMG12325	N.D.	-
19	Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens	LMG12326	N.D.	-
20	Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum	LMG26770^T	N.D.	-
21	Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum	LMG12384	N.D.	-
22	Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum	LMG17599	N.D.	-/-
23	Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum	LMG22478	N.D.	-
24	Bacillus methylotrophicus	LMG27586^T	N.D.	-
25	Bacillus pumilus	LMG18928^T	N.D.	-
26	Bacillus sonorensis	LMG21636^T	N.D.	-
27	Bacillus vallismortis	LMG18725^T	N.D.	-
28	Bacillus atrophaeus	KACC12090^T	토양(Soil)	-
29	Bacillus alveayuensis	KACC13323^T	Deep sea sediment of the Ayu Trough (4000m below sea level) in the western Pacific Ocean	-
30	Bacillus pocheonensis	KACC14006^T	토양(Soil), 인삼밭(ginseng field)	-
31	Bacillus kribbensis	KACC14005^T	토양(Soil)	-
32	Bacillus circulans	KACC14392^T	토양(Soil)	-
33	Bacillus firmus	KACC10897^T	N.D.	-
34	Bacillus jeotgali	KACC17399^T	Jeotgal	-
35	Bacillus niabensis	KACC11279^T	N.D.	-
36	Bacillus litoralis	KACC12148^T	해수(Seawater)	-

표 1에서 ‘+’는 본 발명의 프라이머에 의해 검출, ‘-’는 비검출 되는 것을 표기한 것이다. 상기 N.D., 미정(Not determined)을 의미하고, T Type strain을 의미한다.

또한, KACC는 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection) KCTC는 한구 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures), LMG는 벨기에 미생물은행(The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms, BCCMTM)에서 분양받은 균주를 의미한다.

(2) Total DNA의 추출;

배양된 균주의 총 DNA는 Qiagen (Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트 (DNeasy® Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.

(3) 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석

바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 유전체 정보 (GenBank accession AE017333.1, gb|AE017333.1|:2255694-2256464) 중 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE(N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE) 유전자를 (등록번호 : GenBank Accession No. 52348547) blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 primer를 제작하였다.

포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE(N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE의 아미노산 서열(서열번호 3, 265aa):

MTSISNTEDR YLMLTCSKKI ESHYHIYTDE EIPQMFSSHF LQLQDDFPLT ELYSLLVRTP 60

EILKRNYVHV KSSYKRDLPF TMKKSLFDLG YILDEELFYS IRLADWKGDS PGVRAEWGTE 120

KSLIDGCRMM QAYDTLSINE AFAKEKLLRK YPFYEEGIIQ LCVCYSEEGE PIGCAELYLD 180

HDENVAKIEE VAILEPYQRK GYGSGLIKQM LTAAKQSGME SCYLVTSGSD QVKTFYEKLG 240

FQQKEKLTTI FKYLFV

(4) 특이 프라이머 제작;

바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)에서 203bp 크기의 단편을 증폭하는 Bali203F와 Bali203R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다.

Bali203 정방향 프라이머(Bali203F) :

5'-CCC GTA CAC CAG GGG AAT CT-3' (서열번호 1)

Bali203 역방향 프라이머(Bali203R) :

5'-TCC GCT GAC AGA GCT GTA CT-3' (서열번호 2)

상기 프라이머는 GenBank 등록된 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) DSM 13 = ATCC 14580 균주의 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE(N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE) 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다.

<실시예 2> PCR 증폭 반응

PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl₂ 1.5mM, 젤라틴 0.01%, dNTP 각각 0.2mM, 프라이머 각각 20pM, Taq polymerase 2 unit (Promega, Madison, Wis.)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25μl의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 genomic DNA 양은 약 25ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 63℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 10㎕의 PCR 산물을 LoadingStar로 (DYNEBIO, Republic of Korea) 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 확인하였다.

특이성 확인을 위해 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE(N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE) 유전자 특이적인 Bali203F 및 Bali203R 프라이머를 사용하였다.

<실시예 3> 실시간(Real-time) PCR 특이성 분석

실시간(Real-time) PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 Bali203F/R 프라이머 각각 5 pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. Real-time PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 genomic DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 63℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 멜팅 커브(melting curve)와 멜팅 피크(melting peak)를 위해 65℃ 부터 95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.

<실시예 4> 실시간(Real-time) PCR 민감도 분석

Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 Bali203F/R 프라이머 각각 5 pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) LMG 12363 genomic DNA와 cloned DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석하였고, 미생물 현탁액은 OD600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 Real-time PCR 혼합액에 첨가하였다.

Real-time PCR 증폭반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 63℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.

표 2는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) LMG 12363 클론 DNA, 게놈 DNA 및 세포 현탁액을 10배씩 단계적으로 희석하여 실시간 PCR 분석을 진행한 평균 Ct end-point fluorescence을 나타낸 것이다.

<실시예 5> 김치 시료를 이용한 실시간(Real-time) PCR 증폭

김치 시료부터의 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 real-time PCR을 이용하여 정량분석을 위하여 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃ 와 25℃에서 발효, 보관하였고 실험을 위해 김치 국물 30㎖ 씩 4℃의 경우 일주일간격으로, 15℃와 25℃의 경우 하루간격으로 채취하였으며 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다.

거즈로 거른 김치 국물 1㎖을 1.5㎖ 튜브에 담고 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 아래에 수집된 펠릿(pellet)을 이용하여 MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 total DNA를 추출한 후 real-time PCR을 실시하였다. Real-time PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR Premix Ex Taq (2x), 프라이머는 각각 5 pM을 함유하는 SYBR-Green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다.

반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 63℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 5초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 멜팅(melting) 커브와 멜팅(melting) 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 도 5 및 도 6과 같다.

<실험예1> 분석 균주별 PCR 증폭 반응

표 1 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)에서만 203bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인하였다.

<실험예2> 실시간(Real-time) PCR 특이성 분석 결과

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)에서만 특정 온도 (82.5℃)에서 melting peak를 확인할 수 있었다.

<실험예3> 실시간(Real-time) PCR 민감도 분석 결과

도 4의 standard curve의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며 genomic DNA는 50 fg와 cloned DNA는 5 fg, bacterial cell suspension에서는 2.07 × 102 CFU/㎖에서도 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예4> 김치 total DNA를 이용한 실시간(Real-time) PCR 증폭결과

도 5는 Bali203F 및 Bali203R의 프라이머를 사용하여, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)에 대하여 real-time PCR 기법으로 4℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다.

포기김치의 경우, Ct 값 30.22에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 30.22~33.11 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 백김치의 경우, B. licheniformis가 검출되지 않았다.

도 6은 15℃와 25℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과로, 15℃의 포기김치의 경우, Ct 값 27.53에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 32.35까지 밀도가 서서히 증가하였다. 15℃의 백김치의 경우, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)가 검출되지 않았다. 25℃의 포기김치의 경우, Ct 값 28.21에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 28.21~31.10 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 25℃의 백김치의 경우, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)가 검출되지 않았다.

결론적으로, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE(N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE)의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 Bali203F/R 프라이머는 Bacillus licheniformis를 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 김치시료 내 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific primer set for Bacillus licheniformis and method for detecting Bacillus licheniformis using thereof <130> DP20200275 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bali203 forward primer <400> 1 cccgtacacc aggggaatct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bali203 reverse primer <400> 2 tccgctgaca gagctgtact 20 <210> 3 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-acetyltransferase involved in spore outer layer maturation CgeE <400> 3 Met Thr Ser Ile Ser Asn Thr Glu Asp Arg Tyr Leu Met Leu Thr Cys 1 5 10 15 Ser Lys Lys Ile Glu Ser His Tyr His Ile Tyr Thr Asp Glu Glu Ile 20 25 30 Pro Gln Met Phe Ser Ser His Phe Leu Gln Leu Gln Asp Asp Phe Pro 35 40 45 Leu Thr Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Val Arg Thr Pro Glu Ile Leu Lys 50 55 60 Arg Asn Tyr Val His Val Lys Ser Ser Tyr Lys Arg Asp Leu Pro Phe 65 70 75 80 Thr Met Lys Lys Ser Leu Phe Asp Leu Gly Tyr Ile Leu Asp Glu Glu 85 90 95 Leu Phe Tyr Ser Ile Arg Leu Ala Asp Trp Lys Gly Asp Ser Pro Gly 100 105 110 Val Arg Ala Glu Trp Gly Thr Glu Lys Ser Leu Ile Asp Gly Cys Arg 115 120 125 Met Met Gln Ala Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Asn Glu Ala Phe Ala Lys 130 135 140 Glu Lys Leu Leu Arg Lys Tyr Pro Phe Tyr Glu Glu Gly Ile Ile Gln 145 150 155 160 Leu Cys Val Cys Tyr Ser Glu Glu Gly Glu Pro Ile Gly Cys Ala Glu 165 170 175 Leu Tyr Leu Asp His Asp Glu Asn Val Ala Lys Ile Glu Glu Val Ala 180 185 190 Ile Leu Glu Pro Tyr Gln Arg Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Leu Ile Lys 195 200 205 Gln Met Leu Thr Ala Ala Lys Gln Ser Gly Met Glu Ser Cys Tyr Leu 210 215 220 Val Thr Ser Gly Ser Asp Gln Val Lys Thr Phe Tyr Glu Lys Leu Gly 225 230 235 240 Phe Gln Gln Lys Glu Lys Leu Thr Thr Ile Phe Lys Tyr Leu Phe Val 245 250 255

Claims

서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 3으로 표시되는 포자 외층 성숙에 관여하는 N-아세틸기전이효소 CgeE 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 것인, 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 판별용 키트.
제3항에 있어서,
상기 키트는 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는, 키트.
시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 판별방법.
제5항에 있어서,
상기 시료는 김치 또는 김치 국물인 것인, 판별방법.
제5항에 있어서,
상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응을 포함하는 것인, 판별방법.
제7항에 있어서,
상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 실시간(real-time) PCR을 포함하는 것인, 판별방법.
제5항에 있어서,
상기 증폭 산물은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정으로 검출되는 것인, 판별방법.