KR101750850B1 - 바이셀라 코리엔시스의 특이적 프라이머 쌍 및 이를 이용한 바이셀라 코리엔시스의 검출방법 - Google Patents

바이셀라 코리엔시스의 특이적 프라이머 쌍 및 이를 이용한 바이셀라 코리엔시스의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 김치 유산균인 바이셀라 코리엔시스 검출용 프라이머 쌍 및 이을 포함하는 바이셀라 코리엔시스의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명인 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 김치 유산균 바이셀라 코리엔시스검출용 프라이머 쌍 및 이를 포함하는 PCR을 이용한 검출 방법은 김치 발효 중에 존재하는 바이셀라 코리엔시스의 존재 여부를 시기별로 정확하고 신속하게 확인함으로써 균주 확인에 따른 시간과 비용을 절감 시킬 수 있다. 또한, 김치 발효 동안에 바이셀라 코리엔시스 균주를 시기별로 정량 분석하여 김치의 맛과 풍미를 결정하는 바이셀라 코리엔시스의 활성 정도를 표준화시켜 김치 품질 조절을 위한 도구로 사용할 수 있다.

Description

바이셀라 코리엔시스의 특이적 프라이머 쌍 및 이를 이용한 바이셀라 코리엔시스의 검출방법 {Weissella koreensis specific primer and method for detecting Weissella koreensis using thereof}
본 발명은 김치 유산균인 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 검출용 프라이머 쌍 및 이을 포함하는 바이셀라 코리엔시스의 검출 방법에 관한 것이다.
젖산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품·김치류·양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 젖산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제(整腸劑)로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실루스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.
김치는 유산균(젖산균)에 의하여 발효되는 한국 전통 식품으로, 김치에서 분류된 젖산균(유산균)으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues) 등이 있다.
일반적으로 김치가 발효되면서 발효 초기에 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)를 포함한 류코노스톡들이 우세하게 증식하여 초기의 산 생성을 주도하여 김치 발효에 관여하며, 점차 pH가 감소함에 따라 처음에 왕성했던 류코노스톡 균주의 수도 감소하게 된다. 반면, 발효 후기에는 산에 내성적인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 등의 락토바실러스 균들이 활발하게 활동하여 락토바실러스 균의 수가 점차 증가하면서 김치가 시어지게 된다.
상기 김치 유산균 이외에 본 발명에서 검출하고자 하는 바이셀라 코리엔시스는 김치와 천일염에서 발견되었고 저온에서 숙성 및 보관되어지고 있는 김치의 발효 초기부터 존재하여 김치의 풍미에 영향을 주는 유산균으로써 2003년 식품의약품안전처로부터 식용 사용을 인정받은 균주이다.
바이셀라 코리엔시스는 항비만 효능이 있는 아미노산 물질인 오르니틴을 생성한다는 사실이 국내 연구진에 의해 밝혀진 바 있다.(J Appl Microbiol . 2012 Dec;113(6):1507-16) 또한, 항염증, 항진균, 항암효과가 우수한 것으로 알려져 있으며, 특히 김치의 맛, 효능을 좋게 하는 효과가 있다.
다만, 종래 김치 유산균을 분석하기 위해 김치와 같은 발효물 내에 존재하는 유산균을 유산균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 그러나, 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 김치에 존재하여 발효에 중요한 역할을 하는 미생물이 시료의 준비과정이나 배양과정에서 사멸될 수 있으며, 미생물이 배양이 된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 바이셀라 코리엔시스종 만을 정확하게 검출하기 위해서 상기 단점을 극복할 수 있는 바이셀라 코리엔시스 특이적 프라이머 쌍 및 이를 포함하는 검출방법을 개발하였다.
1. Cho, K. M., Math, R. K., Islam, S. Md. A., Lim, W. J., Hong, S. Y., Kim, J. M., Yun, M. G., Cho, J. J., and Yun, H. D. (2009). Novel multiplex PCR for the detection of lactic acid bacteria during kimchi fermentation. Molecular and Cellular Probes. 23: 9094 2. Lee, M. J., Cho, K. H., Han E. S., and Lee, J. H. (2011). Development and Application of PCR-Based Weissella Species Detection Method with recN Gene Targeted Species-Specific Primers. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 39(1): 7076
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자(membrane protein gene) 검출용 프라이머 쌍을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머들은 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자(등록번호 : GenBank Accession No. WP_013989464.1, gi|339633914:707395-707961; 서열번호 3)에 특이적인 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명의 상기 프라이머 쌍은 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 249번 내지 449번으로 이루어진 201bp 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “막 단백질”은 세포나 세포소기관의 막에 결합된 단백질을 말하며, 막 당단백질, 내재성 막 단백질, 막관통 단백질, 표재성 막 단백질, 지질 고정 단백질 등이 있다. 본 명세서에서 “막 단백질 유전자”라 함은 상기 막 단백질을 코딩하는 유전자를 말한다.
또한, 본 발명은
1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계;
를 포함하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 시료는 바이셀라 코리엔시스를 포함한 유산균 또는 유산균을 포함한 발효식품, 유제품 등 식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 김치 또는 김치 국물이 더욱 바람직 하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 1) 단계에서 DNA의 추출은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법 (Tai et al. Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil (Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasy® Blood & Tissue Kit(Qiagen (Hilden, Germany))를 이용할 수 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.
상기 단계 2)의 PCR은 실시간(real-time) PCR, qRT-PCR 또는 RT-PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17,18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제 09/854,317호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉,dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레
오타이드도 포함할 수 있다.
실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플 리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나
기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이
많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
상기 실시간 PCR에 의한 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 5 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.
상기 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론 (cloned) DNA를 포함한다.
상기 실시간 PCR에 의한 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 검출의 최소 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)양은 1.28 × 104 내지 1.28 × 10 (CFU/ml)인 것이 바람직하고, 최소 1.28 × 104(CFU/ml)만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 바이셀라 코리엔시스 검출용 조성물을 포함하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 키트를 제공한다.
서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
상기 키트는 실시간 PCR용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것이나, 이에 한정하지 않는다.
상기 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론 DNA를 포함한다.
상기 실시간 PCR에 의한 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 검출의 최소 세균 세포 현탁액양은 1.28 × 104 내지 1.28 × 10 (CFU/ml)인 것이나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자에 특이적인 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 바이셀라 코리엔시스 종만을 검출하였으며(도 2 및 도 3 참조), 게놈 DNA와 클론 DNA는 5 fg, 세균 세포 현탁액에서는 1.28 × 104 (CFU/ml)에서도 바이셀라 코리엔시스를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
본 발명의 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 조성물은 바이셀라 코리엔시스에 특이적이고 민감성이 높다. 따라서 본 발명의 프라이머 쌍 은 실시간 PCR 방법을 통해 바이셀라 코리엔시스의 정량과 김치 내에서 바이셀라 코리엔시스의 밀도 변화를 신속, 정확하게 판단 할 수 있다.
본 발명인 김치 유산균 바이셀라 코리엔시스 검출용 프라이머 쌍 및 이를 포함하는 검출방법은 종래 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 유산균의 검출 방법이 갖고 있는 단점을 극복하여 신속하고 정확하게 바이셀라 코리엔시스 균주만을 특이적으로 검출할 수 있다. 그리고 본 발명의 프라이머 쌍은 적은 DNA양으로도 바이셀라 코리엔시스를 시기별로 정량분석 할 수 있고 김치 내 바이셀라 코리엔시스의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.
도 1은 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자를(등록번호 : GenBank Accession No. WP_013989464.1, gi|339633914 : 707395-707961 ; 서열번호 3) blastn 서치 결과이다.
도 2는 제작한 프라이머 쌍으로 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자, recN 유전자(비특허문헌 2), 부분 말토오즈 포스포릴레이즈 유전자(partial maltose phosphorylase gene)(비특허문헌 1)을 각각 PCR 증폭한 결과이다. (A)는 막 단백질 유전자, (B)는 recN 유전자(비특허문헌 2), (C)는 부분 말토오즈 포스포릴레이즈 유전자(비특허문헌 1)이다. 1-8 레인은 바이셀라 코리엔시스 균주이고, 9-31레인은 표 1의 리스트에 있는 바이셀라 코리엔시스를 제외한 균주이고, 32레인은 증류수(음성 대조군)이다.
도 3은 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자의 실시간 PCR 결과이다.
도 4는 프라이머 쌍의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자에 대한 실시간 PCR 민감도 결과이다. (A) 게놈 DNA, (B) 클론 DNA, (C) 세균 세포 현탁액이다
도 5는 4°C에서 발효 중인 두 종류 김치의 전체 DNA에서 바이셀라 코리엔시스의 정량분석을 위한 실시간 PCR의 Ct 값의 변화이다.
도 6은 15°C 와 25°C에서 발효 중인 두 종류 김치의 전체 DNA에서 바이셀라 코리엔시스의 정량분석을 위한 실시간 PCR의 Ct 값의 변화이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예>
실시예 1. 본 발명에 사용된 바이셀라 코리엔시스를 포함한 균주들의 준비
본 발명에서 사용된 바이셀라 코리엔시스를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 BCCMTM(Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms)와 KACC(Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 하기 표 1에 정리하였다. 표 1의 균주들은 MRS배지(OXOID CM0361)로 25℃, 30℃에서 각각 이틀 배양하였다.
본 발명에 사용된 미생물 균주 및 출처
No. Bacterial strain Source Biological origin
1 Weisseella koreensis T KACC 11853T Kimchi
2 Weisseella koreensis KACC 17102 Cabbage Kimchi
3 Weisseella koreensis KACC 17103 Cabbage Kimchi
4 Weisseella koreensis KACC 17104 Radish Kimchi
5 Weisseella koreensis KACC 17870 Kimchi
6 Weisseella koreensis KACC 17872 Kimchi
7 Weisseella koreensis KACC 17873 Kimchi
8 Weisseella koreensis KACC 17874 Kimchi
9 Weissella kandleri LMG 18979T Desert spring
10 Weissella viridescens KACC 11850T Cured meat products
11 Weissella minor KACC 13437T Slime from milking machine
12 Weissella soli KACC 11848T Garden soil
13 Weissella halotolerans KACC 11843T Sausage
14 Weissella cibaria KACC 11862T Chili bo
15 Weissella confusa KACC 11841T Saccharum officinarum
16 Weissella hellenica KACC 11842T Naturally fermented Greek sausage
17 Weissella thailandensis KACC 11849T Fermented fish
18 Weissella paramesenteroides KACC 11847T
19 Lactobacillus brevis KACC 11433T Human, faeces
20 Lactobacillus curvatus KACC 12415T Milk
21 Lactobacillus kimchii KACC 12383T Kimchi
22 Lactobacillus paraplantarum KACC 12373T Beer
23 Lactobacillus pentosus LMG 10755T
24 Lactobacillus plantarum LMG 6907T Pickled cabbage
25 Lactobacillus sakei KACC 12414T Starter of sake (Moto)
26 Leuconostoc carnosum KACC 12255T Vacuum-packed beef stored at low temperature
27 Leuconostoc citreum KACC 11860T Honeydew of rye ear
28 Leuconostoc gelidum KACC 12256T Vacuum-packed meat
29 Leuconostoc inhae KACC 12281T Kimchi
30 Leuconostoc lactis KACC 12305T Milk
31 Leuconostoc mesenteroides KACC 12312T Fermenting olives
KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea;
LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM),Belgium
a +, detected; -, not detected. T Type strain.
실시예 2. 배양된 균주들의 총(total) DNA 추출
배양된 균주의 총 DNA는 Qiagen (Hilden, Germany)사의 게놈 DNA 추출 키트 (DNeasy® Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.
실시예 3. 바이셀라 코리엔시스 특이적 프라이머 쌍 제작
바이셀라 코리엔시스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 쌍의 제작을 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자(등록번호 : GenBank Accession No. WP_013989464.1, gi|339633914 : 707395-707961 ; 서열번호 3)를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 프라이머 쌍을 제작하였다.
바이셀라 코리엔시스에서 201bp 크기의 단편을 증폭하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 제작하였다. 프라이머 쌍의 서열은 다음과 같다.
Figure 112015087150023-pat00001
WK06F 프라이머 : 5'-AAG GTC GCC ATT TAT TTT TG-3' (서열번호 1)
Figure 112015087150023-pat00002
WK06R 프라이머 : 5'-CGT TTA TTC CGA TCT TTA TGG-3' (서열번호 2)
상기 프라이머 쌍은 GenBank등록된 바이셀라 코리엔시스 KACC 15510 균주의 막 단백질 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다(도 1).
실시예 4. 프라이머 쌍의 바이셀라 코리엔시스의 특이적 검출 확인
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, 젤라틴 0.01%, dNTP 각각 0.2mM, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 20pM, Taq 중합효소( Taq polymerase) 2unit (Promega, Madison, Wis.)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25μ의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 게놈 DNA 양은 약 25ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 61℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 5μ의 PCR 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.
특이성 확인을 위해 막 단백질 유전자로 제작된 WK06F (5'-AAG GTC GCC ATT TAT TTT TG-3') (서열번호 1)와 WK06R (5'-CGT TTA TTC CGA TCT TTA TGG-3') (서열번호 2) 프라이머와 이전 연구에서 보고된 RecN 유전자에서 제작된 WeikorF (5‘-GTG CTG GTC TGC GTA AAA TA-3’) (서열번호 4)와 recNR (5‘-CWC CTG TAT CAA CTT CAT CAA A-3’) (서열번호 5) 프라이머(비특허문헌 2); 그리고 부분 말토오즈 포스포릴레이즈 유전자에서 제작된 WkoF (5’-GCC GAA TTA AGT AGT GTA AAG TCA AAT G-3’)(서열번호 6)와 WkoR (5’-TCT GCC GAA GCT TGA CCG G-3’) 프라이머(서열번호 7) (비특허문헌 1)를 비교하기 위해 사용되었다(도 2).
그 결과, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍은 1-8번 레인에 해당하는 바이셀라 코리엔시스에서만 201bp 크기의 핵산 단편을 특이적으로 증폭함을 확인 할 수 있었다. 그리고 이전 연구(비특허문헌 2)에서 보고된 RecN 유전자에 특이적인 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍은 1-8번 레인에 해당하는 바이셀라 코리엔시스의 812bp 크기의 단편을 특이적으로 증폭함을 확인 할 수 있으나, 그 증폭 효율은 본 발명의 프라이머 쌍의 결과와 비교하여 현저히 낮은 수준이었다. 또한 비특허문헌 1의 말토오즈 포스포릴레이즈 유전자에 특이적인 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머 쌍의 PCR 결과는 1-8레인에 해당하는 바이셀라 코리엔시스에서는 단편이 증폭되지 않았고, 9-31 레인에 해당하는 표 1에 제시된 바이셀라 코리엔시스 외 다른 균주들에서 단편이 증폭되었는 바, 바이셀라 코리엔시스 검출용 프라이머로 적합하지 않음을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 5. 프라이머 쌍의 실시간 PCR 특이성 분석
실시간 PCR 증폭 반응은 CFX96 실시간 PCR 시스템 (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 5pM을 함유하는 실시간 PCR 혼합액으로 총 20μ의 양으로 수행하였다. 실시간 PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 게놈 DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 61℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 멜팅 커브(melting curve)와 멜팅 피크(melting peak)를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다(도 3).
그 결과, 바이셀라 코리엔시스에서만 특정 온도(77℃)에서 멜팅 피크를 확인할 수 있었다. 멜팅 피크는 상보적으로 결합한 두 가닥의 DNA가 온도가 증가함에 따라 DNA 가닥이 서로 분리되는 순간의 온도를 나타내는 것으로 77℃에서 하나의 피크만이 게 맞춘 후 10배씩 희석하여 실시간 PCR 혼합액에 첨가하였다. 실시간 PCR 증폭반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 61℃ 30초로 40회 반복시킨 후 9나타났으므로 해당 막 단백질 유전자에 특이적으로 결합하였음을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 6. 프라이머 쌍의 실시간 PCR 민감도 분석
실시간 PCR 증폭 반응은 CFX96 실시간 PCR 시스템 (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 5pM을 함유하는 실시간 PCR 혼합액으로 총 20μ의 양으로 수행하였다. 바이셀라 코리엔시스 KACC 11853 게놈 DNA와 클론 DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석하였고, 미생물 현탁액은 O.D 600에서 0.1이 되5℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 멜팅 커브와 멜팅 피크를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.
최소 검출 DNA 양
Cloned DNA Genomic DNA Cell suspension
Weight/μreaction mix Ct ± SD (n = 3) Weight/μreaction mix Ct ± SD (n = 3) CFU/ml reaction mix Ct ± SD (n = 3)
5 ng (1.42 × 109copies) 12.59 ± 0.06 5 ng 14.57 ± 0.10 N.D. a N.D.
500 pg (1.42 × 108copies) 16.23 ± 0.13 500 pg 17.82 ± 0.05 1.28 × 109 18.23 ± 0.13
50 pg (1.42 × 107copies) 18.18 ± 0.02 50 pg 21.30 ± 0.16 1.28 × 108 21.21 ± 0.12
5 pg (1.42 × 106copies) 21.19 ± 0.03 5 pg 24.52 ± 0.18 1.28 × 107 24.81 ± 0.24
500 fg (1.42 × 105copies) 24.42 ± 0.06 500 fg 27.97 ± 0.11 1.28 × 106 28.14 ± 0.30
50 fg (1.42 × 104copies) 28.08 ± 0.08 50 fg 31.26 ± 0.29 1.28 × 105 32.15 ± 0.56
5 fg (1.42 × 103copies) 31.26 ± 0.23 5 fg 34.22 ± 0.68 1.28 × 104 34.90 ± 0.43
a N.D., Not determined.
그 결과, 스탠다드 커브(standard curve)의 R2값과 E값이 적정범위에 있고 슬로프(slope) 값이 -3.32에 근접한 값을 가지므로 증폭효율이 높고 신뢰할 수 있는 데이터로 판명할 수 있었으며(도 4), 게놈 DNA와 클론 DNA는 5 fg, 세균 세포 현탁액에서는 1.28 × 104 (CFU/ml) 에서도 바이셀라 코리엔시스을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2).
실시예 7. 김치 시료를 이용한 실시간 PCR 증폭
김치 시료로부터 바이셀라 코리엔시스의 실시간 PCR을 이용한 정량분석을 위하여 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃ 와 25℃에서 발효, 보관하였고 실험을 위해 김치 국물 30ml 씩 4℃의 경우 일주일간격으로, 15℃와 25℃의 경우 하루간격으로 채취하였으며 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈 (Daehan, Korea)를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다. 거즈로 거른 김치 국물 1ml을 1.5ml 튜브에 담고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 아래에 수집된 펠렛(pellet)을 이용하여 MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 총 DNA를 추출한 후 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 증폭반응은 CFX96 실시간 PCR 시스템 (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR Premix Ex Taq (2x), 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머는 각각 5pM을 함유하는 SYBR-Green PCR 혼합액으로 총 20μ의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 김치 시료의 총 DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 61℃ 30초로 45회 반복시킨 후 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 멜팅 커브와 멜팅 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 정리하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머을 사용하여, 바이셀라 코리엔시스에 대하여 실시간 PCR 기법으로 4℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다. 포기김치의 경우, Ct 값은 28.80에서 처음 검출되었고 3주차에 Ct 값은 15.31로 밀도가 약 10,000배 정도 급격히 증가하였다. 3주차 이후부터는 Ct 값은 14.53~15.24 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 백김치의 경우, Ct 값은 35.80에서 처음 검출되었고 2주차에 Ct 값은 22.47로 밀도가 약 10,000배 정도 급격히 증가하였다. 2주차 이후부터는 Ct 값은 22.74에서 26.69까지 밀도가 약 10배 정도 감소하였다(도 5).
또한, 15℃와 25℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과로, 15℃의 포기김치의 경우, Ct 값은 18.71에서 처음 검출되었고 1주차에 Ct 값은 15.44로 밀도가 약 10배 정도 급격히 증가하였다. 1주차 이후부터는 Ct 값은 13.89~14.32 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 15℃의 백김치의 경우, Ct 값은 21.27에서 처음 검출되었고 1주차에 Ct 값은 18.36으로 밀도가 약 10배 정도 급격히 증가하였다. 1주차 이후부터는 Ct 값은 17.84에서 21.09까지 밀도가 약 10배 정도 감소하였다. 25℃의 포기김치의 경우, Ct 값은 19.32에서 처음 검출되었고 1주차에 Ct 값은 14.05로 밀도가 약 100배 정도 급격히 증가하였다. 1주차 이후부터는 Ct 값은 13.52~15.24 사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 25℃의 백김치의 경우, Ct 값은 21.58에서 처음 검출되었고 1주차에 Ct 값은 18.61으로 밀도가 약 10배 정도 급격히 증가하였다. 1주차 이후부터는 Ct 값은 18.46에서 21.38까지 밀도가 약 10배 정도 감소하였다(도 6).
따라서 본 발명의 바이셀라 코리엔시스 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여, 김치 내 시기별 바이셀라 코리엔시스의 정량분석과 바이셀라 코리엔시스 밀도 변화의 모니터링이 가능하다는 것이 확인되었다.
<110> Republic of Korea <120> Weissella koreensis specific primer and method for detecting Weissella koreensis using thereof <130> P15R12D0606 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WK06F primer <400> 1 aaggtcgcca tttatttttg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WK06R primer <400> 2 cgtttattcc gatctttatg g 21 <210> 3 <211> 567 <212> DNA <213> Weissella koreensis membrane protein gene <400> 3 ttaaatcaga ttaattaatc gcctaacaaa gggcagaatc aacaaactta aactaattaa 60 aataactccc tctaatagat taaatggaac cactgccaac aacagataat taaaaatacc 120 aaagacctga ccaatattaa aattagcaaa ttgcgcataa agcggaatcg cataaaaata 180 gttcatcaag accatcataa ctgttaatgc aacagaacca agtacgattg acatgccttt 240 ttgaatccaa ggtcgccatt tatttttggt caagcaataa tacaaaactg tcattaaaat 300 catgaatccc aaaatattca ttggtaaacc aatataatca tttaccccag cattattaag 360 taataatttt aacaatgacc gaatcagtaa aattaggtac ccacttttca aatcaagtaa 420 catcattccc ataaagatcg gaataaacga tagatcaatt tttaaaaaag gcattgttgg 480 aattaatggc accgaaataa aaaccattaa aatcaccgat aaagccgaaa aaagggcaat 540 aagacttaat tttctagtct gcatcat 567 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WeikorF primer <400> 4 gtgctggtct gcgtaaaata 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recNR primer <400> 5 cwcctgtatc aacttcatca aa 22 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WkoF primer <400> 6 gccgaattaa gtagtgtaaa gtcaaatg 28 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WkoR primer <400> 7 tctgccgaag cttgaccgg 19

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 및 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머로 이루어진, 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)의 막 단백질 유전자(membrane protein gene) 검출용 프라이머 쌍.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 상기 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 249번 내지 449번으로 이루어진 201bp 핵산 단편 검출용 프라이머 쌍.
  3. 제 1항의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 조성물.
  4. 1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계;
    를 포함하는, 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자를 검출하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 시료는 김치 또는 김치 국물인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자를 검출하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 PCR은 실시간(real-time) PCR인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자를 검출하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 실시간 PCR에 의한 막 단백질 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양이 5fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자를 검출하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 실시간 PCR에 의한 막 단백질 유전자의 검출을 위한 최소 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)양이 1.28 × 104 내지 1.28 × 10 (CFU/ml)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자를 검출하는 방법.
  9. 제 1항의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 키트.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 키트는 실시간 PCR 용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 막 단백질 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양이 5fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 키트.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 키트는 실시간 PCR 용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 막 단백질 유전자의 검출을 위한 최소 세균 세포 현탁액 양이 1.28 × 104 내지 1.28 × 10 (CFU/ml)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 바이셀라 코리엔시스의 막 단백질 유전자 검출용 키트.
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