KR101501361B1 - 웨이셀라 비리데스켄스 동정용 마커 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 동정용 마커 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스 검출용 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스 검출용 조성물 및 검출 키트, 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스 검출 방법 및 서열번호 4로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스 동정용 분자 마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은, 웨이셀라 비리데스켄스를 Weissella 속을 포함하는 기타 미생물들과 구분 가능하게하여, 웨이셀라 비리데스켄스만을 검출하는데 효과적이다.

Description

웨이셀라 비리데스켄스 동정용 마커 조성물{Marker composition for identification of Weissella viridescens}
본 발명은 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 동정용 마커 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스 검출용 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스 검출용 조성물 및 검출 키트, 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스 검출 방법 및 서열번호 4로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스 동정용 분자 마커 조성물에 관한 것이다.
Weissella 속 균들은 유산균에 포함되는 그램 양성 무포자 형성균이다. 그 대표적 형태는 단간균(short rod)으로 길이는 1.5-2.0 μm 폭은 0.8-1.0 μm 정도이다. 발효에 의해 에너지를 얻으며 포도당과 같은 당을 기질로 생육하면 이상유산발효(heterolactic fermentation)를 수행해서 유산과 함께 이산화탄소를 생성하며 균주에 따라 초산 혹은 알코올을 생성한다. Weissella 속은 1993년 Collins 등이 Leuconostoc 속의 다른 종들과 차이를 보이는 Leuconostoc paramesenteroides와 Lactobacillus 속 5종을 모아서 6종으로 새로운 속을 제안함으로써 만들어졌다. 그 후 새로운 종들이 추가되어 현재 14종이 미국 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등재되어 있다. 2010년에 2종이 새롭게 보고되었고 앞으로도 새로운 종들의 발견이 예상되어 그 수는 계속 증가할 것이다. Weissella 속 균들은 김치와 같은 발효 소채류, 발효식품, 사람과 동물의 소화관, 소시지 등 다양한 자연환경에서 검출된다. W. soli는 토양에서 검출되었으며, 특별한 병원성은 보고되지 않았다. 김치에서는 2002년 W. koreensis 가 분리, 보고되었고 W. kimchii도 보고되었으나 W. kimchii는 나중 W. cibaria와 동일한 것으로 판명되었다. W. hanii 역시 김치 분리균으로 NCBI에 등재 되어있지만 논문으로 보고되지 않아 신종으로 공식적인 인정은 되지 않고 있다(이강욱 et al., 2010). 이처럼 Weissella 속 균들은 김치를 포함한 다양한 발효식품들에서 검출된다.
웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens)는 바이셀라 비리데스켄스로도 불리우며, 1993년 Collins 등이 새롭게 Weissella 속을 제안하기 전에는 락토바실러스 비리데스켄스(Lactobacillus viridescens)로 명명되기도 하였다.
대한민국공개특허 10-1258692를 통하여 Weissella viridescens가 항생제 저항성 포도상구균(MRSA)에 대해 억제 능력을 가짐이 알려진바 있다. 이처럼 Weissella viridescens의 유용성이 알려진바, 김치와 같은 발효 소채류, 발효식품 , 사람과 동물의 소화관 및 분변 등에서 소량으로 존재하는 Weissella viridescens만을 특이적으로 검출하는 기술이 필요로되고 있다.
Collins, M. D., J. Samelis, J. Metaxopoulos, and S. Wallbanks.1993. Taxonomic studies on some leuconostoc-like organisms from fermented sausages: description of a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species. J. Appl. Bacteriol. 75: 595-603. 이강욱, 박지영, 천지연, 한남수, 김정환. 2010. 김치발효에서 Weissella 속의 중요성과 앞으로의 연구 과제.Kor. J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 38, No. 4, 341-348.
이에 본 발명의 발명자들은 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens)만을 정확히 동정하는 방법을 연구하던 중, 웨이셀라 비리데스켄스 gyrase b subunit 유전자 서열에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 발명하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 4로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens)동정용 분자 마커 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 서열번호 4로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens)동정용 분자 마커 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어 ‘프라이머’란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명은 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 프라이머 쌍을 제공하며, 바람직하게는 본 발명의 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2 의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 프라이머 쌍은 바람직하게 PCR 프라이머쌍을 의미하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 상기 본 발명의 프라이머 쌍은 웨이셀라 비리데스켄스의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환) 될 수 있다.
상기 본 발명의 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(intersimple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 프라이머쌍은 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens)를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이와 같은 효과는 본 발명의 명세서 일실시예에 잘 나타나있다.
본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 결과 웨이셀라 비리데스켄스와 다른 균종을 특이적으로 구별할 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 조성물에는 상기 프라이머 쌍을 이용하여 웨이셀라 비리데스켄스를 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등)및 결과 확인에 필요한 여러가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 PCR 조성물은 목적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다.
상기 PCR 완충용액에는 이에 제한되지는 않으나, 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드 (dimethylsufoxide (DMSO)), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아미이드 및 소 혈청 알부민 (bovine serum albumine (BSA))이 추가로 포함될 수있다.
또한 본 발명은 서열번호 1및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 키트를 제공한다.
키트에는 상기 PCR 프라이머쌍 이외에 PCR반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함 될 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하여 웨이셀라 비리데스켄스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 웨이셀라 비리데스켄스를 검출할수 있는 방법으로는, PCR(Polymerase Chain Reaction) 분석, DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR-RFLP(restriction fragment length polymerphism) 분석, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(intersimple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization) 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization) 및 웨스턴 하이브리다이제이션(Western hybridization) 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 PCR일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응한 결과 웨이셀라 비리데스켄스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
보다 구체적으로, 본 발명은
(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기 영동으로 확인하는 단계를 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 동정 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
(b) 단계에서 에서는 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 웨이셀라 비리데스켄스의 gyrB 유전자를 증폭해낼 수 있다. 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열의 양 끝단에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 방법이다. 본 단계는 ⅰ) 변성(denaturation) 단계, ⅱ) 프라이머의 대상 핵산결합(annealing) 단계 및 ⅲ) 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 "사이클"은 표적 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 프라이머의 대상 핵산결합단계 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않으나, 바람직하게는 95℃에서 10분간 변성하고, 95℃ 30초, 61℃ 1분, 72℃ 2분으로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하여 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 미생물에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게영향을 주며, 바람직하게는 1.5 ~ 2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 + 가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens)동정용 분자 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 웨이셀라 비리데스켄스 동정용 분자 마커 조성물은 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 " 분자 마커" 는 바람직하게는 " DNA 마커"를 의미한다. 상기 " DNA 마커" 는 전기영동 겔 상에 나타나는 DNA 절편상의 다형성에 근거한 것으로서, DNA 절편상의 다형성을 검출하는 방식에 따라, 염기서열간의 상보성(complementarity)을 이용하는 "hybridization-based marker" 와 PCR(polymerase chain reaction; 연쇄중합반응) 기법에 의하는 " PCR-based marker" 를 포함한다 (Kumar, L. S., 1999, DNA markers in plant improvement: An overview, Biotechnology Adv. 17: 143-182. 이 중 pp. 144-146 참조).
상기 Hybridization-based marker는, 제한효소 절편(restriction fragments)에 특이적으로 상보적 결합(hybridize)하는 핵산서열 탐침자(probe)를 사용하여 검출되는 제한효소 절편의 크기 상의 다형성에 기초한 마커로서, RFLP(restriction fragment length polymorphism) 마커와 VNTR(variable number tandem repeats) 를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한편, " PCR-based marker" 는, 임의의(random) 또는 특이적(specific) 프라이머로부터 연쇄중합반응에 의해 증폭(" PCR 증폭" )되는 DNA 절편(" 증폭 DNA" )을 전기영동 겔 상에 전개하고, 여기서 검출되는 증폭 DNA 절편(amplified DNA fragments)의 길이의 다형성을 마커로 활용하는 방식이다. " PCR-based marker" 는 이에 한정되지 않으나 RAPD(random amplified polymorphic DNA) 마커, AFLP(amplified fragment length polymorphism) 마커 및 STS(sequence tagged site) 마커를 포함한다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은, 웨이셀라 비리데스켄스를 Weissella 속을 포함하는 기타 미생물들과 구분 가능하게 하여, 웨이셀라 비리데스켄스만을 검출하는데 효과적이다.
도1은 [표 1]에 기재된 균종들과 웨이셀라 비리데스켄스의 gyrB 유전자 서열을 비교한 것이다(401~700 bp, 도2에 계속).
도2는 [표 1]에 기재된 균종들과 웨이셀라 비리데스켄스의 gyrB 유전자 서열을 비교한 것이다(701~1000 bp, 도3에 계속).
도3은 [표 1]에 기재된 균종들과 웨이셀라 비리데스켄스의 gyrB 유전자 서열을 비교한 것이다(1001~1300 bp, 도4에 계속).
도4는 [표 1]에 기재된 균종들과 웨이셀라 비리데스켄스의 gyrB 유전자 서열을 비교한 것이다 (1301~1600 bp).
도5는 웨이셀라 비리데스켄스 gyrB 유전자 서열상의, 본 발명의 프라이머 쌍 위치를 나타낸다.
도6은 본 발명의 프라이머를 이용하여 Lactobacillus spp. 에 대한 in silico PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
도7은 본 발명의 프라이머를 이용하여 Leuconostoc spp. 에 대한 in silico PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
도8은 본 발명의 프라이머를 이용하여 웨이셀라 비리데스켄스와 다른 미생물들을 대상으로 실제 PCR을 수행한 결과이다.
도 9는 Weissella viridescens, Weissella viridescens ATCC 12706, Weissella viridescens KC-J7 및 Weissella viridescens KC-J13의 gyrB partial sequence를 비교하여 나타낸 것이다 (도 10에 계속).
도 10은 Weissella viridescens, Weissella viridescens ATCC 12706, Weissella viridescens KC-J7 및 Weissella viridescens KC-J13의 gyrB partial sequence를 비교하여 나타낸 것이다 .
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
웨이셀라 비리데스켄스( Weissella viridescens )검출용 프라이머 쌍의 설계
<실시예 1-1> 특이적 염기서열의 정보 탐색
NCBI의 진뱅크(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)를 이용하여 등록되어 있는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 의 gyrB 유전자 서열을 확인하였다(서열번호 3, GenBank: DQ335695.1). 그 후 기타 다른 미생물의 gyrB 유전자 서열과 웨이셀라 비리데스켄스의 gyrB 유전자 서열을 비교하였다. [도 1] 내지 [도 4] 는 [표 1]에 기재된 미생물의 gyrB 유전자 서열과 웨이셀라 비리데스켄스의 gyrB 유전자 서열을 비교한 결과를 나타낸다. [표 1]에 기재된 미생물들의 gyrB 유전자 서열이외에도, 기타 다른 속의 미생물들도 gyrB 유전자 서열을 비교해보았지만 확연히 달라 data를 표시하지 않았다.
No. 비교 서열
1 Weissella confusa strain DSMZ20196 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335692.1
2 Weissella hellenica strain DSMZ7378 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335693.1
3 Weissella paramesenteroides strain DSMZ20288 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335691.1
4 Weissella halotolerans strain CECT573 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335694.1
5 Weissella kandleri strain CECT4307 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335696.1
6 Weissella koreensis KACC 15510, complete genome GenBank: CP002899.1
7 Leuconostoc citreum strain CECT4018 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335683.1
8 Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811 complete genome, type strain LMG 18811T GenBank: FN822744.1
9 Leuconostoc fallax strain DSMZ20189 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335687.1
10 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293, complete genome GenBank: CP000414.1
11 Leuconostoc gelidum strain DSMZ5578 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335685.1
12 Lactobacillus crispatus DNA gyrase B subunit (gyrB) gene, partial cds GenBank: AY943085.1
13 Leuconostoc pseudoficulneum strain LC51 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds GenBank: DQ335690.1
14 Rhodococcus erythropolis gyrB gene for DNA gyrase subunit B, partial cds, clone:gy10188.icb GenBank: AB018757.1
15 Lactobacillus plantarum JDM1, complete genome GenBank: CP001617.1
< 실시예 1-2> 웨이셀라 비리데스켄스에 특이적인 프라이머 ( primer ) 제작
웨이셀라 비리데스켄스 gyrB 유전자 서열을 이용하여 웨이셀라 비리데스켄스에 특이적인 프라이머 쌍을 디자인하고 제작하였다[표 2]. 설계한 프라이머의 위치는 [도 5]와 같다.
제작된 프라이머 쌍
균종 서열번호 프라이머 Target band size(bp)
Weissella viridescens 1 Forward primer (21mer)
5’-GATAGTATCCATGAAGTGAGC-3’

710
2 Backward primer (21mer)
5’-TTACGAGCTTTATTCGCCAAC-3’
< 실시예 2>
제작된 primer 를 이용하여 in silico PCR 수행
http://insilico.ehu.es/PCR/ 을 이용하여 in silico PCR을 수행하였다. Weissella viridescens의 경우 아직 GenBank상에 full sequence가 등록되지 않아 in silico PCR을 수행할 수 없었다. Weissella viridescens를 제외한 기타 다른 미생물 속에 대하여, 본 발명의 프라이머를 가지고 in silico PCR을 수행 하였을 때 target band가 나타나는지를 확인하였다.
먼저 Lactobacillus spp. 에 대하여 in silico PCR을 수행하였고, 구체적인 Lactobacillus spp.는 [표 3]와 같다.
Line 균 종
1 Lactobacillus acidophilus 30SC
2 Lactobacillus acidophilus La-14
3 Lactobacillus acidophilus NCFM
4 Lactobacillus amylovorus GRL 1112
5 Lactobacillus amylovorus GRL1118
6 Lactobacillus brevis ATCC 367
7 Lactobacillus brevis KB290
8 Lactobacillus buchneri CD034
9 Lactobacillus buchneri NRRL B-30929
10 Lactobacillus casei ATCC 334
11 Lactobacillus casei BD-II
12 Lactobacillus casei BL23
13 Lactobacillus casei LC2W
14 Lactobacillus casei W56
15 Lactobacillus casei str. Zhang
16 Lactobacillus crispatus ST1
17 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 2038
18 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842
19 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA-365
20 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ND02
21 Lactobacillus fermentum CECT 5716
22 Lactobacillus fermentum F-6
23 Lactobacillus fermentum IFO 3956
24 Lactobacillus gasseri ATCC 33323
25 Lactobacillus helveticus DPC 4571
26 Lactobacillus helveticus H10
27 Lactobacillus helveticus R0052
28 Lactobacillus johnsonii DPC 6026
29 Lactobacillus johnsonii FI9785
30 Lactobacillus johnsonii NCC 533
31 Lactobacillus kefiranofaciens ZW3
32 Lactobacillus plantarum JDM1
33 Lactobacillus plantarum WCFS1
34 Lactobacillus plantarum ZJ316
35 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum P-8
36 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III
37 Lactobacillus reuteri DSM 20016
38 Lactobacillus reuteri F275 Kitasato
39 Lactobacillus reuteri SD2112
40 Lactobacillus rhamnosus ATCC 8530
41 Lactobacillus rhamnosus GG
42 Lactobacillus rhamnosus GG
43 Lactobacillus rhamnosus Lc 705
44 Lactobacillus ruminis ATCC 27782
45 Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K
46 Lactobacillus salivarius CECT 5713
47 Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118
48 Lactobacillus sanfranciscensis TMW 1.1304
[도 6]에서 보는 바와 같이, Lactobacillus spp. 에 대하여 in silico PCR을 수행하였을 때 target band가 나타나지 않았다.
또한, Leuconostoc spp. 에 대하여 in silico PCR을 수행하였고, 구체적인 Leuconostoc spp.은 [표 4]와 같다.
Line 균 종
1 Leuconostoc carnosum JB16
2 Leuconostoc citreum KM20
3 Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811
4 Leuconostoc gelidum JB7
5 Leuconostoc kimchii IMSNU11154
6 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293
7 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides J18
8 Leuconostoc sp. C2
[도 7]에서 보는 바와 같이, Leuconostoc spp. 에 대하여 in silico PCR을 수행하였을 때 target band 가 나타나지 않았다.
대표적인 젖산균 속인 Leuconostoc 속 과 Lactobacillus 속 외에 기타 다른 속들도 in silico PCR 수행하였지만 band가 나타나지 않았다. (data 미도시)
< 실시예 3>
Weissella viridescens 와 다른 미생물들을 이용하여 실제 PCR 수행
< 실시예 3-1> 시료의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 프라이머를 이용하여 웨이셀라 비리데스켄스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응에 사용될 시료를 준비하였다. 실험에 사용된 미생물은 [표 5]와 같다.
No. 실험에 사용된 균 종
1 Weissella viridescens ATCC 12706
2 Weissella viridescens KC-J7 (isolate)
3 Weissella viridescens KC-J13 (isolate)
4 Leuconostoc carnosum ATCC 49367
5 Leuconostoc mesenteroides ATCC 10830
6 Leuconostoc lactis ATCC 19256
7 Lactobacillus sakei subsp.sakeiATCC 15521
8 Lactobacillus plantarum KCTC 3103
9 Lactobacillus brevis ATCC 8287
본 발명에서 사용된 웨이셀라 비리데스켄스를 포함한 기타 미생물들 중 표준균주는 미생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture)로 부터 분양받았다. 또한 분리균주(isolate)는 본 실험실에서 김치로 부터 분리한 분리균주를 이용하였다. 본 실험에 이용된 균주들은 de Man Rogosa Sharpe (MRS) broth (Difco, Becton Dickinson Co., Sparks, MD, USA) 에서 배양되었다. 상기 미생물의 게놈 DNA는 DNA 추출 키트인 Qiagen DNeasy Mini Kit (Valencia,CA,USA)를 이용하여 추출하였다.
상기 미생물의 중합효소 연쇄반응을 위한 조성물을 제조하였다. PCR reaction mixture는 [표 6]과 같이 조성되었다,
Reagents Concentration Volume (㎕)
10x Taq buffer 10x 5
dNTP mix each 10mM 1
Taq polymerase 5U/㎕ 0.25
Forward primer - 1
Reverse primer - 1
Template DNA - 2
D.W. 49.75
Total - 50
< 실시예 3-2> 중합효소 연쇄반응의 수행
상기 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍의 웨이셀라 비리데스켄스에 대한 특이성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1의 프라이머쌍 및 상기 실시예 3-1의 미생물 시료 및 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 보다 구체적으로 상기 PCR 반응은 95℃에서 10분간 변성하고, 95℃ 30초, 61℃ 1분, 72℃ 2분으로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하여 수행되었다[표 7].
PCR 조건
Steps Temperatures (℃) Times Cycles
1 95 10 min
2 95 30sec
35
3 61 1min
4 72 2min
5 72 10 min
또한 상기 PCR 산물을 확인하기 위하여 상기 PCR 종료 후 반응액 (PCR product) 10㎕을 1.5％ (w/v) 아가로스 겔 상에 로딩하여 90V 전압으로 전기영동 하였다. 전기 영동한 아가로스 겔을 EtBr로 염색한 후, UV 광선투사기(trans-illuminator)로 조사하여 PCR 산물의 밴드 유무와 그 크기를 확인하였다. [표 8]은 전기영동에 로딩된 PCR산물을 나타낸다.
Line 균 종
M 100 bp DNA molecular weight marker
1 Weissella viridescens ATCC 12706
2 Weissella viridescens KC-J7 (isolate)
3 Weissella viridescens KC-J13 (isolate)
4 Leuconostoc carnosum ATCC 49367
5 Leuconostoc mesenteroides ATCC 10830
6 Leuconostoc lactis ATCC 19256
7 Lactobacillus sakei subsp.sakeiATCC 15521
8 Lactobacillus plantarum KCTC 3103
9 Lactobacillus brevis ATCC 8287
[도 8] 에서 보는 바와 같이, 웨이셀라 비리데스켄스에 대해서만 밴드가 나타났고, 나머지 미생물에서는 밴드가 나타나지 않았다. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 본 발명의 프라이머 쌍은 웨이셀라 비리데스켄스 유전자만을 특이적으로 증폭하여, 웨이셀라 비리데스켄스만을 동정한다는 것을 보여준다.
< 실시예 3-3> Weissella viridescens PCR product sequencing
실시예 3-2에서 밴드가 나타난 웨이셀라 비리데스켄스 ATCC 12706, 웨이셀라 비리데스켄스 KC-J7 (isolate), 웨이셀라 비리데스켄스 KC-J13 (isolate)에 대하여, PCR product를 sequencing 업체 (Solgent Co., Daejeon, South Korea)에 의뢰하여 sequencing 하였다. Sequencing하여 얻은 염기서열을 [도 9] 내지 [도 10]에서 보는 바와 같이 서로 비교하였다. 그 결과 서열번호 4로 표시되는 서열이 공통적으로 나타나는 것을 보았으며, 이로써 서열번호 4로 표시되는 서열은 Weissella viridescens만을 특이적으로 동정할 수 있음을 보여준다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 동정용 마커 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스 검출용 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스 검출용 조성물 및 검출 키트, 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스 검출 방법 및 서열번호 4로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스 동정용 분자 마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은, 웨이셀라 비리데스켄스를 Weissella 속을 포함하는 기타 미생물들과 구분 가능하게하여, 웨이셀라 비리데스켄스만을 검출하는데 효과적이므로 산업상 이용 가능성이 높다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Marker composition for identification of Weissella viridescens <130> NP13-0050 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gryB gene of weissella viridescens <400> 1 gatagtatcc atgaagtgag c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer for gryB gene of weissella viridescens <400> 2 ttacgagctt tattcgccaa c 21 <210> 3 <211> 1183 <212> DNA <213> Weissella viridescens strain DSMZ20410 DNA gyrase subunit B (gyrB) gene, partial cds <400> 3 cggtggtggt tataaagttt ctgggggact tcacggtgtt ggagcctcag ttgttaatgc 60 attatcaact gaattagatg tgattgtcgt tcgtgatgat aaagcctacg atatggactt 120 tgaacgcggg catgtgaagg atagtatcca tgaagtgagc cctgaaggac ttgctgtttc 180 acgtggaaca attgttcatt tcacgccaga tcctgatatt ttccaagaaa caacggaatt 240 tgatatcaag actttgacaa accgtgtccg tgaattggct ttcttgaata agggattgcg 300 aatttcaatt acagataatc gtccagcaga acccgttaca gaatcattcc actatgaagg 360 tggaatcaaa gagtatgttg aataccttga tgttaataaa gatgttttgt ttgaagatcc 420 agtttatgtt gaaggaactg aaaatggcat tgctgttgaa gtgtctttgc agtatacgga 480 tgatttccat tcaaacatga tgtcatttgc taacaaaatt cacacttatg aaggtggaac 540 ccatgagacg ggattcaagt cagctttgac acgtgttatc aatgactatg cacgtaagaa 600 cagcatctta aaggatgggg atgaatctct ttctggtgaa gatgtgcgtg aaggtttgac 660 agcgattgta tcagttaagc acccagatcc acagtttgaa ggtcaaacaa agactaaact 720 tggaaattct gatgcacgaa ctgctgttga tcgcatgttt tcagaaacat tctcacgatt 780 tatgttggaa aacccagcaa cggcgcgtga gattgttgaa aagggaatgt tggcgaataa 840 agctcgtaaa gctgcaaagc gtgcacgtga agcgacacgt aagaagagcg ggcttgaaat 900 ttctaatttg ccaggtaagt tggcggataa tacgtctaaa gaccctgaaa tttttgaact 960 atttattgtt gagggagact cagccggtgg ttcagctaaa caaggtcgtg aacgtttgac 1020 acaagctatt ttgccaattc gtggaaaaat tttgaacgtt gaaaaggcaa gcattgataa 1080 gattttgggt aacgaagaaa ttcggtcact ctttacggct atgggaactg gttttggtga 1140 tgaatttgat gttaccaagg ctaagtatca caagttgatt atc 1183 <210> 4 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Marker sequence for Weissella viridescens <400> 4 cgccagatcc tgatattttc caagaaacaa cggaatttga tatcaagact ttgacaaacc 60 gtgtccgtga attggctttc ttgaataagg gattgcgaat ttcaattaca gataatcgtc 120 cagcagaacc cgttacagaa tcattccact atgaaggtgg aatcaaagag tatgttgaat 180 accttgatgt taataaagat gttttgtttg aagatccagt ttatgttgaa ggaactgaaa 240 atggcattgc tgttgaagtg tctttgcagt atacggatga tttccattca aacatgatgt 300 catttgctaa caatattcac acttatgaag gtggaaccca tgagacggga ttcaagtcag 360 ctttgacacg tgttatcaat gactatgcac gtaagaacag catcttaaag gatggggatg 420 aatctctttc tggtgaagat gtgcgtgaag gtttgacagc gattgtatca gttaagcacc 480 cagatccaca gtttgaaggt caaacaaaga ctaaacttgg aaattctgat gcacgaactg 540 ctgttgatcg catgttttca gaaacattct cacgatttat gttggaaaac ccagcaacgg 600 cgcgtgagat tgttgaaaag ggaatgttgg cgaata 636

Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 프라이머 쌍.
  2. 제1항의 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 조성물.
  3. 제1항의 프라이머 쌍을 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 검출용 키트.
  4. (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기 영동으로 확인하는 단계를 포함하는 웨이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens) 동정 방법.
  5. 삭제
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