FI102298B - Menetelmä maitohappobakteerilajien määrittämiseksi ja menetelmään sove ltuvia oligonukleotideja - Google Patents

Description

! 102298

Menetelmä maitohappobakteerilajien määrittämiseksi ja menetelmään soveltuvia oligonukleotideja

Keksinnön kohteena on menetelmä meijerihapate- tai 5 probioottikäytössä merkittävien maitohappobakteerilajien määrittämiseksi geeniteknisesti sekä menetelmään soveltuvia lajispesifisiä oligonukleotideja ja niiden käyttö menetelmässä. Menetelmä mahdollistaa mainittujen maitohappobakteerilajien nopean osoittamisen.

10 Elintarviketeollisuus on eräs merkittävimmistä bio tekniikkaa hyödyntävistä teollisuuden aloista. Maitohappo-bakteerit ovat hiivojen ohella eniten käytettyjä teolli-suusmikrobeja elintarvikkeiden jalostuksessa. Suomen maataloustuotannossa maidolla on keskeinen asema. Siksi myös 15 maitoa jalostavalla meijeriteollisuudella on merkittävä asema elintarviketeollisuudessa. Suomessa merkittävimmät hapanmaitovalmisteet ja juustot tuotetaan hapatteilla, joiden maitohappobakteerit kuuluvat lajeina Streptococcus- . Lactococcus- tai Lactobacillus-ryhmään. Viime vuosi-20 na on tullut vahvasti markkinoille myös ns. probioottival-misteita, joissa erityisesti Lactobacillus-ryhmän maitohappobakteerit ovat toiminnallisesti keskeisessä asemassa.

• ·:* Tällä hetkellä maitohappobakteerit tunnistetaan ja 4 * I · niiden määrä näytteessä selvitetään mikrobiologisin, bio-25 kemiallisin ja fysiologisin menetelmin. Koska maitohappo-bakteerisolujen jakaantumisnopeus on varsin alhainen, mer- V". kitsee se väistämättä em. perinteisin menetelmin suoritet- • · * *”.* tavan lajimäärityksen hitautta: Tyypillisesti maitohappo- • · · ’·* ’ bakteerien lajimääritys näytteestä kestää vähintään kaksi 30 vuorokautta. Tämä on maitohappokäymisprosessien seurannan • · tarpeita ajatellen aivan liian pitkä aika. Koska monet ··· _ : teolliset maitohappokäymisprosessit, esimerkiksi jogurtin valmistaminen, perustuvat useamman maitohappobakteerilajin €···_ samanaikaiseen käyttöön, edellyttää tällaisten prosessien 35 laadukas ohjaus mahdollisimman reaaliaikaista tietoa mai- 2 102298 tohappobakteerien solumäärästä ja lajijakautumasta. Nykyisin käytössä olevilla menetelmillä ei näihin tavoitteisiin päästä niin, että sama menetelmä antaisi tarvittavan pro-sessinohjaustiedon sekä riittävän nopeasti että riittävän 5 spesifisesti, vaan on käytettävä rinnakkain useita menetelmiä, joiden yhteistuloksena saadaan tarvittava perustieto.

Nopea ja suhteellisen vaivaton mikrobien tunnistaminen näytteestä on mahdollista näytteen sisältämän mikro-10 biperäisen nukleiinihappomateriaalin sekvenssianalyysin perusteella. Tavallisesti analysoitavana nukleiinihappona on DNA, sillä erityisesti prokaryoottinen RNA biologisen epästabiilisuutensa vuoksi on teknisesti hankalampi analysoitavaksi. Käytetyimpiä teknologisia vaihtoehtoja ovat 15 spesifisten oligonukleotidien käyttö joko koettimena (ns.

koetinteknologia) tai alukkeena DNA-synteesissä (ns. PCR-teknologia). Molemmissa vaihtoehdoissa menetelmä perustuu geneettisen informaation (DNA:n nukleotidisekvenssin) identtisyyden tai vähintäinkin riittävän samanlaisuuden 20 osoittamiseen tutkittavan näytteen sisältämän DNA:n ja käytetyn oligonukleotidin (koetinteknologiavaihtoehto) tai oligonukleotidiparin (PCR-teknologiavaihtoehto) kesken. Geneettisen samanlaisuuden biokemiallisena ilmentymänä molemmissa vaihtoehdoissa tapahtuu spesifinen hybridisoi-...j 25 tuminen oligonukleotidin ja kohde-DNA:n komplementaarisen .:. juosteen kanssa.

Erityisen hyödyllisiksi lajispesifisten oligonuk- • · V./ leotidikoetinten tai -alukeparien löytämiselle ovat osoit- • · * tautuneet bakteerien ribosomaalisen RNA:n operonin (rrn) 30 5S, 16S ja 23S rRNA-geenit ja niiden välialueet, ns. spa- • · ·1·’ cer-alueet. Koska rrn-operonin geenit toiminnallisesta ··· · universaalisuudesta johtuen sisältävät konservatiivisia « ;’·1: alueita, voidaan rrn-operonialueita monistaa PCR-teknolo- gisesti ns. universaalialukkeilla myös niiden bakteerila-35 jien tapauksessa, missä tarkasteltavan bakteerilajin var- * · · « 3 102298 sinaista rrn-operonin tai sen osien sekvenssiä ei ole aikaisemmin identifioitu (Barry ym., Biotechnology 8(1991) 233; Barry ym., PCR Methods and Applications 1(1991)51). Konservatiivisten operonialueiden välillä nukleotidisek-5 venssin muuntelun aste bakteerilajien välillä vaihtelee huomattavasti ja siksi bakteerilajien keskinäinen fyloge-neettinen asema ilmenee nukleotidisekvenssien homologia-asteenä rrn-operonien muuntelevilla alueilla (Ludwig ja Schleifer, FEMS Microbiol. Rev. 15(1994)155).

10 Eräille teollisesti hyödynnetyille maitohappobak- teerilajeille kuin myös eräille haitallisille maitohappo-bakteerilajeille on viime aikoina kehitetty lajispesifisiä rrn-operonialueen. tavallisesti 16S rRNA tai 23S rRNA-gee-nin, tunnistavia oligonukleotidiakoettimia tai -alukkeita. 15 Näillä on voitu osoittaa eräitä liha- ja makkarateollisuu-dessa ja probioottivalmisteissa hyödynnettäviä Lactobacil-lus-lajeja (Hensiek ym., System. Appi. Microbiol. 15(1992) 123; Ehrmann ym., FEMS Microbiol. Lett. 117(1994)143¾ sekä meijeriteollisuudessa hyödynnettäviä Lactococcus-. Strep-20 tococcus- ja Leuconostoc-laieia (Ehrmann ym., System. Appi. Microbiol. JL5(1992)453). Suomessa meijeriteollisuudessa tuotetaan maito- tai probioottivalmisteita, joissa on käytetty Lactobacillus delbrueckii-. Lactobacillus ca-sei-, Lactobaci1lus helveticus-. Lactobacillus acidophilus ....: 25 ja Streptococcus thermophilus-laieia edustavia hapatekan- toja. Näiden maitohappobakteerilajien yhtäaikaiseen ja no-peaan määrittämiseen soveltuvia 16S ja 23S rRNA geenien i · « '**.* välialueen lajispesifisesti tunnistavia oligonukleotideja • · · '·* * ei ole aikaisemmin kuvattu.

30 Kyseisen keksinnön päämäärä on tarjota DNA-teknolo- • · · '.·.· giaan perustuva menetelmä, jolla voidaan nopeasti ja yhtä- • · · ; aikaisesti määrittää Suomessa meijerihapate- ja probioot- tikäytössä merkittävät maitohappobakteerilajit. Nykyisin käytössäolevilla mikrobiologisilla puhdasviljelymenetel-35 millä ja sitäseuraavilla biokemiallisilla puhdasviljelmän I ·

« < I

4 102298 mikrobimateriaalin lajinmääritysmenetelmillä tarkasteltavien maitohappobakteerilajien lajimääritys kestää vähintään 48 tuntia. Kyseinen keksintö tarjoaa mahdollisuuden suorittaa po. lajimääritys yli kymmenen kertaa lyhyemmässä 5 ajassa, millä on suuri etu etenkin maito- ja probiootti-valmisteiden tuotantoprosessien seurannan ja laadunvalvonnan kannalta.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle meijerihapate-tai probioottikäytössä merkittävän maitohappobakteerilaj in 10 määrittämiseksi geeniteknisesti on tunnusomaista, että osoitetaan maitohappobakteerilajille tunnusomainen nuk-leiinihapposekvenssi (kohdesekvenssi) bakteerin 16S- ja 23S-tyyppistä ribosomaalista RNA:ta (rRNA) tuottavien geenien väliseltä alueelta. Menetelmä perustuu määritettävän 15 bakteerilajin DNA:lie tunnusomaisen sekvenssin osoittami seen spesifisellä oligonukleotidilla tai oligonukleotidi-parilla.

Keksinnön mukaiselle oligonukleotidille on tunnusomaista, että se hybridisoituu spesifisesti nukleiinihap-20 posekvenssiin, joka on tunnusomainen meijerihapate- tai probioottikäytössä merkittävälle maitohappobakteerilaj ille joukosta Lactobacillus delbrueckii. Lactobacillus aci- dophilus. Lactobacillus helveticus tai Streptococcus ther- : ·’; mophilus ja joka on bakteerin 16S- ja 23S-tyyppistä ri- 25 bosomaalista RNA:ta (rRNA) tuottavien geenien väliseltä alueelta. Edullisesti käytettävät oligonukleotidit ovat . · johdettavissa SEKV. NRO:ista 1 - 9 ja edullisimmin ne ovat

lit J J

• · t SEKV. NRO:t 10 - 19 tai niiden homologeja.

• · · '* "On johdettavissa" merkitsee sitä, että oligonuk- 30 leotidille joko löytyy vastine mainitusta sekvenssistä tai sen komplementaarisesta juosteesta tai että se on riittä- • · · V · vän samanlainen jomman kumman kanssa hybridisoitumaan spe- sifisesti kohdesekvenssiin lajispesifisessä määrityksessä.

: Näin ollen SEKV. NRO: t 11 - 19 ovat SEKV. NRO: iden 2-9 35 tai niiden komplementaaristen juosteiden fragmentteja, kun sen sijaan SEKV. NRO: 10 sisältää SEKV. NRO:n 1 fragmentin '•"S lisäksi 16S rRNA:n geenin viimeisen nukleotidin.

5 102298

Mainittujen oligonukleotidien "homologilla" ymmärretään oligonukleotidia, jossa muutama nukleotidi voi olla lisätty, poistettu tai korvattu toisella, mutta joka on riittävän samanlainen, mainittujen oligonukleotidien kans-5 sa hybridisoitumaan spesifisesti kohdesekvenssiin lajispesifisessä määrityksessä.

Keksinnön edulliset suoritusmuodot on esitetty epäitsenäisissä patenttivaatimuksissa.

Kyseinen keksintö koskee menetelmää, jossa käyte-10 tään lajispesifisiä oligonukleotideja tutkittavan näytteen sisältämän meijerihapate- tai probioottikäytössä merkittävän maitohappobakteerilajin tai -lajien DNA:n tunnistamiseksi lajispesifisellä tasolla. Menetelmä soveltuu meijerihapate- ja probioottikäytössä merkittäville Lactobacil-15 lus ja Streptococcus thermophilus -bakteereille. Eräs kaikista bakteerilajeista löytyvä ja muunteluasteeltaan potentiaaliseksi lajispesifiseksi nukleiinihapposekvenssiksi soveltuva alue on mahdollista löytää 16S ja 23S rRNA-gee-nien välialueelta eli ns. spacer-alueelta (Barry ym., PCR 20 Methods and Applications JL(1991)51). Lajispesifisten oli-gonukleotidisekvenssien löytäminen edellyttää kohdegeeni-alueen nukleotidisekvenssin määrittämistä - mikäli sek-venssitietoa ei ole muutoin käytettävissä - tarkoituksenmukaisen laajasta bakteerilaji- ja -kantamateriaalista ...: 25 sekä nukleotidisekvenssien vertailua kohdegeenialueen osalta bakteerilajille ominaisten nukleotidisekvenssien toteamiseksi.

« · · • · ·

Lajispesifisellä nukleotidisekvenssillä tunnistet- « · · tava vastinsekvenssi näytteessä voi edustaa joko DNA-sek-30 venssiä tai RNA-sekvenssiä näytteen valmistusmenetelmästä - * · riippuen. RNA:n biologisesta epästabiilisuudesta ja pro- • · · V * sessoinnista johtuen DNA kohdenukleiinihappona on menetel- .··.·. mällisesti helpompi hallita, mikäli määrityksen herkkyys- ... vaatimukset tulevat muutoin täytetyksi. Joissakin sovel- 35 luksissa, jotka edellyttävät menetelmältä suurta herkkyyt- 6 102298 tä tai näytteen biologisen aktiivisuuden vaatimusta, voi RNA: n valinta kohdenukleiinihapoksi olla parempi vaihtoehto tai jopa ainoa mahdollisuus.

Oligonukleotidin ja kohdesekvenssin välinen komple-5 mentaarisuus on menetelmän spesifisyyden perusta, ja siksi olosuhteet hybridisaatiolle ja sitä seuraaville suorituksille tulee olla vakioidut ja menetelmän sekä spesifisyys-että sensitiivisyyskriteerit huomioivia, optimaalisesti tiukat. Määritykseen tulee sisällyttää sisäiset kontrollit 10 negatiivisten ja positiivisten referenssinäytteiden muodossa. Koetinteknologisessa menetelmävaihtoehdossa riittää yksi oligonukleotidi koettimena hybridisaation osoittamiseen. PCR-teknologisessa vaihtoehdossa tarvitaan alukkeina kaksi oligonukleotidia, jotka tunnistavat monistettavan 15 DNA-segmentin komplementaariset juosteet ja ulottavat ohjaamansa DNA-synteesin toistensa ohi. Käytännössä oligonukleotidin pituus on yleensä noin 15 - 25 nukleotidia ja PCR:ssä monistettavan DNA-segmentin pituus on optimaalisesti noin 0,2 - 2 ke.

20 Lajispesifinen tunnistamisvaatimus edellyttää, että oligonukleotidikoetin on lajispesifinen ja ainakin toinen alukkeista on lajispesifinen toisen alukkeen voidessa olla joko lajispesifinen tai tätä spesifisyysvaatimusta väljempi. Esimerkissä 3 esitetään ne lajispesifiset oligonukleo- i ,...i 25 tidisekvenssit, joilla voidaan PCR-teknologisesti osoittaa • · vastaava maitohappobakteerilaji näytteestä niin, että mo- ‘.**1 lemmat alukkeet ovat luonteeltaan lajispesifisiä oligonuk- • · · leotideja. Oligonukleotidisekvenssiparit on kuvattu seu- • · · raaville maitohappobakteeri lajeille: Streptococcus thermo -30 philus. Lactobacillus delbrueckii. Lactobacillus (paralca- • · :.:.Σ sei, Lactobaci 1 lus helveticus ja Lactobaci 1 lus acidophi- : : : lus. Kullekin lajille spesifiset oligonukleotidisekvenssit perustuvat em. bakteeri lajien 16S ja 23S rRNA-geenien vä-’ . lialueiden nukleotidisekvenssien määrityksiin sekä saatu- 35 jen sekvenssien analyysiin.

’ 102298

Esimerkissä 3 on myös esitetty yhteenveto keksinnön kuvaamilla lajispesifisillä oligonukleotideilla saaduista PCR-tuloksista erityyppisillä bakteerilajimateriaaleilla. Tulokset osoittavat, että kuvatuilla oligonukleotidialuke-5 pareilla voidaan tunnistaa Suomessa meijerihapate- ja pro-bioottikäytössä merkittävät maitohappobakteerilajit Str. thermophilus. Lb. delbrueckii. Lb. casei. Lb. helveticus ja Lb. acidophilus lajispesifisesti ja yhtäaikaisesti tutkittavasta näytteestä.

10 Kyseinen keksintö tarjoaa seuraavat edut: Menetelmä mahdollistaa ylivertaisen nopeuden vaihtoehtoisiin menetelmiin määrittää lueteltuja maitohappobakteerilajeja näytteestä. Menetelmä mahdollistaa useampien lueteltujen maitohappobakteerilajien määrityksen suoraan ja yhtäaikai-15 sesti samasta näytteestä. Lisäksi menetelmällä on laaja sovellusala niin tutkimuksessa kuin teollisissa prosesseissa ja niiden laadunvalvonnassa ja edelleen menetelmä on suorituksenisesti turvallinen, riittävän yksinkertainen ja toteutettavissa tavanomaisella ajanmukaisela labo-20 ratoriolaitteistolla sekä taloudellisesti kilpailukykyinen.

Esimerkki 1

Bakteeri-DNA:n eristäminen :*j‘: Bakteerikannasta tehtiin yliyön kasvusto sopivassa ....: 25 kasvuliemessä. Solut kerättiin sentrifugoimalla (14.000 g/ 5 min) 4 °C:ssa ja pestiin kahdesti 10 mM Tris-HCl-pusku-

rilla, pH 7,0. Pestyt bakteerisolut suspensoitiin 10 mM

‘I*.* Tris-HCl-puskuriin (pH 7,0), joka sisälsi 12 % (w/v) PEG

• ♦ ♦ 6000 ja 10 mg/ml lysotsyymientsyymiä (Sigma Chemical Co, 30 St. Louis, U.S.A.), ja suspensiota inkuboitiin 30 min 37 ' · · *.·.* °C:ssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla (10.000 g/15 min) ···

V ; 4 °C:ssa, solupellettiin lisättiin lyysiliuosta (10 mM

EDTA-20 mM Tris-HCl-puskuri, pH 7,0, joka 3 % (w/v) SDS:n .···. suhteen), ja solususpensiota inkuboitiin 30 min 20 °C:ssa.

'·' 35 Hajonneitten solujen näyte uutettiin kahdesti fenoli-klo- i • ·

• · I

« 4 · * I ( · I 4 « • 102298 roformi-isoamyylialkoholi-(25:24:1)-seoksella, minkä jälkeen bakteeri-DNA saostettiin vesifaasista, joka tehtiin 200 mM:ksi NaCl:n suhteen, 50 % (v/v) isopropanolilla.

Saostunut bakteeri-DNA kerättiin sentrifugoimalla ja pes-5 tiin 70 % etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin TE-pusku-riin (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Esimerkki 2 16S ia 23S rRNA-aeenien välialueen monistaminen ia sekvensointi 10 16S ja 23S rRNA-geenien välialue bakteeri-DNA:sta monistettiin PCR:n (Saikiym., Science 239(1988)487) avulla. DNA-segmentin monistuksessa PCR:llä käytettiin aluk-keita, jotka edustivat 16S rRNA-geenin loppupäässä ja 23S rRNA-geenin alkupäässä sijaitsevia konservatiivisia aluei-15 ta. Näiden oligonukleotidialukkeiden sekvenssit olivat: GTCGGAATCGCTAGTAATCG (aluke 16-1A) ja GGGTTCCCCCATTCGGA (aluke 23-1B). PCR-reaktiot suoritettiin DNA Thermal Cycler 480-laitteella (Perkin Elmer, Norwalk, U.S.A.) käyttäen DynaZyme DNA Polymerase-kittiä (Finnzymes, Espoo, 20 Suomi).

Tyypillinen PCR-reaktioseos sisälsi steriiliä tislattua vettä, reaktiopuskuria (loppukonsentraatiot 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 % Triton), 200 μΜ dNTP, ΙμΜ kutakin aluketta, 0,005 - 0,015 μg bak-....: 25 teeri-DNA:ta ja 1,2 U (0,6 μΐ) DynaZyme DNA-polymeraasi- liuosta/100 μΐ reaktioseosta. Reaktioseoksen tilavuus oli *."1^ tyypillisesti 50 μΐ. Kuhunkin PCR-reaktioputkeen lisättiin • · · tippa mineraaliöljyä reaktioseoksen haihtumisen estämisek- • · · * * * • si.

30 PCR-reaktiosyklin parametrit olivat: 30 sek 95 • · ·.·.* °C:ssa (denaturointi) , 30 sek 55 °C:ssa (alukkeen liitty- ··· V: minen) ja 30 sek 72 °C:ssa (synteesi). Syklien lukumäärä oli 30. Ennen ensimmäistä sykliä reaktioputkia inkuboitiin ♦ · » ···, 2 min 92 °C:ssa. PCR-monistus lopetettiin 10 min syntee- Γ 35 siin 72 °C:ssa ja sitä seuraavaan jäähdytykseen 4 °C:n » « t « 9 102298 lämpötilaan. PCR-reaktiotuotteet analysoitiin agaroosigee-lielektroforeesilla. PCR-reaktiotuotteessa olleet vapaat alukkeet ja nukleotidit poistettiin QIAquick PCR -puhdis-tuskitin (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa) avulla.

5 Koska useassa tapauksessa PCR-monistaminen tuotti erikokoisia DNA-fragmentteja (bakteerien genomissa on useita rrn-operoneia, joiden 16S ja 23S rRNA-geenien välialueen pituus muuntelee) , noin 0,5 kiloemäksen kokoiset DNA-fragmentit eristettiin agaroosigeeliltä ja puhdistet-10 tiin QIAquick gel extraction -kitin (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa) avulla. Saatua DNA-fragmenttia käytettiin vuorostaan templaattina PCR-monistuksessa, minkä suoritus oli edellä kuvatun kaltainen. Tässä PCR-monistuksessa saatiin ainoastaan odotettu 0,5 kiloemäksen kokoinen DNA-fragment-15 ti, ja se puhdistettiin kuten edellä.

16S ja 23S rRNA-geenien välialue sekvensoitiin suoraan PCR-monistuksella saaduista noin 0,5 kiloemäksen DNA-fragmenteista ns. syklisellä sekvensointimenetelmällä Circumvent Thermal Cycle Dideoxy DNA-sekvensointikittiä (New 20 England Biolabs. Inc., Beverly, U.S.A.) käyttäen. Sekven-sointireaktioissa käytettiin 3 μΐ analysoitavaa DNA-liuos-ta (50 - 100 ng DNA) ja reaktiot suoritettiin em. PCR-*· laitteessa. Sekvensointireaktiosyklin parametrit olivat: ; : : 40 sek 95 °C:ssa, 30 sek 55 °C:ssa ja 2 min 72 °C:ssa.

< 25 Syklien lukumäärä oli 15. Sekvensointinäytteet analysoi- ,j. tiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Saatiin SEKV.

j***^ NRO: t 1-9. Nukleotidisekvenssit on esitetty IUPAC- • · · *1!.* standardin mukaisesti.

• · · * Esimerkki 3 30 PCR-reaktiot lajispesifisillä oligonukleotideilla • · *.*.* ia PCR-tuotteiden analyysi ··· *.· * Kunkin tutkitun bakteerilajin 16S ja 23S rRNA-gee- ♦ nien välialueen nukleotidisekvenssistä analysoitiin lajil- I I · t···, le spesifiset sekvenssialueet ja syntetisoitiin sekvenssi- 35 analyysin perusteella lajille spesifisiksi alukkeiksi so- • · « · < i ♦ « « « ίο 102298 veituvat oligonukleotidit SEKV. NRO:t 10 - 19 (taulukko 1) välialueen molemmista päistä (16S rRNA- ja 23S rRNA-geenin viereiset päät).

Taulukko I

Lajispesifiset oligonukleotidisekvenssit

Oligo- SEKV. Sekvenssi Pituus Suunta Sijainti nukleotidi NRO: (suunta 5'->3') (nt) (16S-23S) (välialue) LBA-Acil 10 TCTAAGGAAGCGAAGGAT 18 >>>» 16S-puoli -Acill 11 CTCTTCTCGGTCGCTCTA 18 ««< 23S-puoli LBC-CasI 12 CAGACTGAAAGTCTGACGG 19 >>>>> 16S-puoli -CasII 13 GTACTGACTTGCGTCAGCGG 20 <«« 23S-puoli LBD-Dell 14 ACGGATGGATGGAGAGCAG 19 >>>>> 16S-puoli -Delll 15 GCAAGTTTGTTCTTTCGAACTC 22 ««< 23S-puoli LBH-Hell 16 GAAGTGATGGAGAGTAGAGATA 22 »>» 16S-puoli -Helli 17 CTCTTCTCGGTCGCCTTG 18 <«<< 23S-puoli STH-Thl 18 ACGGAATGTACTTGAGTTTC 20 >>>>> 16S-puoli -ThII 19 TTTGGCCTTTCGACCTAAC 19 «<« 23S-puoli PCR-reaktiot suoritettiin kuten esimerkissä 2 on : kuvattu paitsi, että konservatiivisten alukkeiden sijasta V ·' käytettin lajispesifisiä alukepareja (taulukko 1) . Lisäksi alukkeen liittymislämpötila vaihteli riippuen alukeparista ··· seuraavasti: 55 °C alukepareille Acil & Acill sekä ThI & • ·*· : ThII, 60 °C alukeparille CasI & CasII, ja 62 °C alukepa- reille Dell & Delll sekä Hell & Helli. PCR-reaktiotuotteet $ · · analysoitiin agaroosielektroforeesilla. Yhteenvetotaulukko . , reaktioista eri alukepareilla kullakin testatulla baktee- ’*]·* rilajin DNA: 11a on esitetty taulukossa 2.

*00 I « f i 4 f I « 4 t

4 < I

< I I I I

I I

I I I

t I I I *

t t I < I

« I

I · « n 102298

Taulukko 2

Bakteeri-DNA:n PCR-monistuminen lajispesifisillä oiigonukleotidialukeparei1la

Bakteerilaji Kanta PCR-monistuminen alukeparilla*

& alalaji LBC LBD LBA LBH STH

Lb. casei ssp. caseib A-lc + - - - - asp. rhamnosusb G-lc + - - - - ssp. rhamnosusb 1/3C + - - - -

Lb. paracasei ssp. casei ATCC 270924 + - - - -

Lb. delbrueckii ssp. lactisb LKT1 + - - - ATCC 158084 + ssp. bulgaricusb LT4C - + - - -

Lb. acidophilus ATCC 43564 + - -

Lb. helveticus ATCC 150094 + helveticusb H-lc - - - + -

Str. thermophilus ATCC 199874 + thermophilusb ST-1® - - - +

Lb. salivarius ssp. salivarius ATCC 117414 _____ * . j'; L. lactis JCM 76 384 _____ ’·* ' lactis P008-I® -

Propionibacterium ·;· freudenreichii ATCC 62074 _____ * * * * ί : : Escherichia coli HB101® _____ • e e · • · · _________________ __ » · · • · · * * Alukeparit: LBC * CasI & CasII, LBD = Dell & Delll, LBA = Acil &

Acill, LBH « Hell & Helli, STH - ThI & ThII. b Lajimääritye tehty API 50CHL-kitillä {BioMerieux S.A., Ranska).

•t*(· c Teollinen maitohappobakteerikanta.

4 ATCC « American Type Culture Collection, JCM = Japan Collection ·.* · of Micro-organisms. * Laboratoriokanta.

e • i « « · I « « t « · • · I · · 12 102298

Sekvenssilistaus (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJAT: (A) NIMI: Oulutech Oy (B) KATU: Teknologiantie 1 (C) KAUPUNKI: Oulu (E) MAA: Suomi (F) POSTIKOODI (ZIP): 90570 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Menetelmä maitohappobakteerilajien määrittämiseksi ja menetelmään soveltuvia oligonukleotideja (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 19 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 205 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (vi) ALKUPERÄ: • (A) ORGANISMI: Lactobacillus acidophilus ' i‘ (B) KANTA: ATCC 4356 ·' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: CTAAGGAAGC GAAGGATATG GAGAGTAGAA ATACTAAGAG AAGTATCCAG AGCAAGCGGA 60 ..!·* AGCACACTAA GAAACTTTGT TTAGTTTTGA GGGTAGTACC TCAAAAGAGT TAGTACATTG 120 • · : AAAäCTGAAT ATAATCCAAG CAAäAAACCG AGACAATCäA GAGAACAGAT TGTAGAGCGA 180

»•I

V : CCGAGAAGAG AATTCTTGGG TAAGG 205 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 222 emäsparia V * (B) TYYPPI: nukleiinihappo * (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (B) KANTA: 1/3 102298 13 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: CTAAGGAAAC AGACTGAAAG TCTGACGGAA ACCTGCACAC ACGAAACTTT GTTTAGTTTT 60 GAGGGGATTA CCCTCAAGCA CCCTAGCGGG TGCGACTTTG TTCTTTGAAA ACTGGATATC 120 ATTGTTGTAA ATGTTTTAAA TTGCCGAGAA CACAGCGTAT TTGTATGAGT TTCTAATAAT 180 AGAAATTCGC ATCGCATAAC CGCTGACGCA AGTCAGTACA GG 222 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 221 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus casei ssp. casei (B) KANTA: A-l (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: CTAAGGAAAC AGACTGAAAG TCTGACGGAA ACCTGCACAC ACGAAACTTT GTTTAGTTTT 60 GAGGGGATCA CCCTCAAGCA CCCTAGCGGG TGCGACTTTG TTCTTTGAAA ACTGGATATC 120 ATTGTATTAA TTGTTTTAAA TTGCCGAGAA CACAGCGTAT TTGTATGAGT TTCTGAAAAA 180 GAAATTCGCA TCGCATAACC GCTGACGCAA GTCAGTACAG G 221 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 222 emäsparia ·.· * (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen * * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) • · : (Ui) hypoteettinen: Ei • · · * (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (B) KANTA: G-l • · *.*.· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: • · · • · · '.* * CTAAGGAAAC AGACTGAAAG TCTGACGGAA ACCTGCACAC ACGAAACTTT GTTTAGTTTT 60 GAGGGGATTA CCCTCAAGCA CCCTAGCGGG TGCGACTTTG TTCTTTGAAA ACTGGATATC 120 ATTGTTGTAA ATGTTTTAAA TTGCCGAGAA CACAGCGTAT TTGTATGAGT TTCTAATAAT 180 : ’. AGAAATTCGC ATCGCATAAC CGCTGACGCA AGTCAGTACA GG 222 .···. (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: 14 102298 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 220 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen)

(iii) HYPOTEETTINEN: EI

(vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis (B) KANTA: ATCC 15808 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5: CTAAGGAAAA CGGATGGATG GAGAGCAGAA ATGCTAARAG AAAGTCCATC AGTTACGGAA 60 GCACACTGCA AAAGAAACTT TGTTCAGTTT TGAGAGTATC AGCTCTCACT TGTACGTTGA 120 AAACTGAATA TCTTAATTCC AAGAAAAAAY CGAGAATCAT TGAGATCAAT GAAAACATTG 180 CAAAGCGACC GAGAGAGTTC GAAAGAACAA ACTTGCAAGG 220 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 222 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen)

(iii) HYPOTEETTINEN: EI

· · (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus delbrueckii spp. lactis

. (B) KANTA: LKT

• · · • · · · • · • · · • · · "··. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6: • · · CTAAGGAAAA CGGATGGATG GAGAGCAGAA ATGCTAARAG AAAGTTCCAT CCAGTTACGG 60 AAGCACACTG CAAAAGAAAC TTTGTTCAGY TTTGAGAGTA TCAGCTCTCA CTTGTACGTT 120 • · · • · GAAAACTGAA TATCTTAATT CCAAGAAAAA AYCGAGAATC ATTGAGATCA ATGAAAACAT 180 • · · TGCAAAGCGA CCGAGAGAGT TCGAAAGAAC AAACTTGCAA GG 222 (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 222 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo " (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 1= 102298 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus (B) KANTA: LT4 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: CTAAGGAAAA CGGATGGATG GAGAGCAGAA ATGCTAAGAR AAAGTCCATT CCAGTTACGG 60 AAGCACACTG CAAAAGAAAC TTTGTTCAGY TTTGAGAGTA TCAGCTCTCA CTTGTACGTT 120 GAAAACTGAA TATCTTAATT CCAAGAAAAA AYCGAGAATC ATTGAGATCA ATGAAAACAT 180 TGCAAAGCGA CCGAGAGAGT TCGAAAGAAC AAACTTGCAA GG 222 (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 205 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus helveticus . (B) KANTA: ATCC 15009 ‘ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: • CTAAGGAAGC TGAAGTGATG GAGAGTAGAG ATACTAAGAG AAGTCACAAA AGCAAGCGGA 60 * · · ϊ\·. AGCACACTGA GAAACTTTGT TTAGTTTTGA GGGTAGTACC TCAAAGAGCT AGTACATTGA 120 ♦ · · ’•J·1 AAACTGAATA TAATCCAAGC AAAAAACCGA GAAAATCAAA GAGAACAGAT TGCAAGGCKA 180 • · » CCGAGAAGAG AATTCTTGAG TAAGG 205 • · • · 1 • · · • · · · • · · • · · (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: 16 102298 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 274 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Streptococcus thermophilus (B) KANTA: ATCC 19987 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: CTAAGGAAAA ACGGAATGTA CTTGAGTTTC TTATTTAGTT TTGAGAGGTC TTGTGGGGCC 60 TTAGCTCAGC TGGGAGAGCG CCTGCTTTGC ACGCAGGAGG TCAGCGGTTC GATCCCGCTA 120 GGCTCCATTG AATCGAAAGA TTCAAGTATT GTCCATTGAA AATTGAATAT CTATATCAAA 180 TTCCATATGT AAGTAATTAC ATATAGATAG TAACAAGAAA ATAAACCGAA ACGCTGTGAA 240 TATTTAATGA GTTAGGTCGA AAGGCCAAAA ATAA 274 (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus acidophilus • ···· • · • · · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: • · · TCTAAGGAAG CGAAGGAT 18 (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: • · · • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ’·' * (A) PITUUS: 18 emäsparia „!. (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen I,, (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) • « 17 102298 (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus acidophilus (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 11: CTCTTCTCGG TCGCTCTA 18 (2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus casei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12: CAGACTGAAA GTCTGACGG 19 (2) SEKVENSSIN NRO 13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus casei ..!!* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 13: • · : gtactgactt gcgtcagcgg 20 • · · * (2) SEKVENSSIN NRO 14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 19 emäsparia ’·*·' (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen *·* * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus delbrueckii (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 14: 18 102298 ACGGATGGAT GGAGAGCAG 19 (2) SEKVENSSIN NRO 15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus delbrueckii (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 15: GCAAGTTTGT TCTTTCGAAC TC 22 (2) SEKVENSSIN NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Lactobacillus helveticus (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 16: GAAGTGATGG AGAGTAGAGA TA 22 • · • · · ' (2) SEKVENSSIN NRO 17 TIEDOT: • · · *·1 ' (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen *·1·1 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · · ’·] 1 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: '· (A) ORGANISMI: Lactobacillus helveticus (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 17: is 102298 CTCTTCTCGG TCGCCTTG ' 18 (2) SEKVENSSIN NRO 18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Streptococcus thermophilus (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 18: ACGGAATGTA CTTGAGTTTC 20 (2) SEKVENSSIN NRO 19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Streptococcus thermophilus V : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 19: TTTGGCCTTT CGACCTAAC 19 » • · · • · · · • · • · · • · · • · · · • · · • · « • · · 1 · • · c • · « • · • · · • « · • · ·

Claims (10)

1. 20 102298
2. 1. Menetelmä meijerihapate- tai probioottikäytössä merkittävän maitohappobakteerilajin määrittämiseksi geeni- 5 teknisesti, tunnettu siitä, että osoitetaan maitohappobakteerilaj ille tunnusomainen nukleiinihapposek-venssi bakteerin 16S- ja 23S-tyyppistä ribosomaalista RNA:ta tuottavien geenien väliseltä alueelta.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että osoitetaan Lactobacillus del-brueckii. Lactobacillus (para)casei. Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus helveticus ja/tai Streptococcus thermophilus.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että nukleiinihapposekvenssi osoitetaan siihen spesifisesti hybridisoituvalla, lajispesifisellä oligonukleotidilla tai oligonukleotidiparilla.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään PCR- 20 teknologiaa.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, '·' tunnettu siitä, että alukeparina käytetään exigent : nukleotidiparia, joka on johdettavissa jostakin SEKV. ·; I NRO-.ista 1-9 eli joko sille löytyy vastine mainitusta 25 sekvenssistä tai sen komplementaarisesta juosteesta tai se • · · · : ,·, on riittävän samanlainen jomman kumman kanssa hybridisoi- • · · V./ tumaan spesifisesti kohdesekvenssiin lajispesifisessä mää- • · · • rityksessä.
7. 6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, • · · *·*·’ 30 tunnettu siitä, että lajispesifisellä oligonukleo- V * tidilla on jokin SEKV. NRO:ista 10 - 19. • ‘j*: 7. Oligonukleotidi, tunnettu siitä, että .*··. se hybridisoituu spesifisesti nukleiinihapposekvenssiin, joka on tunnusomainen meijerihapate- tai probioottikäytös- « * • " 35 sä merkittävälle maitohappobakteerilajille joukosta Lacto- 102298 bacillus delbrueckii. Lactobacillus acidophilus. Lactobacillus helveticus ja/tai Streptococcus thermophilus ja joka on bakteerin 16S- ja 23S-tyyppistä ribosomaalista RNA:ta tuottavien geenien väliseltä alueelta.
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että se on johdettavissa jostakin SEKV. NRO:ista 1 tai 5-9 eli joko sille löytyy vastine mainitusta sekvenssistä tai sen komplementaarisesta juos-teesta tai se on riittävän samanlainen jomman kumman kansio sa hybridisoitumaan spesifisesti kohdesekvenssiin lajispesifisessä määrityksessä.
9. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen oligonukleotidi, tunnettu siitä, että sillä on jokin SEKV. NRO:ista 10, 11 tai 14 - 19.
10. 10. Oligonukleotidin käyttö meijerihapate- tai pro- bioottikäytössä merkittävien maitohappobakteerilajien määrittämiseen, joka oligonukleotidi hybridisoituu spesifisesti nukleiinihapposekvenssiin, joka on tunnusomainen mainitulle maitohappobakteerilajille ja joka on bakteerin 20 16S- ja 23S-tyyppistä ribosomaalista RNA:ta tuottavien geenien väliseltä alueelta. • « · » 1 • 1 · • · · · • · • « · • · · • · · · • t« • 1 · • · · • · • · · • · · • · • · · • 1 · • · · · · « » · « · · 22 102298