KR101943503B1 - 락토바실러스 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents
락토바실러스 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물의 진단 또는 검출을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 락토바실러스 속 미생물 6종(L. gassei , L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum) 각각을 특이적으로 진단 또는 검출할 수 있는 프라이머 세트; 이를 포함하는 락토바실러스 속 미생물 종-특이적 검출용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 락토바실러스 속 미생물 종-특이적 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 락토바실러스 속 미생물 6종 각각을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있어, 이를 이용하는 경우 형태 및 색깔이 유사하여 종간 구별이 어려워 오동정할 위험성이 있는 락토바실러스 속 미생물의 종류를 신속하고 정확하게 동정할 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물의 진단 또는 검출을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 락토바실러스 속 미생물 6종(L. gassei, L. acidophilus, L. helveticus, L. jensenii, L. crispatus, 및 L. gallinarum) 각각을 특이적으로 진단 또는 검출할 수 있는 프라이머 세트; 이를 포함하는 락토바실러스 속 미생물 종-특이적 검출용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 락토바실러스 속 미생물 종-특이적 검출 방법에 관한 것이다.
락토바실러스(Lactobacillus) 종(species)은 식품 및 동물과 사람의 소화기관이나 여성의 질내에서 발견된다. 젖산을 생성하여 요거트, 유산균음료, 김치, 장류, 치즈 등의 식품을 발효시키는데 중요한 역할을 하며, 다른 병원성 미생물에 대한 항균활성을 가지기 때문에 우리몸의 항상성을 유지하는데 도움을 준다.
여러 락토바실러스 종들이 대장 관련 질환, 피부 질환 등에서 효과가 있다는 것은 수 많은 연구를 통해 입증되었다.
일부 락토바실러스 균주(strain)들은 발효식품이나 동물사료의 생산시에 스타터 컬처(starter culture)로서 사용되기도 한다.
그러나, 유산균이 함유된 제품에서 유전적으로 비슷한 성질을 가지는 락토바실러스를 분리 및 동정하기 위해서는 많은 시간과 비용이 필요하다.
이에 따라, 유전적 성질이 비슷한 락토바실러스 종들을 정확하고 간단하게 동정할 수 있는 새로운 기술 개발의 필요성은 항시 존재하고 있는 실정이었다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 락토바실러스 속 미생물 6종(L. gassei , L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum) 각각을 특이적으로 진단 또는 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이 목적이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 락토바실러스 속 미생물의 다양한 종(L. gassei , L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus, 및 L. gallinarum)을 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 또는 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제6 프라이머 쌍;을 포함하는, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물의 종-특이적 검출용 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 락토바실러스 속 미생물은 L. gassei , L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)인 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 제1 프라이머 쌍은 1,200bp 내지 1,300bp의 L. gassei 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 제2 프라이머 쌍은 800bp 내지 850bp의 L. acidophilus 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 제3 프라이머 쌍은 650bp 내지 700bp의 L. helveticus 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 제4 프라이머 쌍은 500bp 내지 550bp의 L. jensenii 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 제5 프라이머 쌍은 350bp 내지 400bp의 L. crispatus 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 제6 프라이머 쌍은 200bp 내지 250bp의 L. gallinarum 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 조성물을 포함하는 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료에서 락토바실러스 속 미생물 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 락토바실러스 속 미생물은 L. gassei , L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)인 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 PCR을 수행하는 것은, 55℃ 내지 65℃ 범위 내의 온도에서 어닐링(annealing)을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
이러한 본 발명에 따른 프라이머 세트는 락토바실러스 속 미생물 6종(L. gassei, L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum) 각각을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있어서, 이를 이용하는 경우 형태 및 색깔이 유사하여 종간 구별이 어려워 오동정할 위험성이 있는 락토바실러스 속 미생물의 종류를 신속하고 정확하게 동정할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 속 미생물 종-특이적 프라이머 및 이를 이용한 락토바실러스 속 미생물 6종의 검출방법은 농식품 현장에서 효율적인 미생물 진단 뿐만 아니라, 발효식품이나 동물사료 등에 포함된 락토바실러스 속 미생물을 정확하고 간단하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1a~f은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프라이머를 디자인할 때 이용한 락토바실러스 6종의 염기서열을 나타낸 것이다(서열번호 13: L. gasseri, 서열번호 14: L.acidophilus, 서열번호 15: L. helveticus, 서열번호 16: L. jensenii, 서열번호 17: L.crispatus, 서열번호 18: L.gallinarum).
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 락토바실러스 6종에 대한 프라이머 세트의 PCR(Polymerase Chain Reaction) 조건을 조절하기 위한 Annealing temperature Gradient PCR 결과를 나타낸 것이다. (A, Lactobacillus gasseri; B, Lactobacillus acidophilus; C, Lactobacillus helveticus; D, Lactobacillus jensenii; E, Lactobacillus crispatus; F, Lactobacillus gallinarum; M, size marker(bp); 1, 63 ℃; 2, 62.6 ℃; 3, 62 ℃; 4, 61.1 ℃; 5, 59.9 ℃; 6, 56 ℃; 7, 58.3 ℃; 8, 58 ℃)
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 PCR template로서 gDNA를 사용하여 제작된 락토바실러스 6종의 프라이머 세트를 모두 섞은 후 Mutiplex PCR을 실시한 결과를 나타낸 것이다. (M, size marker(bp); 1, Lactobacillus gasseri; 2, Lactobacillus acidophilus; 3, Lactobacillus helveticus; 4, Lactobacillus jensenii; 5, Lactobacillus crispatus; 6, Lactobacillus gallinarum; NC, negative control)
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 락토바실러스 6종의 프라이머 세트를 모두 섞은 뒤 타겟 종, 다른 종, 다른 속(genus)에 대한 반응이 있는지 확인한 Multiplex PCR 결과를 나타낸 것이다. (M, size marker(bp); 1, Lactobacillus gasseri; 2, Lactobacillus acidophilus; 3, Lactobacillus helveticus; 4, Lactobacillus jensenii; 5, Lactobacillus crispatus; 6, Lactobacillus gallinarum; 7, Lactobacillus plantarum; 8, Lactobacillus salivarius; 9, Lactobacillus reuteri; 10, Enterococcus faecalis; 11, Enterococcus faecium; NC, negative control)
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 락토바실러스 6종에 대한 프라이머 세트의 PCR(Polymerase Chain Reaction) 조건을 조절하기 위한 Annealing temperature Gradient PCR 결과를 나타낸 것이다. (A, Lactobacillus gasseri; B, Lactobacillus acidophilus; C, Lactobacillus helveticus; D, Lactobacillus jensenii; E, Lactobacillus crispatus; F, Lactobacillus gallinarum; M, size marker(bp); 1, 63 ℃; 2, 62.6 ℃; 3, 62 ℃; 4, 61.1 ℃; 5, 59.9 ℃; 6, 56 ℃; 7, 58.3 ℃; 8, 58 ℃)
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 PCR template로서 gDNA를 사용하여 제작된 락토바실러스 6종의 프라이머 세트를 모두 섞은 후 Mutiplex PCR을 실시한 결과를 나타낸 것이다. (M, size marker(bp); 1, Lactobacillus gasseri; 2, Lactobacillus acidophilus; 3, Lactobacillus helveticus; 4, Lactobacillus jensenii; 5, Lactobacillus crispatus; 6, Lactobacillus gallinarum; NC, negative control)
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 락토바실러스 6종의 프라이머 세트를 모두 섞은 뒤 타겟 종, 다른 종, 다른 속(genus)에 대한 반응이 있는지 확인한 Multiplex PCR 결과를 나타낸 것이다. (M, size marker(bp); 1, Lactobacillus gasseri; 2, Lactobacillus acidophilus; 3, Lactobacillus helveticus; 4, Lactobacillus jensenii; 5, Lactobacillus crispatus; 6, Lactobacillus gallinarum; 7, Lactobacillus plantarum; 8, Lactobacillus salivarius; 9, Lactobacillus reuteri; 10, Enterococcus faecalis; 11, Enterococcus faecium; NC, negative control)
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 속(genus)에 속하는 다양한 미생물 종을 특이적으로 진단 또는 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 미생물은 L. gassei , L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum 로 이루어진 군으로부터 선택되는 종(species)일 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 락토바실러스 속에 속하는 6종(species)의 미생물(L. gassei , L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum)을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머 쌍을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 또는/및 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제6 프라이머 쌍;을 사용할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍을 이용하는 경우 L. gassei 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 이용하는 경우 L. acidophilus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 있고; 본 발명의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 3 프라이머 쌍을 이용하는 경우 L. helveticus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제 4 프라이머 쌍을 이용하는 경우 L. jensenii 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 있고; 본 발명의 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 제 5 프라이머 쌍을 이용하는 경우 L. crispatus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 6 프라이머 쌍을 이용하는 경우 L. gallinarum 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 제 1 프라이머 쌍을 이용하는 경우 1,200bp 내지 1,300bp의 L. gassei 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 제 2 프라이머 쌍을 이용하는 경우 800bp 내지 850bp의 L. acidophilus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 있고; 본 발명의 제 3 프라이머 쌍을 이용하는 경우 650bp 내지 700bp의 L. helveticus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 제 4 프라이머 쌍을 이용하는 경우 500bp 내지 550bp의 L. jensenii 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 있고; 본 발명의 제 5 프라이머 쌍을 이용하는 경우 350bp 내지 400bp의 L. crispatus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 제 6 프라이머 쌍을 이용하는 경우 200bp 내지 250bp의 L. gallinarum 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 제2 프라이머 쌍은 락토바실러스 속 미생물의 Ribosomal DNA 영역에 존재하는 MFS-transporter 염기서열에서 종 특이적으로 나타나는 염기 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 DNA 단편을 증폭시킬 수 있고, 상기 제3 프라이머 쌍은 ACPS-malonyltransferase 염기서열에서 종 특이적으로 나타나는 염기 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 DNA 단편을 증폭시킬 수 있고, 상기 제4 프라이머 쌍은 Acetoacetate decarboxylase 염기서열에서 종 특이적으로 나타나는 염기 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
본 발명자들은 락토바실러스 속 9종(L. gasseri , L.acidophilus, L.helveticus, L. jensenii , L. crispatus , L. gallinarum , L. johnsonii , L.amylonovus, L. delbrueckii)의 whole genome sequence 데이터(88개의 데이터)를 분석하고, 각 species들의 strain간의 gene 비교를 통하여 Sequence homology가 90% 이상인 orthologs들을 선별하였으며, 이를 이용하여 락토바실러스 속 6종(L. gassei, L. acidophilus, L. helveticus , L. jensenii , L. crispatus , 및 L. gallinarum)에 대한 종-특이적 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머는 상기에서 언급한 바와 같이 서열번호 1 내지 12로 나타내었다.
본 발명자들은 상기 제작된 락토바실러스 속 미생물 6종 각각의 종-특이 프라이머를 이용하여, DNA 샘플 채취에 사용된 총 6종의 락토바실러스 속 미생물을 대상으로 PCR을 수행하였으며, 그 결과 각각의 종(species)에서만 특이적으로 서로 다른 밴드가 증폭되는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 제 1 프라이머 쌍은 L. gassei , 제 2 프라이머 쌍은 L. acidophilus, 제 3 프라이머 쌍은 L. helveticus, 제 4 프라이머 쌍은 L. jensenii , 제 5 프라이머 쌍은 L. crispatus , 제 6 프라이머 쌍은 L. gallinarum 만을 종 특이적으로 표식함을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 또는/및 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제6 프라이머 쌍;을 포함하는 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 제 1 프라이머 쌍을 이용하는 경우 바람직하게는 1,241bp의 L. gassei 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 제 2 프라이머 쌍을 이용하는 경우 바람직하게는 828bp의 L. acidophilus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 있고; 본 발명의 제 3 프라이머 쌍을 이용하는 경우 바람직하게는 680bp의 L. helveticus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 제 4 프라이머 쌍을 이용하는 경우 바람직하게는 540bp의 L. jensenii 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 있고; 본 발명의 제 5 프라이머 쌍을 이용하는 경우 바람직하게는 376bp의 L. crispatus 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 본 발명의 제 6 프라이머 쌍을 이용하는 경우 바람직하게는 224bp의 L. gallinarum 종 특이적 PCR 산물이 증폭될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 또는/및 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제6 프라이머 쌍)뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 또는/및 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제6 프라이머 쌍) 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료에서 락토바실러스 속 미생물 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제3 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 제4 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 제5 프라이머 쌍; 또는/및 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제6 프라이머 쌍)를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 락토바실러스 속 미생물의 종-특이적 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 PCR을 수행하는 것은, 55℃ 내지 65℃ 범위 내의 온도에서 어닐링(annealing)을 수행하는 것일 수 있다. 즉, 본 발명에서 PCR을 수행하는 구체적인 방법은 특별히 제한되지 않고, 어닐링 온도 역시 특별히 제한되지는 않지만 55℃ 내지 65℃ 범위 내, 바람직하게는 58℃ 내지 63℃ 범위 내, 더욱 바람직하게는 60℃ 내지 63℃ 범위 내의 온도에서 어닐링을 수행하는 경우 보다 명확한 전기영동 밴드를 얻을 수 있다. 어닐링 온도가 상기 보다 낮으면 non-specific한 밴드가 나올 수도 있기 때문에, 모든 균주가 detection되는 온도 중 가장 높은 온도로 수행하는 것이 바람직하다.
상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방산선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.
상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 프라이머의 제작
락토바실러스에 대한 프라이머 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 사이트의 genome 검색란에서 Lactobacillus를 검색하였고, whole genome sequence(WGS) 데이터를 다운로드 하였다. 다운받은 WGS를 분석에 이용하였으며, 본 발명에서는 총 88개의 데이터(L. gasseri , L.acidophilus, L.helveticus, L.jensenii, L.crispatus, L.gallinarum, L.johnsonii, L.amylonovus, L. delbrueckii)를 이용하였다.
상기 다운로드 받은 WGS에 species, strain, gene 이름을 부여하여 정리한 후, 하나의 파일로 병합시켰다. 그 다음, Global Alignment Short Sequence Search Tool(GASSST) 분석을 이용하여 각 species들의 strain간의 gene 비교를 통해 Sequence homology가 65% 이상인 gene을 대상으로 Ortholog라는 이름을 부여하였다. 다시 말하면, gene별로 Ortholog.xxxxx(x: 숫자, 00001부터 시작) 형식을 부여하였다.
상기 Genome을 fragmentation 시키는 tool을 이용하여 gene들을 7bp 간격으로하여 총 50bp로 gene fragments를 만들었으며, 상기 gene fragments를 GASSST를 이용하여 Ortholog gene 에 align 시켰다(homology >65%). 이 후, gene 길이의 30% 미만의 coverage를 보이는 경우, 해당 gene은 상기 검색된 Genome 상에 존재하지 않는 걸로 판단하여 분석에 이용하지 않았다. 상기 부여된 Orthologs 들을 각 species의 strain의 genome data와 비교 분석하여 homology(%)를 기재하였다. 상기 분석된 파일을 통해 각 species마다 특이적으로 존재하는 Orthologs 중, sequence homology가 90% 이상인 orthologs들을 선별하였고, Primer 디자인하는데 이용하였다. 상기 sequence homology가 90% 이상인 서열은 하기 도1 a~f에 나타내었다. 도 1a~f은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프라이머를 디자인할 때 이용한 락토바실러스 6종의 염기서열을 나타낸 것이다(서열번호 13: L. gasseri, 서열번호 14: L.acidophilus, 서열번호 15: L. helveticus, 서열번호 16: L. jensenii, 서열번호 17: L. crispatus, 서열번호 18: L. gallinarum).
프라이머 디자인의 경우, 오픈소스인 Primer3Plus 를 이용하였고, PCR(Polymerase Chain Reaction) 후 전기영동 결과이미지에서 각 종(species)의 차이를 눈으로 확인할 수 있도록 Product size를 조절하였다. 이를 통해 L.gasseri(1241bp), L.acidophilus(828bp), L.helveticus(680bp), L.jensenii(540bp), L. crispatus(376bp), L. gallinarum(224bp) 6종의 프라이머를 디자인하였으며, 실제 적용가능한지 알아보기 위하여 프라이머를 주문제작 후 최적의 PCR 조건을 결정하였다. 상기 6종의 프라이머는 종(species) 간 구분이 한 번에 가능하게 하기 위해서 6종의 product size를 모두 다르게 디자인하였고, 상기 6종의 프라이머 및 product size는 하기 표 1에 나타내었다. 한 번의 PCR로 6종의 Lactobacillus를 검출할 수 있도록 PCR 조건을 맞추어 모든 프라이머들을 섞은 후 테스트를 진행하였다. 이하, 상기 PCR 실험과정에 대해서는 하기 실험예 1에서 자세히 설명한다.
실험예
1:
락토바실러스
6종 각각에 대한
PCR
PCR 과정에서 최적의 어닐링(annealing) 온도를 알아보기 위하여 6종의 균주에 대하여 gradient PCR을 실시하였다. PCR mixture는 총 20ul이며 멸균된 증류수, 0.8m dNTPs, 1.25mM MgCl2, 0.075U i-Taq DNA polymerase (iNtRON Biotechnology, South Korea), 10x PCR buffer (2ul, 20mM MgCl2), 각 균주에 맞는 프라이머 한 세트(reverse와 forward primer)가 0.125 pmol씩 들어있으며, 5ng/ul의 DNA가 포함되어있다. denaturation, annealing, extension의 과정이 각각 94 ℃ 에서 20초, 58~63℃에서 30초, 72 ℃에서 1.5분씩 40cycle 반복되었다.
PCR 증폭 후, TAE buffer와 ethidium-bromide (349.31 g/mol)가 포함된 1.5% agarose gel로 전기영동 하여 밴드를 확인하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, L. gassei의 경우 58 ℃에서 뚜렷한 밴드가 나오지 않았으나 다른 균주들은 설정한 온도 범위에서 모두 뚜렷한 밴드를 보였다. 상기 Gradient PCR결과를 바탕으로 PCR을 수행하기 위한 어닐링 온도를 결정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, Lactobacillus 6종이 특이적으로 검출되는 것을 확인하였고 negative control (Lactobacillus 다른 종들과 Enterococcus 균주)은 검출되지 않는 것을 확인하였다. 설정한 온도 조건에서 Lactobacillus 6종 모두 뚜렷한 밴드를 나타냄으로써, PCR 조건을 확립하였다.
실험예
2:
락토바실러스
6종 모두에 대한 Multiplex
PCR
1) 타겟 락토바실러스 6종에 대한 Mutiplex PCR
PCR mixture안에 6종 primer를 모두 넣고, 한 번의 PCR로 6개 균의 동정이 가능한지 확인하였다. PCR mixture는 총 20ul이며 멸균된 증류수, 0.8m dNTPs, 1.25mM MgCl2, 0.075U i-Taq DNA polymerase (iNtRON Biotechnology, South Korea), 10x PCR buffer (2ul, 20mM MgCl2), 5ng/ul의 DNA와 6세트의 프라이머가 0.125 pmol씩 섞여 있다. Negative의 경우 DNA대신 멸균된 증류수를 넣었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 타겟하는 6개의 균주에 예상했던 사이즈의 밴드가 검출되었고 negative control에서는 밴드가 나타나지 않은 것을 확인하였다.
2) 타겟 락토바실러스 6종 외 다른 균주에 대한 Multiplex PCR
상기 실시예 1에서 디자인된 primer가 타겟으로하는 6개 균주만 특이적으로 검출하는지 다른 Lactobacillus species들 및 Enterococcus 균주를 이용하여 확인하였다. 실험조건 및 방법은 상기 실험예 2와 동일하게 진행되었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 타겟으로한 6개 균주들은 모두 예상된 사이즈에서 밴드가 검출되었고 나머지 샘플들과 negative control에서는 밴드가 검출되지 않은 것을 확인하였다. 상기 실시예 1에서 디자인된 primer가 타겟으로하는 6개 균주를 특이적으로 detection할 수 있음을 다시 한 번 증명하였다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation
<120> Species-specific primers for the diagnosis of the genus
Lactobacillus and uses thereof
<130> PA-D2017-30
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. gasseri_F primer
<400> 1
aatactcccg aagcacgtca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. gasseri_R primer
<400> 2
tcattgtgtt tggcaatcgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. acidophilus_F primer
<400> 3
tcatgttggg atgcaatgag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. acidophilus_R primer
<400> 4
tttcaaaact tgtcctgctg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. helveticus_F primer
<400> 5
gtatgatcgt tcgccaccac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. helveticus_R primer
<400> 6
attgtcgcca tgagtacagg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. jensenii_F primer
<400> 7
atgcttggcg cttatcctt 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. jensenii_R primer
<400> 8
atatggtgcg atttcatctg g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. crispatus_F primer
<400> 9
tggcgaagag acaccaatat c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. crispatus_R primer
<400> 10
tgacgtaacg catgatgaat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. gallinarum_F primer
<400> 11
agtcttgagc ccgtaaaagc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L. gallinarum_R primer
<400> 12
ttgccaaacg gttcttcttt 20
<210> 13
<211> 2367
<212> DNA
<213> Lactobacillus gasseri
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2367)
<223> Hypothetical protein
<400> 13
gtgcggaggc ttggtcgttt ggcagcccaa ctcacgatac acgctacttc atccgccttg 60
ccaaacggaa gaataaagaa gttcgatact ttaatacaag aatggaggat tgctaagatg 120
cactttactt tatcaacagc agccaattcc ggtcaggcca gtaacactat ttaccctaac 180
cagctaatta tcactaactc ccaagaatta cagcaggccg tacagtatga ccatgtttgt 240
gggcggttca agaataacca acgtaacatt gcaaacttca tcaaagctga ctgcttagtc 300
atggattgtg acaatgacca ctctgatgat tctgccgctt ggattaatcc taccagcatt 360
gcgaattact ttgatggcgt ttcttatgcc attacattat cgcgcaacaa catgaaagct 420
aagaacaata aagccccgcg cccaaagttc cacatctact ttccaattag cgagatcaat 480
aatgctaaaa cctacgctga attaaaacat gaaattcaag aatatttccc ctattttgat 540
aacaatgctc tcgatgctgc ccgcttcgta tttggtgttc ccagtacaca agttagttgg 600
cacgaaggat cccaaaccat cgaccaattt atgatggcgc aacgttactt tgccaagcaa 660
aaggtcggat cgattcgcca aggcaaacgc aatgcaactc tctcccactt tgctggtcga 720
atcattatgc gattgggcaa tactcccgaa gcacgtcagg cctttcaaga cgaggcagcg 780
aagtgtgaac cgccactggg agaacaagaa ctaagaacca tctggcatag tgctatcaaa 840
ttcggccacc gaatggccag taaaaaaggt tatattccac ctgaagaata taatcaaccc 900
aatgatgatc tgcatcccta cgattattcg gatactggcg agtcctatgt ttttgttaac 960
aactgtaagg accgcgtctg ctacaccaac cagtcaggtt ttatgtggtt tgacggtaaa 1020
atttggcaag aatcggagcc cctcgctctc ggcgaggttc aacgctttac tgacaaacaa 1080
cttgcggatg ctcaactacg agtcactaag gcttaccaag tgatccaaca aaatggcgta 1140
actagcgcgc ttcaaacgat gggcaaaacg aaggctagtc gcacttttaa tgatgatcag 1200
caagctacgt tcaaagaata tcaaaacgcc aaggcttatg aagcttttat tctcaaggaa 1260
cggagcaccc gtggcatcaa tggaatcttg actaacgccc ggccaaagtt agtaaaagaa 1320
atcaatgaat tcgatgctaa tcccttttta ttaaacactc ctgatggccc ttacaacctt 1380
aaacagggca ttcatgggca acaagaaatt caagccagcg atttgattac taagtccacg 1440
tcttgtgtgc ctggcagtca aggaaattca atctggcaag aagccctaaa tacattcttt 1500
tgtaacgacc tagcactaat aaattacgtt caagaaattg tgggactcgt tgccattggt 1560
caggtttact tggaagcgtt gattattgca tatggcagtg gacgaaatgg taaatccact 1620
ttctggaaca caattgccaa tgtactcggt tcttatactg gtcacctctc agctgatgcc 1680
ttaacaacag gtgttcgacg gaatgtcaaa ccagaaatgg ctgaagtcaa aggtaaacgc 1740
ttaatcatct ctgctgagct ggaagaaggc aaacgactaa acacttcgat tgtcaaacaa 1800
ctctgttcaa ctgatgaaat ctacgctgag aaaaaataca tgaagccctt ctcttttaca 1860
cctagtcata ccatcgttct ctataccaac tacctgcctc acgtgggcgg taacgatgaa 1920
ggaatctggc ggcgattgat cgtaataccg tttaaagcca cgattgccaa acacaatgat 1980
attaaaaatt atgcccagta cctaaccgaa caagccggtc cggcagtgtt gcaatggatc 2040
attgagggcg cgcaacgaat cattcaacaa aattaccagc taactactcc ggcagcagtt 2100
actaaagcag tcaaggacta ccacgccgat aatgactggt taggtcattt tctcaatgaa 2160
aattgcgaac ttgattctag ttatcagcaa aaatcgggtg acctctatca aaagtaccga 2220
gaatactgcc aaggtatcgg cgaatacacc cgaagtacca ctgactttta cacggccctt 2280
aagaatgcgg gctttcaacg tcaacgtaag aatactggat cctatgttcg cggactgcgc 2340
ttaaaggcat cagaatttct cgactag 2367
<210> 14
<211> 959
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<220>
<221> gene
<222> (1)..(959)
<223> MFS-transporter
<400> 14
ttgcatattt tgacggcgat gttcgtgctg attgcgttca tgttgggatg caatgagttt 60
atggtagtcg gaaatttgtc actgattgcg caaacttatc atgaatcgct gagtcagatt 120
tcttggttgg tatcggcgtt tgcatggact tatgcgatcg tgacaccgct cctggcttta 180
tttaccaata agattcacaa atactatttg ttgatttttt tgacgggaac aattttgagc 240
tcgtgtgcac caagtattgg ttggctgctt ttttcaagaa ttattacagc atcagtggca 300
ggaatgattg aatcactgct atcggtaatc gtttaccaga tattgcataa tcaaaaatag 360
cgctcggtga cgattgtctg gatttataca ggctttagca tcggttgtgg gtgtgccgct 420
gggaacggtc attgctgatc actggcgatg gcaggatgct ttcaccatgt gtgtggtaat 480
tacagcggtg gctacaatta ttgcgttgct agttttgcct aaaaacttga atgcaggtga 540
gggtaattat agcgatcgga ttcagatttt caaggataaa acaatctggt atgggatcgg 600
cttcgttatc tgtgcggcag ctaccttgta tggctattac acgtatatta gaccgctggt 660
tcatgtgcaa cttaagttcg atttgaatgc attgagtttg atttggctac tccttggtgt 720
ggtagctatt tttggctcga caacacaagt attatttttg aatgaagcat cgaaaaaata 780
tccggcagcg attagtttgg catcaacgtt aagtgcaatt ttttataatg tcggtatctt 840
caatgacagc aggacaagtt ttgaaatacg gtggtttaac tagtttgggc tggaattcat 900
ttgtttattg ctttgttttg gctagaaaac tagataatag aaatttgggg gataagtag 959
<210> 15
<211> 918
<212> DNA
<213> Lactobacillus helveticus
<220>
<221> gene
<222> (1)..(918)
<223> ACPS-malonyltransferase
<400> 15
ttatttcacc aactttgctt ttgatcgaaa atcgtttaac gtcttaacac tatcaatatg 60
gaatgtatga tcgttcgcca ccacattctt ggcaaacttc atcaacgtat cgccagggcc 120
cagttcaaca actgtatcaa cacccaattg agtaagctgt tgaatgcagt tataaaaatg 180
ggttggatta atgagctgat cgattaacgt ttgcttaatc gtgttaactt cgaaaggttg 240
agacgttgtg ttactgatca ctgggaaagc caactggtta aacgagacat cttgaattcg 300
ttttgccaac aaatcggagg cctcctgcat aaatggggtg tgagacgcaa ccgtcatttt 360
caacgggaca acccgtttaa caccgtgctc atgcagataa tcggtagctg cttgaagccc 420
ctcaatggaa ccaccaatca caatttgaga atctgtgttg taattggcta catagatctc 480
acccttcttc gaaccgactt ttaccgcttg gtcgaccatg tcagcagtcg tttttaagac 540
agccgccatt ttgccaggat gatcctgacc ggctttatcc atgtagtgac tgcgatcacg 600
aaccaattga agggcatcac tgaagtccaa tcccttggca gcgacaatcg cgctatactc 660
accaagactc aaaccagtgg caccaactgg atcaccaaaa tcttgattga taatccgttc 720
aatccctgta ctcatggcga caatcgccac ttgggtattg accggattat caaaaacggt 780
ggcatcgctc atatccatat tcaaagcttc ggaagcttga tcaattgttt gccgataaac 840
aggttcttgt tgatacaagt cctgtcccat tttgccaaat tgcttacctt ggccgctaaa 900
taaataacct agtttcaa 918
<210> 16
<211> 828
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Lactobacillus jensenii
<220>
<221> gene
<222> (1)..(828)
<223> Acetoacetate decarboxylase
<400> 16
atgactagtt atcttgttaa caaagaagat gttgtcaact ttcttgataa tcctaacatg 60
aaaaatcaag atggttatat gtttgcctac gtcacttcac cagaagtttt agctagatta 120
gtgcctaagc cattaacgcc tatcgcacca gtcatcgctg gttatattac ccatatgggc 180
aatccaactt ttgctaagcc ttatgatgaa gctgtcttat atagtttagt ttcatacggt 240
ggccgcatgc ttggcgctta tcctttcacc ctatttttaa gtggtgaagg agccgaagaa 300
gccatgcttg ctggtcgtga aggagctgca attccaaaga agttagctga taaaattagc 360
tacactgaaa aaaatggcag cacccatgtt gttgttacta gacatggtgt agatttaatt 420
aatcttacct ttactccagg tattcccaac gatcctgaca tcgctaaaca gttaatgggt 480
ggtcaatcta agcttgatac gccaaccgat acttatagtt ttttcttcga ctataagatt 540
gatcaagacc atgacggtca caaccacttc attaacactc gtttaattgc tactaagaca 600
acaggtgtca cccacgcatt cactccaggc aacattacaa tggaacttgg gacaagtagc 660
gatgatccag tcagcgaatt aaccgtatta aagccagttg gtggcgctca ctaccaaatg 720
actagtggca aaatgcacga aacaattcaa cttgcccaag ttgaaccaga tgaaatcgca 780
ccatatttaa ttactggccg ctatgaccaa gctattttag gaaagtaa 828
<210> 17
<211> 420
<212> DNA
<213> Lactobacillus crispatus
<220>
<221> gene
<222> (1)..(420)
<223> Hypothetical protein
<400> 17
atggcgaaga gacaccaata tctttggtgt ttggttgaat tgcctaacgg caaacgcgaa 60
tggtactgca tttctaaggt attgcgcaag gccttacttt gggagaaaaa ttatctgcat 120
aatcgatact ggcgcaatac tttaattggt agctacctca atgttgctcg cacgcgttat 180
catcatgatc gggcaattat tacagtagga agggtaatcc gagtgaaaat tttgtattat 240
cctactcagg attggcattg gacacgcaat caatttatcg cggcgggaca attggataac 300
tttgccaccg cctataatta tatgaagcac aattatgctt ggtacaacaa gctattgatt 360
catcatgcgt tacgtcattg gcgtagaata agcacttcta aacattgcaa taaattctaa 420
420
<210> 18
<211> 552
<212> DNA
<213> Lactobacillus gallinarum
<220>
<221> gene
<222> (1)..(552)
<223> Hypothetical protein
<400> 18
atgattctag agctttttat tttgttaaat tgtttaactc taaaggtatc atattataat 60
cttaaagaaa gagaccacat cattataagt aattctctta gcataatttc taaacatcac 120
caaggagtac catatctgaa gatgaaaact aaaataatat caataatact tttaatactc 180
atcgtcccac ctattctttt ctgtgtactt aattctagtt acgagttata cgttaatcat 240
caagaaaata ttgcatacag taaaatgcaa caagctgtag acaaacatgg ctataatgca 300
attagtcttg agcccgtaaa agctcgaata aaattctttc acatttatga atataaaagt 360
tcattttcta atcaaaaaac attgaataag aatagacaac tcttcaacaa agttggatat 420
aagataggca aacatgatga tctagaaacg ccttataaat attcaatcag tgccctaaaa 480
tcaaacgaaa aatggacagt ttatattaaa gaagaaccgt ttggcaaaga aaaaagttat 540
cgcgaagatt ga 552
Claims (7)
- 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는,
락토바실러스(Lactobacillus) 속 L. acidophilus 종(species) 미생물의 종-특이적 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 800bp 내지 850bp의 L. acidophilus 종 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 속 L. acidophilus 종 미생물의 종-특이적 검출용 프라이머 세트.
- 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는, 락토바실러스 속 L. acidophilus 종 미생물의 종-특이적 검출용 조성물.
- 제3항의 조성물을 포함하는 락토바실러스 속 L. acidophilus 종 미생물의 종-특이적 검출 키트.
- (a) 시료에서 락토바실러스 속 미생물 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 L. acidophilus 종 미생물의 종-특이적 검출 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 PCR을 수행하는 것은, 55℃ 내지 65℃ 범위 내의 온도에서 어닐링(annealing)을 수행하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 속 L. acidophilus 종 미생물의 종-특이적 검출 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 속 L. acidophilus 종 미생물의 종-특이적 검출 방법.
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| KR1020180153563A KR101943503B1 (ko) | 2018-12-03 | 2018-12-03 | 락토바실러스 속 진단용 종-특이적 프라이머 및 이의 용도 |
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| KR101943503B1 true KR101943503B1 (ko) | 2019-04-17 |
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| KR (1) | KR101943503B1 (ko) |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR101193410B1 (ko) * | 2003-02-28 | 2012-10-24 | 일동제약주식회사 | 락토바실러스 속 균종의 동정방법 |
| KR101485429B1 (ko) * | 2013-04-04 | 2015-02-03 | 다이아프로브 (주) | 여성의 질 건강 진단을 위한 정보제공 방법 및 진단용 키트 |
-
2018
- 2018-12-03 KR KR1020180153563A patent/KR101943503B1/ko active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101193410B1 (ko) * | 2003-02-28 | 2012-10-24 | 일동제약주식회사 | 락토바실러스 속 균종의 동정방법 |
| KR101485429B1 (ko) * | 2013-04-04 | 2015-02-03 | 다이아프로브 (주) | 여성의 질 건강 진단을 위한 정보제공 방법 및 진단용 키트 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FEMS Microbiol Lett.,239(2):267-75,2004 Oct 15 * |
| Marco Ventura et al., Applied and Environmental Microbiology, 68(12), p.6172-6181, 2002. * |
| Suja Senan, et.al. International Journal of Science & Technology,Volume 3, No 2, 123- 137, 2008 * |
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