KR102084217B1 - 중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 세균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트 - Google Patents

중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 세균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조시 쉽게 오염될 수 있는 세균을 검출할 수 있는 방법, 이 방법에 사용되는 프라이머 세트, 프라이머-프로브 세트, 및 이를 포함하는 세균의 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 새롭게 제작된 핵산증폭용 프라이머 세트 또는 프라이머-프로브 세트를 이용하면 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조, 보관 및 투여 시 쉽게 오염될 수 있는 세균을 신속하고 정확하며 재현성 있게 검출할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 핵산증폭방법 및 실시간 핵산증폭방법에 의하면 기존의 세포치료제의 무균시험법을 대체하여 경제적이면서 신속하고 정확한 세균의 검출방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 세균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트{Method for Detecting Bacteria Contaminated in Therapeutic Cells or Biological Medicine By Using Polymerase Chain Reaction and Real-time Polymerase Chain Reaction}
본 발명은 일반 중합효소연쇄반응 및 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 세균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트들에 관한 것이다.
최근에 배양세포(면역세포 및 줄기세포)를 이용한 세포 치료법의 개발 및 바이오 의약품(인슐린, 성장호르몬, 인터페론 및 항체의약품)을 이용한 치료법들이 개발되면서, 바이오의약품 및 세포치료제로서 배양된 면역세포, 줄기세포, 또는 동물세포의 병원성 미생물인 바이러스, 박테리아, 마이코플라즈마, 및 세균의 오염에 대한 신속한 균 검출법은 임상적용 전 환자의 2차 질병감염을 막기 위해 반드시 선행되어야 할 중요한 과정이다. 세균, 진균, 마이코플라즈마를 포함하는 기존의 미생물 검출법으로 잘 알려진 표준 무균시험법인 직접배양법은 미생물 오염판정에 긴 시간이 소요되며, 배양이 어려운 미생물에 대해서는 적합하지 못하다는 한계가 있다. 특히, 장기간의 시험 기간이 요구되어 통상 제조 후 48 시간 내에 사용되는 세포치료제에는 현실적으로 적용하기에 어려운 실정이다. 따라서 기존 직접배양법의 단점을 개선하여 고빈도 오염 미생물군과 병원성 미생물군을 효율적으로 신속 검출할 수 있는 대체법의 개발이 반드시 필요하다. 한편, 핵산을 증폭하는 기술 중 하나인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 분자진단법은 신속하면서 민감도가 높아 다양한 분자진단 제품개발을 위해 사용되고 있으며 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 미생물 검출법에도 적용되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
삭제
본 발명자들은 세포치료제로 이용되는 면역세포 또는 줄기세포 및 바이오 의약품을 생산하는 동물세포의 배양과정에서 배양 세포에 오염될 수 있는 병원성 세균(bacteria)를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 다양한 종의 세균을 단회의 핵산증폭과정을 통해 검출할 수 있는 PCR (polymerase chain reaction)용 프라이머 세트를 개발하였고, 이 프라이머 세트를 사용한 핵산증폭방법을 통해 다양한 병원성 세균의 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 핵산증폭방법을 이용하여 세포배양시 오염가능한 세균을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포배양시 오염가능한 세균을 검출하기 위한 핵산 증폭용 프라이머 세트 및 프라이머-프로브 세트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트 및 프라이머-프로브 세트를 유효성분으로 포함하는 세포배양시 오염가능한 세균 검출용 일반 핵산 증폭 키트 및 실시간 핵산 증폭 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 핵산증폭방법을 이용하여 세포배양시 오염가능한 세균을 검출하는 방법을 제공한다: (a) 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 DNA 및 프라이머세트를 사용하여 핵산증폭반응을 행하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계.
이하에서 본 발명의 방법을 단계별로 나누어 상세히 설명한다.
단계 (a): 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
삭제
본 발명의 검출 방법은 세균(bacteria)이 오염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 본 발명에서 검출 대상 시료는 바람직하게는 생물학적 시료이며, 보다 바람직하게는 바이오 의약품, 배양된 세포가 될 수 있다. 예컨대, 세포배양법과 같은 생물학적 방법에 의해 생산되는 바이오 의약품, 세포치료제로 사용되는 면역세포, 또는 줄기세포의 생산과정 또는 이들의 최종 생산물을 시료로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 세포 배양 전후의 배양액, 환자 투여를 위한 수액, 바이오 의약품의 생산과정에서 사용되는 원재료 및 최종 생산물이 시료가 될 수 있다.
상기 검출 대상인 세균으로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 예컨대, 본 발명에서 세균의 세포에서 지놈 DNA (genomic DNA, gDNA)는 페놀-클로로포름 추출 방법을 응용하여 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출 가능한 세균은 다음의 85종 세균으로부터 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세균이다:
아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스 (Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스 (Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아퍼멘탄스 (Corynebacterium afermentans), 코리네박테리움 암모니아제네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 제이케이움 (Corynebacterium jeikeium), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 크랩시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 비브리오 콜레라 0139 (Vibrio cholerae O139), 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라 (Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 레지오넬라 에스 피(Legionella sp), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에 (Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 렌티플라붐 (Mycobacterium lentiflavum), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스 (Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris), 스트렙토코커스 상귀니스 (Streptococcus sanguinis), 슈도모나스 플루오르슨스 (Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 티피무리엄 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스 (Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에 (Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우리쿨라리스 (Staphylococcus auricularis), 스타필로코커스 캐피티스 (Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에 (Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스 (Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니 (Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니 (Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸 (Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸 (Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스 (Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 스타필로코커스 인터메디우스 (Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시 (Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 루그두네시스 (Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코커스 파스테리 (Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 쉬레이페리 (Staphylococcus schleiferi), 스타필로코커스 시물란스 (Staphylococcus simulans), 스타필로코커스 워네리 (Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스 (Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스 (Streptococcus alactolyticus), 스트렙토코커스 콘스텔라투스 서브스페시스 콘스텔라투스 (Streptococcus constellatus subspecies. constellatus), 스트렙토코커스 크리세티 (Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 크리스타투스 (Streptococcus cristatus), 스트렙토코커스 다우네이 (Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스 (Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스 (Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니 (Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스 (Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스 (Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스 (Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스 (Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스 (Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스 (Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 아갈락티에 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스 (Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에 (Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 파라우베리스 (Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 판토에아 아글로머란스 (Pantoea agglomerans), 살로넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 슈도모나스 아우레지노사 (Pseudomonas aeruginosa).
단계 (b): 상기 추출된 DNA 및 프라이머 세트를 사용하여 핵산증폭반응을 행하는 단계
삭제
본 명세서에 사용되는 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)" 는 핵산의 증폭반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5' 말단 서열 및 3' 말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 세균 지놈 DNA 서열중에서 종(species) 보존적인 16S ribosomal RNA (rRNA)를 코딩하는 유전자 영역을 표적으로 하도록 디자인하였기 때문에 다양한 종류의 세균을 특이적으로 검출할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머세트는 세포배양 과정에서 고빈도로 오염될 수 있는 다양한 세균들의 군에서 보존된 16S rRNA 코딩 유전자 영역의 서열의 상동성에 기초하여 다양한 세균을 특이적으로 검출할 수 있도록 디자인된 프라이머세트이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 프라이머 내지 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 추가적으로 포함한다. 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머는 정상적인 중합효소연쇄반응 여부를 확인할 수 있는 내부 대조군용 프라이머 세트이다.
본 발명의 핵산 증폭반응에서 상기 단계 (a)에서 시료로부터 추출한 DNA가 반응의 주형 DNA로서 사용된다.
다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용가능한 DNA 중합효소는 적합한 처리에 의해 외래 DNA가 제거된 DNA-free 중합효소를 사용할 수 있으며, 또한, 핫-스타트(Hot-start) 기능을 갖는 핫-스타트 중합효소를 사용할 수 있다. 핫-스타트 중합효소는 고온 예컨대 95℃와 같은 고온에서 중합효소 활성을 갖는 효소로서, 프라이머와 중합효소 간의 저온에서의 반응을 억제하여 프라이머 다이머 형성을 차단함으로써 중합효소 증폭반응의 특이도를 향상시킨다.
본 발명에서 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물로서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 dUTP의 혼합물, PCR 완충액(buffer), DNA 중합 효소 조인자, 및 UDG (Uracill DNA Glycosylase)를 포함할 수 있다. 본 발명의 증폭반응의 dNTP 혼합물은 dTTP 및 dUTP을 포함하며, 이와 함께 UDG(Uracil DNA Glycosylase)가 포함된다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더 이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염(carry-over contamination)에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.
유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 적절량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 적절량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 dUTP를 충분한 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
단계 (c): 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계
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본 발명의 프라이머세트을 이용하여 증폭된 16S rRNA 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열의 증폭산물은 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 핵산 증폭 반응의 결과물을 아가로즈젤(agarose gel) 또는 모세관(capillary) 전기영동하고 그 결과 형성되는 밴드크기를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 핵산 산물의 병원성세균 감염여부를 결정한다. 보다 구체적으로, 핵산 증폭 산물을 표준마커와 함께 아가로스 젤 또는 모세관에서 전기영동하고 표준 마커를 기준으로 각 밴드를 비교 분석하여 병원성세균의 감염 또는 존재여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)을 이용하여 세포배양시 오염가능한 세균을 검출하는 방법을 제공한다: (a)′검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 (b)′상기 추출된 DNA, 프라이머세트 및 프로브세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계.
단계 (a)′: 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
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검출하고자 하는 시료로부터 DNA를 추출하는 단계 (a)′는 상기 핵산증폭방법을 이용한 방법의 단계 (a)에서 설명된 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.
단계 (b)′: 상기 추출된 DNA, 프라이머세트 및 프로브세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계
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본 발명의 단계 (b)′에서는 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 프라이머세트 및 프로브세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행한다. 프라이머에 대한 내용은 상기 핵산증폭방법을 이용한 방법의 단계 (a)에서 설명된 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 7의 프라이머 내지 서열번호 12의 프라이머를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는 내부대조군용 프라이머 세트를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 용어 "프로브(probe)" 는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브인 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging) 될 수 있다.
본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 프로브는 프라이머세트에 의해 증폭되는 염기서열 내부의 일부 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 사용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법에서 사용되는 프로브 세트는 서열번호 13의 프로브를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법에서 사용되는 프로브 세트는 서열번호 14의 염기서열을 갖는 내부대조군용 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법에 사용되는 프로브의 5'-말단에는 리포터-형광물질이 태깅(tagging)되어 있고, 3'-말단에는 형광억제물질(quencher)이 태깅되어 있다.
본 발명에서 리포터 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며 예를 들어, 리포터 형광물질은 6-FAM, JOY, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5, VIC, EDD, TAMRA 를 사용할 수 있으며, 형광억제물질은 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 또는 ROX를 사용할 수 있다.
본 발명의 프로브는 3'-말단에 존재하는 형광억제물질의 작용에 의해 5'-말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 핵산증폭반응의 다음 단계인 연장 단계(extension step)에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5'말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광억제물질에 의한 형광억제가 해제됨으로써 형광을 방출한다.
프로브의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 프라이머 혼성화 온도와 길이에 따라 변이가 있지만 전형적으로 20-35 뉴클레오타이드로 프라이머의 혼성화 온도보다 약 5-10℃ 정도 높은 혼성화 온도를 가지도록 설계하여 실시간중합효소 반응의 특이성을 높일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포배양시 오염가능 한 세균을 검출하기 위한 핵산 증폭용 프라이머세트로서, 서열번호 1의 프라이머 내지 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공한다.
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본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머세트는 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 추가로 포함한다. 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머는 정상적인 중합효소연쇄반응 여부를 확인할 수 있는 내부 대조군용 프라이머세트이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포배양시 오염가능한 세균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응용 프라이머 및 프로브세트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 7 내지 서열번호 12의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이고, 상기 프로브세트는 서열번호 13의 프로브를 포함하는 프로브 세트인 프라이머 및 프로브세트를 제공한다.
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본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프라이머 및 프로브세트는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트 및 서열번호 14의 프로브를 추가적으로 포함한다. 상기 서열번호 5, 6 및 14의 프라이머 및 프로브는 정상적인 실시간 중합효소연쇄반응 여부를 확인할 수 있는 내부 대조군용 프라이머 및 프로브이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 세포배양시 오염가능한 세균은 다음의 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세균이다: 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아퍼멘탄스(Corynebacterium afermentans), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 비브리오 콜레라 0139(Vibrio cholerae O139), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레지오넬라 에스 피(Legionella sp), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 렌티플라붐(Mycobacterium lentiflavum), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우리쿨라리스(Staphylococcus auricularis), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 루그두네시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 쉬레이페리(Staphylococcus schleiferi), 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus), 스트렙토코커스 콘스텔라투스 서브스페시스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus subspecies. constellatus), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 크리스타투스(Streptococcus cristatus), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스(Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans), 살로넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 슈도모나스 아우레지노사(Pseudomonas aeruginosa).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하는 세포 배양시 오염가능한 세균 검출용 핵산 증폭 키트를 제공한다.
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본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 프라이머 및 프로브 세트를 유효성분으로 포함하는 세포배양시 오염가능한 세균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트가 PCR 증폭 또는 실시간 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자, UDG 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
본 발명은 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조시 쉽게 오염될 수 있는 세균을 검출할 수 있는 방법, 이 방법에 사용되는 프라이머 세트, 프라이머-프로브세트 및 이를 포함하는 진균의 검출용 일반 핵산증폭 키트 또는 실시간 핵산증폭키트에 관한 것이다. 본 발명의 새롭게 제작된 핵산증폭용 프라이머세트 및 프라이머-프로브세트를 이용하면 세포치료제 및 생물학적 의약품의 제조, 보관 및 투여시 오염 가능한 다양한 병원성세균을 신속하고 정확하며 재현성 있게 검출할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 일반 핵산증폭 방법 및 실시간 핵산증폭방법에 의하면 기존의 세포치료제의 무균시험법을 대체하여 경제적이면서 신속하고 정확한 세균의 검출방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1a 및 도 1b는 표준검체를 사용하여 본 발명의 검출방법에 의해 다양한 세균을 검출한 결과를 보여준다.
도 1a는 병원성세균에 대해 중합효소연쇄반응을 이용하여 검출한 결과이며, 도 1b는 병원성 세균에 대해 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 검출한 결과이다.
도 1a의 결과에서 사용된 표준검체는 ATCC로부터 구입한 53종의 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 스트렙토코커스 스위스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 추출한 지놈 DNA(genomic DNA)를 사용하였다.
도 1b의 결과에서 사용된 표준검체는 ATCC로부터 구입한 표준검체 62종의 세균으로서, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 스트렙토코커스 스위스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus),스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스(Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 로부터 추출한 지놈 DNA(genomic DNA)를 사용하였다.
도 2a는 본 발명의 전통적인 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성 세균에 대해 검출 특이도를 측정한 결과이다. 본 발명의 프라이머세트를 사용한 중합효소증폭반응에서 검출목표균종인 병원성세균 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 균만이 검출되었으며, 음성검체는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
도 2b 및 도 2c는 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성 세균의 검출 특이도를 검사한 결과이다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응에서 검출목표균주인 병원성세균 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)와 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus) 균만이 검출되었으며, 음성검체는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다.
도 3a 내지 도 3e는 본 발명의 전통적인 중합효소연쇄반응 및 실시간 중합효소연쇄반응 키트를 사용하여 병원성 세균의 검출 민감도를 측정한 결과이다.
도 3a 및 도 3b의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 병원성 세균 전통적 방법의 핵산증폭 검출 키트는 병원성 세균 종에 따라 약 5.5x101 - 5.5x103 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다.
또한, 도 3c 및 도 3d의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시간핵산증폭 검출 키트는 병원성진균 종에 따라 약 8.2x101 - 2.4x104 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 실험에 사용한 세균 균주
삭제
하기 표 1 - 표 3에는 본 발명의 방법의 검출대상 세균으로서 세포치료제와 생물학적 의약품 제조시 높은 빈도로 오염되는 세균의 목록을 나타내었다.
Figure 112013067071414-pat00001
Figure 112013067071414-pat00002
본 발명에서 사용한 검출목표유전자 16S rRNA 합성 세균 균주 10종
균주 ATCC number 합성처
1 Acinetobacter sp. 21288

GeneScript Co. LTD. USA
2 Chlamydophila pneumoniae 53592D
3 Corynebacterium afermentans 51403
4 Enterobacter agglomerans 53769
5 Staphylococcus hominis 700564
6 Staphylococcus lugdunensis 49576
7 Staphylococcus schleiferi 49545
8 Staphylococcus simulans 11631
9 Streptococcus agalactiae 55191
10 Streptococcus cristatus 51100
실시예 2 : 세균 검출용 프라이머 및 프로브의 설계
상기 실시예 1에 나타낸 검출대상 세균을 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머세트를 디자인하였다. 검출 목표로 선정된 85종 병원성 세균의 16S rRNA 유전자를 대상으로 BioEdit Sequence Alignment Editor 프로그램(Ver7.1.11, Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.)을 이용하여 다중 염기서열 정렬을 통해 유전자 염기서열의 유사성을 비교분석하여 검출 목표균 종내에서 유사성이 가장 높은 공통 염기서열을 포함한 부위를 대상으로 프라이머 위치로 선정하였다. 또한 선정된 대상 염기서열부위에서 일부 염기서열부위의 염기가 일치하지 않은 경우, 검출 특이도를 높이기 위해 각각의 대상 프라이머를 추가하여 프라이머 세트를 구성하였다. 본 발명에서 전통적인 일반 핵산 증폭법에 기초한 검출법의 경우, 최종적으로 3종의 전방향(forward) 프라이머와 1종의 역방향(reverse) 프라이머를 선정하였다. 추가로 중합효소 연쇄반응의 양성반응 확인을 위해 PCRC 프라이머를 추가하였으며, PCRC 프라이머는 시금치(Spinacia oleracea)의 psbA 유전자를 증폭할 수 있도록 설계하여 병원성 세균 음성 검체에서 중합효소연쇄반응이 정확히 반응하였음을 확인할 수 있도록 디자인하였다. 아래 표 4에는 본 발명에서 사용되는 세균의 검출용 프라이머들의 염기서열을 나타내었다.
프라이머 명칭 염기서열 서열번호 Mer (bp) %GC Tm (℃)
Bac-16s-F3 CGCACGGGTGAGTAACACG 1 19 63 62
Bac-16s-F3_2 GGGTGAGTAATGTATGGGGAT 2 21 47 62
Bac-16s-F3_3 GCAAGTCGAGCGGTAGCACA 3 20 60 64
Bac-16s-R2-2 GTATCTAATCCTGTTTGCTCCC 4 22 45 64
PCR IC F CGAATACACCAGCTACACCTAA 5 22 45.4 64
PCR IC R TACAATGGTGGTCCTTATGAACT 6 23 39.1 64
본 발명에서 실시간(real-time) PCR법에 기초한 검출법의 경우, 상기와 동일한 방법으로 최종적으로 5종의 전방향(forward) 프라이머, 1종의 역방향(reverse) 프라이머 및 1종의 프로브를 선정하였다. 프로브의 3′말단부위의 형광물질의 선정은 실시간 PCR법에서 가장 많이 사용되고 있는 FAM 형광물질을 선정하였으며, FAM 형광물질의 발광을 억제하는 BHQ1 을 3′말단부위에 표지하였다. 추가로 실시간 중합효소연쇄반응의 양성반응 확인을 위해 PCRC 프라이머 세트 및 1종 프로브를 추가하였으며, PCRC 프라이머는 시금치의 psbA 유전자를 증폭할 수 있도록 설계하여 병원성세균 음성검체에서 실시간 중합효소연쇄반응이 정확히 반응하였음을 확인할 수 있도록 디자인하였다. 아래 표 5에는 병원성 세균 검출용 프라이머 및 프로브의 염기서열을 표기하였다.
Figure 112013067071414-pat00003
실시예 3 : 본 발명의 프라이머세트를 사용한 세균의 검출
3-1. 시료의 제조
상기 실시예 2에서 제작한 세균 검출용 프라이머 세트를 사용하여 세균의 검출 특이도를 검사하였다. 먼저, 외부표준검체 분양기관 (ATCC 및 KCTC)로부터 구입한 62종의 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 스트렙토코커스 스위스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Sphingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus),스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스(Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 의 균주로부터 지놈 DNA를 추출하였다. 지놈 DNA의 추출은 SolgentTM Genomic DNA Prep Kit (Cat.No. SGD41-C100, Solgent, Korea)를 사용하여 키트에 포함된 설명서의 내용에 따라 행하였다. 추출된 지놈 DNA는 UV 분광기로 농도(10-100 pg의 범위)를 측정하고, 순도는 A260/A280 비율(≥ 1.8)을 측정한 후에 사용하였다.
3-2. 표준 마커(standard marker)의 제조
본 발명의 일반 핵산증폭용 제품의 경우, 젤 전기영동시에 사용하는 750 bp 및 301 bp 크기의 표준마커는 Lentinula plasmid DNA 사용하여 제작하였다. Lentinula plasmid DNA가 형질전환된 E.coli DH5α를 액체 배지내에서 배양하고, 배양세포를 회수하여 플라스미드 DNA를 추출하였다(SolGent Plasmid mini-prep kit [SPM01-C050, C100]). 추출한 플라스미드 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 표준마커를 증폭하여 제작하였다. 표준마커 제작에 사용한 프라이머는 다음과 같았다: [Bacteria SM F 750: GTTTGAAAATCTTTTTAACTTCAAAG (서열번호 15), SM R1: GAATGCTGCGACTACGATCTG (서열번호 16), 증폭크기 750bp], [SM-301bp-F: GTTTGAAAATCTTTTTAACTTCAAAG (서열번호 17), SM R2: CATAGAGAGGCTAACAGATTCA (서열번호 18)]. 표준마커 생성용 PCR 혼합물의 조성은 및 반응조건은 아래 표 6 및 표 7에 나타내었다.
PCR 반응성분 부피(㎕)
SolgTM 2x multiplex PCR Smart mix (CatNo.SMP01-MB50k) 25
Primer (Forward) 10 pmole 2
Primer (Reverse) 10 pmole 2
Lentinula edodes plasmid DNA (2.5 ng/㎕) 2
Nuclease free Water 19
Total 50
온도 시간 사이클
95℃ 15 min 1
95℃ 30 sec 35
60℃ 30 sec
72℃ 1 min
72℃ 5 min 1
4℃ ∞
3-3. 양성대조군 (positive control) 주형의 제조
본 발명의 일반 PCR과 실시간(Real-Time) PCR 모두에서 양성대조군으로 사용할 주형(template) DNA는 세균(Bacteria Species) 유전자 16S ribosomal RNA 유전자 및 1 종의 Spinacia oleracea의 psbA를 증폭한 후 증폭 산물을 T vector에 클로닝하여 이를 양성대조군 주형으로 사용하였다.
3-4. 중합효소연쇄반응
PCR의 반응액은 다음의 성분 비율로 제조하였다: 2X Multiplex PCR Smart mix (with UDG) 12.5 ㎕, 프라이머 혼합물 2 ㎕에 Nuclease free Water 및 DNA 주형시료를 첨가하여 총 반응액 부피를 25 ㎕로 맞추었다. PCR 반응은 다음의 조건으로 실시하였다. UDG 반응은 50℃에서 3분의 1 사이클, 초기 PCR 활성화는 95℃에서 15분의 1 사이클, 95℃에서 20초의 변성(denaturation), 56℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 40초의 연장(extension)으로 구성되는 사이클을 35사이클, 및 최종 연장(extension) 반응은 72℃에서 5 분간 행하였다. 상기 반응조건에 따라 PCR을 통해 핵산을 증폭한 후 증폭산물을 3％의 아가로스 젤상에서 전기영동하여 표준 마커를 기준으로 하여 목표로 하는 검출 유전자의 증폭 유무를 확인하였다. 본 발명에서 사용한 반응액 중 2X Multiplex PCR Smart mix (with UDG)의 조성은 아래 표 8에 나타내었다.
Figure 112013067071414-pat00004

53종의 병원성 세균으로부터 추출한 지놈 DNA에 대해 PCR 반응을 실시한 결과는 도 1a에 나타내었다. 도 1a의 결과로부터 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR 방법을 통해 다양한 종류의 병원성 세균을 동시에 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
3-5. 실시간중합효소연쇄반응
실시간(Real-Time) PCR의 반응액은 다음의 성분 비율로 제조하였다: 2X Multiplex PCR Smart mix (with UDG) 12.5 ㎕, 프라이머 혼합물 2 ㎕에 Nuclease free Water 및 DNA 주형시료를 첨가하여 총 반응액 부피를 25 ㎕로 맞추었다. 실시간 PCR은 다음의 조건으로 실시하였다. UDG 반응은 50℃에서 3분의 1 사이클, 초기 PCR 활성화는 95℃에서 15분의 1 사이클, 95℃에서 20초의 변성(denaturation), 60℃에서 40초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 40초의 연장(extension)으 로 구성되는 사이클을 40사이클로 행하였다. 실시간 PCR의 증폭여부는 사용장비(ABI7500 또는 CFX96)에서 제공하는 각 프로그램을 사용하여 목표로 하는 검출 유전자의 증폭 유무를 확인하였다. 본 발명에서 사용한 반응액 중 2X Multiplex PCR Smart mix (with UDG)의 조성은 아래 표 9에 나타내었다.
Figure 112013067071414-pat00005

62개종의 병원성 세균으로부터 추출한 지놈 DNA에 대해 실시간 중합효소연쇄 반응을 실시한 결과는 도 1b에 나타내었다. 도 1b의 결과로부터 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응법을 사용하여 다양한 종류의 병원성세균을 동시에 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4 : 본 발명의 병원성 세균 검출 키트의 검출 특이도 및 민감도
4-1. 검출특이도
본 발명에서 제작한 병원성 세균 일반 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성 세균의 검출 특이도를 검사하였다. 특이도 검사에서 음성검체로는 human gDNA 및 0-14일간 배양된 면역세포를 사용하였으며, 양성검체로는 병원성 세균 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 사용하였다. 이들 양성검체(균) 및 음성검체(균)을 이용한 특이도 검사의 결과는 도 2a에 나타내었다. 도 2a의 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 중합효소증폭반응에서 검출 목표 균종인 병원성 세균 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 균만이 특이적으로 검출되었으며, 음성검체(균)은 검출되지 않았다.
본 발명의 병원성 세균 실시간 중합효소연쇄반응 검출 키트를 사용하여 병원성 세균의 검출 특이도를 검사하였다. 실시간 중합효소연쇄반응의 특이도 검사에서 음성검체로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 인간(human), 생쥐(mouse), CHO 세포의 gDNA를 사용하였으며, 양성검체로는 병원성 세균 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)와 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus)를 사용하였다. 상기 음성검체 및 양성검체를 사용하여 행한 특이도 검사의 결과는 도 2b에 나타내었다. 도 2b의 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머-프로브 세트를 사용한 실시간 중합효소증폭반응에서 검출 목표 균종인 병원성 세균 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)와 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus)균만을 검출되었으며, 음성검체(균)은 검출되지 않았다.
4-2. 검출민감도
본 발명에서 제작한 병원성 세균 검출키트를 사용하여 병원성 세균의 검출 민감도를 검사하였다. 검출 민감도는 양성검체로서 다양한 병원성 세균의 양성검체(균)을 사용하여 측정하였다. 본 발명의 일반 중합효소연쇄반응 키트를 사용한 검출 민감도 측정 결과는 도 3a 및 도 3b에 나타내었고, 실시간 중합효소연쇄반응 키트를 사용한 검출 민감도 측정 결과는 도 3c 및 도 3d에 나타내었다. 도 3a 및 도 3b의 결과로부터 본 발명의 병원성 세균 일반 핵산증폭 검출 키트는 병원성 세균 종에 따라 약 5.5x103 - 5.5x101 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다. 또한, 도 3c 및 도 3d의 결과로부터 본 발명의 실시간핵산증폭 검출 키트는 병원성 세균 종에 따라 약 8.2x101 - 2.4x104 카피까지 검출민감도를 가짐을 확인하였다.
4-3. 세균 검출 가능종 확인
본 발명에서 제작한 병원성 세균 검출 키트를 사용하여 검출 가능한 세균종의 검출 가능성을 조사하였다. 검출 가능종의 확인은 검출 목표로 선정된 85종 세균의 16S 유전자를 대상으로 NCBI(National Center for Biotechnology Information, )로부터 수집한 후, BioEdit Sequence Alignment Editor 프로그램을 이용하여 다중 염기서열 정렬을 통해 유전자 염기서열의 유사성을 비교 분석하여 검출 가능성을 확인하였다. 이중 선정 프라이머 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열과 최소 80％이상의 유사성을 보이는 세균 균주 75종을 선택하였고, 일반 핵산증폭방법을 이용한 경우의 각 프라이머 조합 및 각 프라이머와의 결합 가능한 검출부위의 염기서열의 매칭율(matching rate)를 표 10에 표기 하였다. 실시간 핵산증폭방법을 이용한 경우의 각 프라이머/프로브 조합 및 각 프라이머/프로브와의 결합 가능한 23종의 검출부위 염기서열의 매칭율(matching rate)를 표 11에 표기하였다.
　 Strains Forward primer /matching rate Reverse primer /matching rate Detection
size (bp)
1 Bacillus cereus F3/94.7% R2-2/100% 701
2 Bacillus subtilis F3/94.7% R2-2/95.5% 704
3 Bacteroides vulgatus F3/100% R2-2/90.9% 688
4 Campylobacter jejuni F3/78.9% R2-2/100% 666
5 Citrobacter freundii F3_3/95.0% R2-2/100% 739
6 Corynebacterium accolens F3/94.7% R2-2/90.9% 672
7 Corynebacterium ammoniagen F3/94.7% R2-2/90.9% 678
8 Corynebacterium diphtheria F3/94.7% R2-2/90.9% 673
9 Corynebacterium glutamicum F3/94.7% R2-2/90.9% 673
10 Corynebacterium jeikeium F3/78.9% R2-2/100% 666
11 Enterobacter aerogenes F3/95.0% R2-2/100% 737
12 Enterobacter cloacae F3_3/95.0% R2-2/100% 740
13 Enterococcus faecalis F3/94.7% R2-2/100% 702
14 Haemophilus influenzae F3_2/85.7% R2-2/100% 685
15 Klebsiella oxytoca F3_3/95.0% R2-2/100% 737
16 Klebsiella planticola F3_3/100% R2-2/100% 738
17 Klebsiella pneumoniae F3_3/100% R2-2/100% 737
18 Legionella pneumophila F3/89.5% R2-2/100% 690
19 Legionella sp F3/89.5% R2-2/100% 690
20 Mycobacterium avium F3/94.7% R2-2/95.5% 684
21 Mycobacterium bovis F3/94.7% R2-2/95.5% 686
22 Mycobacterium gordonae F3/94.7% R2-2/95.5% 684
23 Mycobacterium kansasii F3/94.7% R2-2/95.5% 684
24 Mycobacterium lentiflavum F3/94.7% R2-2/95.5% 672
25 Mycobacterium tuberculosis F3/94.7% R2-2/95.5% 686
26 Propionibacterium acnes F3/94.7% R2-2/90.9% 672
27 Proteus mirabilis F3_2/100% R2-2/100% 685
28 Proteus vulgaris F3_2/100% R2-2/100% 686
29 Pseudomonas aeruginosa F3_2/81.0% R2-2/100% 685
30 Pseudomonas fluorescens F3_2/81.0% R2-2/100% 685
31 Salmonella enterica F3_2/85.7% R2-2/100% 685
32 Salmonella typhimurium F3_2/81.0% R2-2/100% 685
33 Serratia marcescens F3_3/95.0% R2-2/100% 740
34 Sphingomonas paucimobilis F3/89.5% R2-2/100% 651
35 Staphylococcus aureus F3/94.7% R2-2/95.5% 699
36 Staphylococcus auricularis F3/94.7% R2-2/95.5% 699
37 Staphylococcus arlettae F3/94.7% R2-2/95.5% 699
38 Staphylococcus caprae F3/94.7% R2-2/95.5% 701
39 Staphylococcus capitis F3/94.7% R2-2/95.5% 699
40 Staphylococcus chromogenes F3/94.7% R2-2/95.5% 699
41 Staphylococcus cohnii F3/94.7% R2-2/95.5% 699
42 Staphylococcus delphini F3/94.7% R2-2/95.5% 699
43 Staphylococcus equorum F3/94.7% R2-2/95.5% 699
44 Staphylococcus epidermidis F3/94.7% R2-2/95.5% 698
45 Staphylococcus gallinarum F3/94.7% R2-2/95.5% 699
46 Staphylococcus haemolyticus F3/94.7% R2-2/95.5% 698
47 Staphylococcus intermedius F3/94.7% R2-2/95.5% 699
48 Staphylococcus kloosii F3/94.7% R2-2/95.5% 699
49 Staphylococcus pasteuri F3/94.7% R2-2/95.5% 699
50 Staphylococcus warneri F3/94.7% R2-2/95.5% 699
51 Staphylococcus xylosus F3/94.7% R2-2/95.5% 699
52 Stenotrophomonas maltophilia F3_3/90.0% R2-2/100% 741
53 Streptococcus alactolyticus F3/89.5% R2-2/100% 698
54 Streptococcus anginosus F3/89.5% R2-2/95.5% 698
55 Streptococcus constellatus F3/89.5% R2-2/95.5% 698
56 Streptococcus criceti F3/89.5% R2-2/90.9% 698
57 Streptococcus downei F3/89.5% R2-2/90.9% 698
58 Streptococcus ferus F3/89.5% R2-2/90.9% 698
59 Streptococcus gallinaceus F3/89.5% R2-2/95.5% 698
60 Streptococcus gordonii F3/89.5% R2-2/100% 698
61 Streptococcus hyointestinalis F3/89.5% R2-2/100% 698
62 Streptococcus intermedius F3/89.5% R2-2/95.5% 698
63 Streptococcus lutetiensis F3/89.5% R2-2/100% 698
64 Streptococcus macacae F3/89.5% R2-2/90.9% 698
65 Streptococcus mitis F3/89.5% R2-2/100% 694
66 Streptococcus mutans F3/89.5% R2-2/90.9% 698
67 Streptococcus oralis F3/89.5% R2-2/100% 698
68 Streptococcus pneumoniae F3/89.5% R2-2/100% 698
69 Streptococcus parasanguinis F3/89.5% R2-2/100% 698
70 Streptococcus pyogenes F3/89.5% R2-2/100% 698
71 Streptococcus parauberis F3/89.5% R2-2/100% 698
72 Streptococcus sanguinis F3/89.5% R2-2/100% 698
73 Streptococcus suis F3/89.5% R2-2/90.9% 698
74 Streptococcus vestibularis F3/89.5% R2-2/95.5% 697
75 Vibrio cholerae F3/95.0% R2-2/100% 739
Strains Forward primer /matching rate Reverse primer /matching rate Detection
size (bp)
1 Acinetobacter baumannii F3/86.3% R/100% 674
2 Chlamydophila pneumoniae F4/100% R/95% 674
3 Corynebacterium afermentan F2/100% R/95% 657
4 Corynebacterium jeikeium F2/100% R/95% 662
5 Haemophilus influenzae F3/91.3% R/100% 671
6 Legionella pneumophila F3/83.8% R/100% 674
7 Legionella sp F3/91.3% R/100% 674
8 Mycobacterium lentiflavum F2/100% R/95% 655
9 Pantoea agglomerans F3/96.3% R/100% 673
10 Pseudomonas fluorescens F3/91.3% R/100% 673
11 Salmonella enterica F3/96.3% R/100% 673
12 Salmonella typhimurium F3/96.3% R/100% 673
13 Staphylococcus auricularis F1/97.5% R/100% 674
14 Staphylococcus hominis F1/97.5% R/100% 674
15 Staphylococcus lugdunensis F1/97.5% R/100% 674
16 Staphylococcus schleiferi F1/97.5% R/100% 674
17 Staphylococcus simulans F1/97.5% R/100% 674
18 Streptococcus agalactiae F1/92.5% R/100% 674
19 Streptococcus cristatus F1/92.5% R/100% 674
20 Streptococcus constellatus F1/92.5% R/100% 675
21 Streptococcus mutans F1/92.5% R/100% 674
22 Streptococcus sanguinis F1/92.5% R/100% 670
23 Vibrio cholerae F3/96.3% R/100% 673

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Solgent Co., Ltd. <120> Method for Detecting Bacteria Contaminated in Therapeutic Cells or Biological Medicine By Using Polymerase Chain Reaction and Real-time Polymerase Chain Reaction <130> PN130289 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 cgcacgggtg agtaacacg 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 gggtgagtaa tgtatgggga t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gcaagtcgag cggtagcaca 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 gtatctaatc ctgtttgctc cc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 cgaatacacc agctacacct aa 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 tacaatggtg gtccttatga act 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gatrcgtagc cgacctgaga 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 acgggtagcc ggcctgaga 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 gatccntagc tggtctgaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 gacgtctagg cggattgaga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 gatggatagg ggttctgaga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 cacatgctcc accgcttgtg 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 13 ccagactcct acgggaggca gcagt 25 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 14 gtgaaatggg tgcataagga tgttgt 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 gtttgaaaat ctttttaact tcaaag 26 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 gaatgctgcg actacgatct g 21 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 gtttgaaaat ctttttaact tcaaag 26 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 catagagagg ctaacagatt ca 22

Claims (15)

  1. 다음의 단계를 포함하는 핵산증폭방법을 이용하여 세포 배양시 오염가능한 세균을 검출하는 방법:
    (a) 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 DNA 및 서열번호 1의 프라이머 내지 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 핵산증폭반응을 행하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세균은 다음의 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법:
    아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아퍼멘탄스(Corynebacterium afermentans), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 비브리오 콜레라 0139(Vibrio cholerae O139), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레지오넬라 에스 피(Legionella sp), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 렌티플라붐(Mycobacterium lentiflavum), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우리쿨라리스(Staphylococcus auricularis), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 루그두네시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 쉬레이페리(Staphylococcus schleiferi), 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus), 스트렙토코커스 콘스텔라투스 서브스페시스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus subspecies. constellatus), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 크리스타투스(Streptococcus cristatus), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스(Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans), 살로넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 슈도모나스 아우레지노사(Pseudomonas aeruginosa).
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 핵산증폭반응은 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응 (real time polymerase chain reaction)을 이용하여 세포배양시 오염가능한 세균을 검출하는 방법:
    (a) 검출하고자 하는 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; 및
    (b) 상기 추출된 DNA, 서열번호 7의 프라이머 내지 서열번호 12의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 13의 프로브를 포함하는 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세균은 다음의 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법:
    아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아퍼멘탄스(Corynebacterium afermentans), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 비브리오 콜레라 0139(Vibrio cholerae O139), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레지오넬라 에스 피(Legionella sp), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 렌티플라붐(Mycobacterium lentiflavum), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우리쿨라리스(Staphylococcus auricularis), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 루그두네시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 쉬레이페리(Staphylococcus schleiferi), 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus), 스트렙토코커스 콘스텔라투스 서브스페시스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus subspecies. constellatus), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 크리스타투스(Streptococcus cristatus), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스(Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans), 살로넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 슈도모나스 아우레지노사(Pseudomonas aeruginosa).
  7. 삭제
  8. 세포 배양시 오염가능한 세균을 검출하기 위한 핵산 증폭용 프라이머 세트로서, 서열번호 1의 프라이머 내지 서열번호 4의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
  9. 세포 배양시 오염가능한 세균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응 (real time polymerase chain reaction)용 프라이머 및 프로브 세트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 7의 프라이머 내지 서열번호 12의 프라이머를 포함하고, 상기 프로브세트는 서열번호 13의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트.
  10. 제8항에 있어서, 상기 세균은 다음의 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트:
    아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아퍼멘탄스(Corynebacterium afermentans), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 비브리오 콜레라 0139(Vibrio cholerae O139), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레지오넬라 에스 피(Legionella sp), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 렌티플라붐(Mycobacterium lentiflavum), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우리쿨라리스(Staphylococcus auricularis), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 루그두네시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 쉬레이페리(Staphylococcus schleiferi), 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus), 스트렙토코커스 콘스텔라투스 서브스페시스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus subspecies. constellatus), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 크리스타투스(Streptococcus cristatus), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스(Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans), 살로넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 슈도모나스 아우레지노사(Pseudomonas aeruginosa).
  11. 제8항의 프라이머 세트를 유효성분으로 포함하는 세포 배양시 오염가능한 세균 검출용 핵산증폭 키트.
  12. 제9항의 프라이머 및 프로브 세트를 유효성분으로 포함하는 세포 배양시 오염가능한 세균을 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응 (real time polymerase chain reaction)용 키트.
  13. 제11항에 있어서, 상기 키트는 핫-스타트(hot-start) 기능을 갖는 핵산중합효소 또는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP로 이루어지는 dNTP 혼합물, 및 UDG (Uracil DNA Glycosylase)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제9항에 있어서, 상기 세균은 다음의 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트:
    아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroides vulgatus), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 코리네박테리움 아코렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아퍼멘탄스(Corynebacterium afermentans), 코리네박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 제이케이움(Corynebacterium jeikeium), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크랩시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 비브리오 콜레라 0139(Vibrio cholerae O139), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레지오넬라 에스 피(Legionella sp), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 렌티플라붐(Mycobacterium lentiflavum), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 티피무리엄(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스핑고모나스 파우시모비리스(Spingomonas paucimobilis), 스타필로코커스 아르레타에(Staphylococcus arlettae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우리쿨라리스(Staphylococcus auricularis), 스타필로코커스 캐피티스(Staphylococcus capitis), 스타필로코커스 카프라에(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 크로모게네스(Staphylococcus chromogenes), 스타필로코커스 코흐니(Staphylococcus cohnii), 스타필로코커스 델피니(Staphylococcus delphini), 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 에쿠오룸(Staphylococcus equorum), 스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), 스타필로코커스 인터메디우스(Staphylococcus intermedius), 스타필로코커스 클루시(Staphylococcus kloosii), 스타필로코커스 루그두네시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코커스 파스테리(Staphylococcus pasteuri), 스타필로코커스 쉬레이페리(Staphylococcus schleiferi), 스타필로코커스 시물란스(Staphylococcus simulans), 스타필로코커스 워네리(Staphylococcus warneri), 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 아락토리티쿠스(Streptococcus alactolyticus), 스트렙토코커스 콘스텔라투스 서브스페시스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus subspecies. constellatus), 스트렙토코커스 크리세티(Streptococcus criceti), 스트렙토코커스 크리스타투스(Streptococcus cristatus), 스트렙토코커스 다우네이(Streptococcus downei), 스트렙토코커스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코커스 갈리나세우스(Streptococcus gallinaceus), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 히오인테스티날리스(Streptococcus hyointestinalis), 스트렙토코커스 인터메디우스(Streptococcus intermedius), 스트렙토코커스 루테티엔시스(Streptococcus lutetiensis), 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코커스 파라상귀니스(Streptococcus parasanguinis), 스트렙토코커스 베스티불라리스(Streptococcus vestibularis), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 마카시에(Streptococcus macacae), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 판토에아 아글로머란스(Pantoea agglomerans), 살로넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 슈도모나스 아우레지노사(Pseudomonas aeruginosa).
  15. 제12항에 있어서, 상기 키트는 핫-스타트(hot-start) 기능을 갖는 핵산중합효소 또는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP로 이루어지는 dNTP 혼합물, 및 UDG (Uracil DNA Glycosylase)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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