CN110607379A - 同时检测多种细菌及支原体的多重pcr检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种同时检测多种细菌及支原体的引物探针组合。本发明还提供了一种同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测方法，应用该方法能同时检测多种细菌及支原体，实现多重检测，灵敏度高，快捷方便，可实现对样本进行批量检测。本发明还提供了一种同时检测多种细菌及支原体的试剂盒及其应用。解决了临床上常见易感染的病原微生物检测的诸多技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种同时检测多种细菌及支原体的多重PCR 检测方法及其应用。
背景技术
目前临床上检测细菌常用的方法有细菌培养、PCR法、一代测序和二代测序法。细菌培养是临床上检测细菌的金标准，但该方法需要进行药敏实验，通常需要1-3天才能得到最终检测结果，且不能同时处理批量样本。故该方法检测成本高，周期长，操作繁琐，难以满足临床需求。PCR法可在短时间内使的定的核酸序列拷贝数几何级增加，其灵敏度和特异性高，但其检测的假阳性率也很高，易受样品中其它成分的干扰出现假阴性。一代测序法检测细菌时间长，且低拷贝的细菌检测不到。尽管二代测序检测在诊断罕见病原体方面展现了优于传统方法的巨大实力，但对于常见的结核分枝杆菌、隐球菌等病原体，其灵敏度并不强于传统方法。对于这些常见病原体，经常是传统方法检测不到，二代测序也检测不到；而即使传统方法检测到这些病原体，二代测序仍然可能检测不到或只检测到极少量特异的片段，难以确定其准确性，且成本高，周期长。
鉴于上述描述，亟待有灵敏度高，特异性好，实验操作简单，且耗时短的同时检测多种细菌及支原体的检测方法出现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测多种细菌及支原体的引物探针组合。
本发明的目的之二在于提供一种同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测方法，应用该方法能同时检测18种病原微生物，实现多重检测，灵敏度高，快捷方便，可实现对样本进行批量检测。
本发明的目的之三在于提供一种同时检测多种细菌及支原体的试剂盒及其应用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种同时检测多种细菌及支原体的引物探针组合，所述引物探针组合包括：
1)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对1和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的探针1；
2)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对2和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的探针2；
3)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对3和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的探针3；
4)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对4和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的探针4；
5)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物对5和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的探针5；
6)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物对6和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的探针6；
7)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物对7和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的探针7；
8)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的引物对8和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的探针8；
9)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的引物对9和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示的探针9；
10)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的引物对10 和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的探针10；
11)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的引物对11 和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的探针11；
12)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的引物对12 和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示的探针12；
13)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的引物对13 和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示的探针13；
14)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的引物对14 和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示的探针14；
15)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的引物对15 和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示的探针15；
16)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的引物对16 和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的探针16；
17)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的引物对17 序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的探针17；
18)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的引物对18 序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的探针18。
其中，
引物对1用于扩增鲍曼不动杆菌，探针1用于实时监测引物对1的扩增结果；
引物对2用于扩增奇异变形菌，探针2用于实时监测引物对2的扩增结果；
引物对3用于扩增表皮葡萄球菌，探针3用于实时监测引物对3的扩增结果；
引物对4用于扩增肺炎链球菌，探针4用于实时监测引物对4的扩增结果；
引物对5用于扩增粪肠球菌，探针5用于实时监测引物对5的扩增结果；
引物对6用于扩增嗜麦芽假单胞菌，探针6用于实时监测引物对6的扩增结果；
引物对7用于扩增铜绿假单胞菌，探针7用于实时监测引物对7的扩增结果；
引物对8用于扩增洋葱假单胞菌，探针8用于实时监测引物对8的扩增结果；
引物对9用于扩增大肠埃希菌，探针9用于实时监测引物对9的扩增结果；
引物对10用于扩增脑膜炎奈瑟菌，探针10用于实时监测引物对10的扩增结果；
引物对11用于扩增肺炎克雷伯菌，探针11用于实时监测引物对11的扩增结果；
引物对12用于扩增人葡萄球菌，探针12用于实时监测引物对12的扩增结果；
引物对13用于扩增嗜肺军团菌，探针13用于实时监测引物对13的扩增结果；
引物对14用于扩增金黄色葡萄球菌，探针14用于实时监测引物对14的扩增结果；
引物对15用于扩增流感嗜血杆菌，探针15用于实时监测引物对15的扩增结果；
引物对16用于扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，探针16用于实时监测引物对16的扩增结果；
引物对17用于扩增流感嗜血杆菌，探针17用于实时监测引物对17的扩增结果；
引物对18用于扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，探针18用于实时监测引物对18的扩增结果。
优选的是，所述探针的5’端标记有荧光报告基团FAM、JOE、ROX或Cy5中的任一种；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1或BHQ2。
一种同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
配制含有引物探针组合及待检测样品的反应体系并进行PCR扩增反应；以及根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。
扩增曲线图为根据PCR扩增反应结果绘制。
优选的是，所述反应体系为20uL，具体包括：待检测样品2uL、2×PCR buffer10uL、Taq酶0.5uL、引物探针组合的混合液2uL、补DEPC水至20uL；其中，引物对在扩增体系中的终浓度为100nM-1000nM；探针在扩增体系中的终浓度为 50nM-500nM；
反应条件为：95℃，3min；40个循环，每1个循环为95℃，20s；60℃， 1min。
一种同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测试剂盒，包括同时检测多种细菌及支原体的的引物探针组合。
优选的是，还包括：阴性对照、阳性对照、内对照、PCR buffer、Taq DNA酶、 DEPC水其中，Taq DNA酶为热启动DNA聚合酶；内对照为β人源珠蛋白，阳性对照为包含多种细菌及支原体的的核酸，阴性对照为DEPC。
优选的是，所述多种细菌为鲍曼不动杆菌、奇异变形菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、嗜麦芽假单胞菌、铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌、大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、人葡萄球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌中的任一种或一种以上的细菌，支原体为肺炎支原体。
所述的同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测试剂盒在检测或辅助检测临床多种细菌及支原体的感染中的非诊断目的的应用。
本发明的有益效果是：
本发明采用多重荧光实时定量PCR法(多重PCR检测方法)，针对临床上常见的及易感染的17种细菌(鲍曼不动杆菌、奇异变形菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、嗜麦芽假单胞菌、铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌、大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、人葡萄球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌)以及1种支原体(肺炎支原体)，应用16SrDNA设计相应的靶点引物和探针，开发出能同时检测多种细菌及支原体的方法，该方法灵敏度高、特异性强、检测快且操作简单，可对样本进行批量检测，解决了临床上常见易感染的病原微生物检测的诸多问题。
附图说明
图1为引物探针组的灵敏度实验，其中，图1a为鲍曼不动杆菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图1b根据图1a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9926；
图2为引物探针组的灵敏度实验，其中，图2a为粪肠球菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图2b根据图2a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9961；
图3为引物探针组的灵敏度实验，其中，图3a为大肠埃希菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图3b根据图3a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9988；
图4为引物探针组的灵敏度实验，其中，图4a为肺炎克雷伯菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图4b根据图4a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9962；
图5为引物探针组的灵敏度实验，其中，图5a为奇异变形菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图5b根据图5a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9862；
图6为引物探针组的灵敏度实验，其中，图6a为铜绿假单胞菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图6b根据图6a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9999；
图7为引物探针组的灵敏度实验，其中，图7a为洋葱假单胞菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图7b根据图7a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9983；
图8为引物探针组的灵敏度实验，其中，图8a为嗜麦芽假单胞菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图8b根据图8a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9938；
图9为引物探针组的灵敏度实验，其中，图9a为肺炎链球菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图9b根据图9a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9867；
图10为引物探针组的灵敏度实验，其中，图10a为表皮葡萄球菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图10b根据图10a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9921；
图11为引物探针组的灵敏度实验，其中，图11a为脑膜炎奈瑟菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图11b根据图11a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9874；
图12为引物探针组的灵敏度实验，其中，图12a为人葡萄球菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图12b根据图12a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9876；
图13为引物探针组的灵敏度实验，其中，图13a为嗜肺军团菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图13b根据图13a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9963；
图14为引物探针组的灵敏度实验，其中，图14a为金黄色葡萄球菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图14b根据图14a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9900；
图15为引物探针组的灵敏度实验，其中，图15a为流感嗜血杆菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图15b根据图15a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9987；
图16为引物探针组的灵敏度实验，其中，图16a为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图16b根据图16a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9984；
图17为引物探针组的灵敏度实验，其中，图17a为结核分枝杆菌检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图17b根据图17a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9978；
图18为引物探针组的灵敏度实验，其中，图18a为肺炎支原体检测DNA样品进行十倍梯度稀释后(102copies/ul、103copies/ul、104copies/ul和105copies/ul)，进行扩增反应并获得的扩增曲线，图18b根据图18a的扩增曲线绘制的标准曲线，其中，R2值为0.9902。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
(1)细菌和支原体基因组DNA的提取
收集待检者受感染样品采用市售细菌和支原体基因组DNA提取试剂盒，具体操作过程按照说明书进行。
(2)引物设计
从GenBank中获得鲍曼不动杆菌、奇异变形菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、嗜麦芽假单胞菌、铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌、大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、人葡萄球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌和肺炎支原体的相应序列，设计扩增引物探针(表1)，确保每对引物和相应的探针能够扩增出相应的病原微生物，并不与其它病原体发生非特异扩增。
表1 18种细菌及支原体(病原微生物)扩增引物和探针
(3)多重PCR方法的建立
利用本专利提供的方法，反应体系为20uL，具体为：待检者核酸样本2uL、2×PCRbuffer 10uL、Taq酶0.5uL、引物探针混合液2uL、补DEPC水至20uL。引物在体系内的终浓度为500nM，探针在体系中终浓度为250nM。注意每次检测都要设置阳性对照和阴性对照。放入荧光定量PCR仪中，设置好反应程序，开始检测，反应条件：95℃，3min；[95℃， 20s；60℃，1min]40个循环。检测探针通道及分组情况见表2。
表2检测探针通道及分组
(4)结果
反应完成后，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.23，判断为阳性；无典型“S”型扩增或CT>36.23，且内标的 CT≤36.23，判断为阴性。在CY5通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.89，判断为阳性；无典型“S”型扩增或CT>36.89，且内标的CT≤36.89，判断为阴性。在JOE通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤37.52，判断为阳性；无典型“S”型扩增或CT>37.52，且内标的CT≤37.52，判断为阴性。在ROX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.12，判断为阳性；无典型“S”型扩增或CT>36.12，且内标的CT≤36.12，判断为阴性。
实施例2
特异性实验：
用细菌基因组DNA提取试剂盒提取鲍曼不动杆菌、奇异变形菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、嗜麦芽假单胞菌、铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌、大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、人葡萄球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌和肺炎支原体DNA，操作步骤按DNA提取试剂盒自带说明书进行。检测通道分为五组，分组情况同表2，以第一组为例，96孔板同一行的孔中加入相应的引物探针(每个管中仅加入第一组的4种引物探针，以此轮推，第 1-5行分别对应加入每一组的引物探针，共5行)，同一列孔中加入相同的病原体的DNA(即含有第一组4种病原体的DNA)模板，保证每个引物探针和18种病原微生物中的任意一种都有独立的接触机会，通过这样的交叉实验，统计各CT值，验证本发明方法的特异性。另添加其它5种病原体：阴沟肠杆菌，卡他莫拉菌，屎肠球菌，变异链球菌和肺炎衣原体，通过跟本发明方法进行交叉实验，验证本发明方法的特异性。
多重荧光PCR反应体系为20uL，具体为：每一组病原体混合DNA样本2uL、2×PCRbuffer 10uL、Taq DNA酶0.5uL、引物探针混合液2uL、补DEPC水至20uL。放入荧光定量PCR仪中，设置好反应程序，开始检测，反应条件：95℃，3min；[95℃，20s；60℃， 1min]40个循环。
结果见表3，由表3结果可以看出，每组中引物探针只与其对应的病原体有扩增，表明各引物探针具有良好的特异性。
表3本发明方法的特异性实验结果
实施例3
灵敏度实验
将实施例2中制备的18种细菌及支原体(病原微生物)DNA进行十倍梯度稀释，102-105copies/ul，使用本发明提供的试剂盒对上述稀释后的样品分别进行扩增，18种病原微生物检测灵敏度结果图1-图18所示，其中，图1-图18中的18种病原微生物检测结果的标准曲线的R2值分别为0.9926(鲍曼不动杆菌)、0.9961(粪肠球菌)、0.9988(大肠埃希菌)、0.9962(肺炎克雷伯菌)、0.9862(奇异变形菌)、0.9999(铜绿假单胞菌)、 0.9983(洋葱假单胞菌)、0.9938(嗜麦芽假单胞菌)、0.9867(肺炎链球菌)、0.9921 (表皮葡萄球菌)、0.9874(脑膜炎奈瑟菌)、0.9876(人葡萄球菌)、0.9963(嗜肺军团菌)、0.9900(金黄色葡萄球菌)、0.9987(流感嗜血杆菌)、0.9984(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、0.9978(结核分枝杆菌)和0.9902(肺炎支原体)。
实施例4
准确性实验
随机选择18种细菌及支原体的的样本各10例，用本发明方法进行检测，同时将样本测序所得的序列经Blast比对，本发明方法检测结果与测序结果符合率为100％。
实施例5
重复性实验
应用本发明方法配制反应体系，将分别含有102-105copies/ul的样本的反应体系平行做 3个孔，计算3管样本进行PCR扩增后获取的CT值间的变异系数。结果见下表4，变异系数均在4％以下，说明本发明方法具有良好的重复性。
表4本发明方法检测18种细菌及支原体(病原微生物)重复性结果
实施例6实际临床样本的检测
本实施例所采用临床样本来自廊坊市医院采集的痰液样本(采集者自愿的原则)，痰液量大于1ml，共1047例。提取18种细菌及支原体的的基因组DNA。利用本发明的试剂盒进行多重荧光PCR与传统菌培养法检测进行比对，结果见表5，本发明试剂盒与传统的培养法相比，阴/阳性符合率100％。
表5本发明方法检测18种细菌及支原体的与培养法对比结果
| 本发明阳性样本数 | 培养法阳性样本数 | |
| 鲍曼不动杆菌 | 170 | 170 |
| 奇异变形菌 | 3 | 3 |
| 表皮葡萄球菌 | 9 | 9 |
| 肺炎链球菌 | 25 | 25 |
| 粪肠球菌 | 5 | 5 |
| 嗜麦芽假单胞菌 | 16 | 16 |
| 铜绿假单胞菌 | 189 | 189 |
| 洋葱假单胞菌 | 4 | 4 |
| 大肠埃希菌 | 52 | 52 |
| 脑膜炎奈瑟菌 | 2 | 2 |
| 肺炎克雷伯菌 | 173 | 173 |
| 人葡萄球菌 | 2 | 2 |
| 嗜肺军团菌 | 21 | 21 |
| 金黄色葡萄球菌 | 14 | 14 |
| 流感嗜血杆菌 | 7 | 7 |
| 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 | 3 | 3 |
| 结核分枝杆菌 | 4 | 4 |
| 肺炎支原体 | 27 | 27 |
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
<110>廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司
<120>同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测方法及其应用
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>54
gccattggaa tcccaatgca caaga 25
Claims (8)
1.一种同时检测多种细菌及支原体的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：
1)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对1和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的探针1；
2)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对2和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的探针2；
3)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对3序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的探针3；
4)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对4序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的探针4；
5)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物对5序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的探针5；
6)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物对6序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的探针6；
7)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物对7序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的探针7；
8)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的引物对8序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的探针8；
9)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的引物对9序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示的探针9；
10)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的引物对10序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示的探针10；
11)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的引物对11序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示的探针11；
12)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的引物对12序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示的探针12；
13)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的引物对13序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示的探针13；
14)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的引物对14序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示的探针14；
15)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的引物对15序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示的探针15；
16)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的引物对16序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的探针16；
17)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的引物对17序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的探针17；
18)由多核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的引物对18序列和由多核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的探针18。
2.如权利要求1所述的同时检测多种细菌及支原体的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团FAM、JOE、ROX或Cy5中的任一种；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1或BHQ2。
3.一种同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制含有如权利要求1或2所述的引物探针组合及待检测样品的反应体系并进行
PCR扩增反应；以及根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。
4.如权利要求3所述的同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系为20uL，具体包括：待检测样品2uL、2×PCR buffer 10uL、Taq DNA酶0.5uL、引物探针组合的混合液2uL、补DEPC水至20uL；其中，引物对在扩增体系中的终浓度为100nM-1000nM；探针在扩增体系中的终浓度为50nM-500nM；
反应体系的反应条件为：95℃，3min；40个循环，每1个循环为95℃，20s；60℃，1min。
5.一种同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的同时检测多种细菌及支原体的引物探针组合。
6.如权利要求5所述的同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照、阳性对照、内对照、PCR buffer、Taq DNA酶、DEPC水中的任一种或多种；其中，Taq DNA酶为热启动DNA聚合酶；内对照为β人源珠蛋白，阳性对照为包含18种多种细菌及支原体的的核酸，阴性对照为DEPC水。
7.如权利要求5所述的同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多种细菌为鲍曼不动杆菌、奇异变形菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、嗜麦芽假单胞菌、铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌、大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、人葡萄球菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌中的任一种或一种以上的细菌，支原体为肺炎支原体。
8.如权利要求5-7中任一项所述的同时检测多种细菌及支原体的多重PCR检测试剂盒在检测或辅助检测临床多种细菌及支原体的感染中的非诊断目的的应用。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201910677701.1A CN110607379A (zh) | 2019-07-25 | 2019-07-25 | 同时检测多种细菌及支原体的多重pcr检测方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191224 |
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