CN113652494A - 一种检测幽门螺杆菌的探针、引物组和试剂盒 - Google Patents

一种检测幽门螺杆菌的探针、引物组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种检测幽门螺杆菌的探针、引物组和试剂盒，涉及生物技术领域。该检测幽门螺杆菌的探针，包括ureI探针，所述ureI探针序列如SEQ ID NO.3所示。该检测幽门螺杆菌的引物组，包括ureI引物对，所述ureI引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的ureIF和序列如SEQ IDNO.2所示的ureIR，还包括前述探针。此外，本发明还提供包含前述引物组的试剂盒，用于多重实时荧光定量PCR检测胃黏膜组织中幽门螺杆菌。本发明提供的引物组或试剂盒，检测灵敏度高、特异性好，对于检测组织要求低，检测限为1E1copies/μl，其检测准确度达到了已上市同种产品的质量水平，能够满足临床试验需要。

Description

一种检测幽门螺杆菌的探针、引物组和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测幽门螺杆菌的探针、引物组和试剂盒。
背景技术
1983年澳大利亚学者Marshall和Warren首次从胃黏膜样本中分离出幽门螺杆菌(Helicobacter pylroi,简称H.pylori或Hp)。Hp是一种常见的可长期定植于人类胃黏膜的革兰阴性微需氧杆菌，与许多上消化道疾病有着紧密的联系。全世界有超过半数的人感染Hp，而在我国的感染率为55％。Hp的感染给患者造成极大的痛苦，极大的加重了医疗负担。WHO把Hp列为同乙型、丙型肝炎一样，都是生物致癌物。因此，迫切需要一种能够快速、特异性检测Hp感染的方法。
目前诊断Hp感染的方法很多，包括尿素酶检测、细菌培养、组织学染色、血清Hp抗体检测和实时荧光定量PCR等方法。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、不需要PCR产物后处理、有效解决PCR污染问题和自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
锁核酸(lockednucleic acid，LNA)是一种新型的寡核酸衍生物，结构中B-D-呋喃核糖的2-0，4C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结构。LNA作为一种新的反义核酸，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。其能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备LNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加，可大大提高基因诊断的效率和灵敏度。
幽门螺杆菌是一类基因组结构变异很大的细菌，共有特征的基因包括：插入序列、致病岛、质粒外，还具有特殊的毒力基因，如尿素酶基因，鞭毛基因以及看家基因等；其中H.pylori看家基因包括(atpA、efp、mutY、ppa、trpC、ureI和yphC)，同时ureH、ureI基因为Hp尿素酶基因所特有，限于目前此类研究现状，极少把ureI基因作为核酸检测的靶基因，本发明选择该基因作为靶基因作为核酸检测研究对象。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测幽门螺杆菌的探针，此探针可用于检测幽门螺杆菌，特异性高。
本发明的第二目的在于提供一种检测幽门螺杆菌的引物组，该引物组可用于多重实时荧光定量PCR体系检测胃粘膜组织中幽门螺杆菌。
本发明的第二目的在于提供一种多重实时荧光定量PCR检测胃黏膜组织中幽门螺杆菌的试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性好，能够快速准确检测出胃部粘膜组织中得到幽门螺杆菌。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
第一方面，本发明提供一种检测幽门螺杆菌的探针，包括ureI探针，所述ureI探针序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明提供一种检测幽门螺杆菌的引物组，包括ureI引物对，所述ureI引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的ureIF和序列如SEQ ID NO.2所示的ureIR，还包括前述探针。
第三方面，本发明提供一种多重实时荧光定量PCR检测胃黏膜组织中幽门螺杆菌的试剂盒，包括多重实时荧光定量PCR反应液、阴性质控品、阳性标准品和内参标准品；所述多重实时荧光定量PCR反应液包含buffer、dNTPs、Taq酶、Nuclease-Free H2O和前述引物组；所述阳性标准品为包含ureI核酸序列的产品；所述阴性质控品为大肠杆菌；所述内参标准品为β-actin标准品。
相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
本发明通过对GenBank中已知幽门螺杆菌核苷酸序列的比对分析，找到幽门螺杆菌特有的ureI基因(其他无此基因，其次该基因非常保守)，并选择其上的一段保守区作为靶基因，这段基因的筛选来源于临汾市人民医院对全国来源的80株的测序分析，代表了中国的流行菌株，对于中国幽门螺杆菌的检出具有重要意义。同时本发明选择人的β肌动蛋白(β-actin)为内参基因，以保证试验中模板提取的正确性和初步估算模板浓度。
本申请发明人在前述引物组的基础上，研发出实时TaqMan荧光定量PCR，优化反应体系和条件，使前述因五组可以用于快速、高特异性、高灵敏度并且精确定量检测幽门螺杆菌。实时TaqMan荧光定量PCR通过序列特异性TaqMan探针以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而可以增加特异性并降低交叉污染的可能性。另外，不需要进一步的下游分析，节约了凝胶电泳观察结果的时间。
整体而言，本发明提供的引物组或试剂盒，其检测灵敏度高、特异性好，对于检测组织要求低，仅需2-5微米切片(5-10片)即可快速、准确、灵敏地检测出胃黏膜组织中是否存在幽门螺杆菌，检测限为1E1copies/μl。此外，本发明与现有对照试剂盒检测结果在统计学上无显著性差异，表明本发明产品质量达到了已上市同种产品的质量水平，能够满足临床试验需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中多重体系中β-actin探针对不同浓度模板标准曲线；
图2为多重体系中ureI探针对不同浓度模板扩增的标准曲线；
图3为多重体系中β-actin探针对不同浓度模板的扩增结果；
图4为多重体系中ureI探针对不同浓度模板扩增的扩增结果；
图5为用于检测ureI荧光PCR体系特异性模板。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
第一方面，本申请实施例提供一种检测幽门螺杆菌的探针，包括ureI探针，所述ureI探针序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些实施例中，上述探针中所述ureI探针的5’端设置有FAM荧光报告基团，所述ureI探针的3’端设置有BHQ1淬灭基团。
在本发明的一些实施例中，上述探针中还包括β-actin探针，所述β-actin探针的序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一些实施例中，上述探针中所述β-actin探针的5’端设置有VIC荧光报告基团，3’端设置有MGB淬灭基团。
第二方面，本申请实施例提供一种检测幽门螺杆菌的引物组，包括ureI引物对，所述ureI引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的ureIF和序列如SEQ ID NO.2所示的ureIR，还包括前述探针。
在本发明的一些实施例中，上述引物组中还包括β-actin引物对，所述β-actin引物对包括序列如SEQ ID NO.4所示的β-actinF和序列如SEQ ID NO.5所示的β-actinR。
第三方面，本申请实施例提供一种多重实时荧光定量PCR检测胃黏膜组织中幽门螺杆菌的试剂盒，包括多重实时荧光定量PCR反应液、阴性质控品、阳性标准品和内参标准品；所述多重实时荧光定量PCR反应液包含buffer、dNTPs、Taq酶、Nuclease-Free H2O和前述引物组；所述阳性标准品为包含ureI核酸序列的产品；所述阴性质控品为大肠杆菌；所述内参标准品为β-actin标准品。
在本发明的一些实施例中，上述试剂盒，所述试剂盒需要进行多重实时荧光定量PCR，其扩增的最佳反应温度和时间为：95℃5min，95℃15s，然后60℃45s运行40个循环。
在本发明的一些实施例中，上述试剂盒，所述多重实时荧光定量PCR反应体系的总体积为25μl时，其中包括10×buffer 2.5μl，2.5mM的dNTPs2μl，5U/μl的Taq酶0.25μl，ureIF 0.5μl，ureIR 0.5μl，ureIP 0.1μl，β-actinF0.5μl，β-actinR 0.5μl，β-actinP 0.1μl，Template 2.5μl，Nuclease-Free H2O15.55μl。
在本发明的一些实施例中，上述试剂盒，所述阳性标准品为幽门螺杆菌特异性ureI标准品，所述幽门螺杆菌特异性ureI标准品的序列如SEQ ID NO.7所示，所述β-actin标准品的序列如SEQ ID NO.8所示。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例的目的在于提供试验材料。
1.1标准菌株与临床样本
ATCC Hp26695标准菌株为科室保存，胃黏膜标本来自临汾某医院。
1.2引物与探针
通过对GenBank中已知幽门螺杆菌核苷酸序列的比对分析，找到幽门螺杆菌的ureI上的一段保守区作为靶基因。这段基因的筛选来源于临汾市人民医院对全国来源的80株的测序分析，这些菌株代表了中国的流行菌株。同时本实施例选择人的β肌动蛋白(β-actin)为内参基因。β-actin基因常被用作从人体标本中检测病原微生物的内参基因。本实施例所用特异性引物探针序列如表1，其中ureIP的5端加上FAM荧光报告基团，3端加上BHQ1淬灭基团后序列如下：FAM-AAC+CAAA+GT+CGAT+CCTAA-BHQ1(“+”号仅示意该序列的结构组成)；β-actinP的5端加上VIC荧光报告基团，3端加上MGB淬灭基团后序列如下：VIC-CCATGTACGTTGCTATC-MGB
表1
Figure BDA0003291386970000071
1.3胃黏膜标本处理及核酸提取方法
1、胃粘膜标本消化
胃粘膜标本消化处理步骤如下：
①将5-10片切片组织加入250μlBuffer GA，90℃孵育30min-60min。(若Buffer GA出现沉淀，在温水中溶解后再使用)。
②室温放置1min，然后12000rpm离心2min，小心穿过石蜡层，吸取200μl包含组织的液体到一新的1.5mlEP管中，加入20μl蛋白酶K，颠倒混匀。(加入蛋白酶的量可依据组织的多少而定，若过夜消化组织仍未消化完全，需要考虑蛋白酶K自身问题)
③55℃水浴，过夜消化，以组织基本都消化为准。
2、胃粘膜标本中DNA提取
胃粘膜标本中DNA的具体提取方法按照QIAGEN石蜡包埋的基因组提取试剂盒提取。将水浴锅打开并调至70℃，并将Elution Buffer 70℃预热。具体提取步骤如下：
(1)将消化后的样品12000rpm离心2min，吸取上清到一新的编好号的EP管中，加250μlBuffer GB，充分震荡混匀，70℃水浴10min；
(2)将水浴后的样本简短离心，加250μl无水乙醇，充分震荡混匀并点离；
(3)转移混合液到编好号的DNA吸附柱中(口腔拭子用枪头挤压吸取混合液)，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液；
(4)加入500μlGD Buffer，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管；
(5)加入500μlPW，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管。(使用漂洗液前察看是否经过无水乙醇稀释)；
(6)重复步骤(5)；
(7)吸附柱套到新的收集管中，12000rpm离心2min，离心后开盖静置2min(目的是挥发乙醇，如果样本量超过24个，可以不静置)；
(8)将吸附柱装到新的无菌EP管中，加入70℃预热的Elution Buffer50μl，静置2min，EB要在硅基质膜的中间悬空滴加，确保洗脱液能完全覆盖硅膜；
(9)12000rpm离心2min，若DNA量少可进行二次洗脱，将前次洗脱下来的液体再上柱，离心，以提高产量；
(10)提取的DNA两周以内使用则在4℃保存，如需长期保存则存放与-20℃，禁止反复冻融造成降解。
实施例2
本实施例的目的在于优化ureI、β-actin多重实时荧光定量PCR反应体系和反应条件。
选用QIAGEN的Taq酶(5U/μl)作为反映酶，该酶最优的反应体系(25μl)如表2所示：
表2
Figure BDA0003291386970000091
Figure BDA0003291386970000101
反应条件：95℃5min，95℃15s，60℃45s(收集荧光)，共40个循环。
结果判读：Ct值小于等于35的标本为阳性结果；Ct值大于35的标本为阴性结果；Ct值在35-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
实施例3
本实施例的目的在于制备标准曲线。
以标准浓度模板的log值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，分别绘制Hp ureI及β-actin体系的实时荧光定量PCR标准曲线。结果显示：阳性模板量在1E7copies/μl～1×1E3copies/μl这个范围时，其对数值与Ct值有非常好的相关性(ureI R平方等于0.999，β-actin R平方等于0.998)，ureI R和β-actin R的扩增效率图分别如图1和2所示。
实施例4
本实施例的目的在于评价ureI、β-actin多重实时荧光定量PCR反应体系的灵敏度、特异性及检出限。
1、灵敏度评价
灵敏度，又称真阳性率，即实际上是幽门螺杆菌并按照该检测方法的标准被正确的判断为幽门螺杆菌的百分比。用优化了的幽门螺杆菌ureI、β-actin多重实时荧光定量PCR检测体系(表2)检测，检测对象包括1株ATCC标准株(Hp26695)和(实际做了100例无区别病理的检测阳性的样本)实验室保存的100株幽门螺杆菌临床分离株DNA。结果除NTC对照外，所有100株幽门螺杆菌ureI、β-actin多重实时荧光定量PCR检测体系结果均呈阳性。
2、特异性评价
特异性，又称真阳性率，即实际上是非幽门螺杆菌并按照该检测方法的标准被正确地判为非幽门螺杆菌的百分比。用优化了的多重实时荧光定量PCR检测胃黏膜除Hp外可能出现的28种细菌、15种肠道致病菌及人类染色体(图5为用于检测ureI荧光PCR体系特异性模板)，以幽门螺杆菌为阳性对照。结果除阳性对照外，其余44种非幽门螺杆菌模板均为阴性。
3.检测限评价
检测下限即以该优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性模板中检测，结果为阳性的能力。以1E5copies/μl---1E1copies/μl一系列梯度的质粒为模板，每个浓度梯度取2.5μl，按照优化的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR。当模板浓度为1E5copies/μl---1E1copies/μl时，每个浓度梯度的模板扩增结果均为阳性。所以，多重实时荧光定量PCR体系中ureI的检测下限为1E1copies/μl，结果如图3所示。多重实时荧光定量PCR体系中β-actin的检测下限为1E1copies/μl，结果如图4所示。
实施例5
本实施例的目在于评价本发明提供的多重实时荧光定量PCR方法与现有产品检测一致性。
现有试剂盒为达安基因的Hp检测试剂盒，比较该试剂盒和本发明提供的多重实时荧光定量PCR试剂盒的一致性。结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003291386970000121
本次临床试验按照试验方案开展工作，通过临床388例有效样本的考核，结果如表3所示，对照试剂盒检出阳性163例，其中160例被本申请提供的试剂盒检测为阳性，3例为阴性，对照试剂盒检测出阴性225例，其中220例被本申请提供的试剂盒检测为阴性，5例为阳性，由此可见，两种试剂盒的临床阳性符合率为98.2％，阴性符合率为97.8％，总符合率为97.9％、一致性系数为：0.957。均大于评价标准，说明本发明与对照试剂盒检测结果在统计学上无显著性差异，表明本发明产品质量达到了已上市同种产品的质量水平，能够满足临床试验需要。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测幽门螺杆菌的探针，其特征在于，包括ureI探针，所述ureI探针序列如SEQID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述ureI探针的5’端设置有FAM荧光报告基团，所述ureI探针的3’端设置有BHQ1淬灭基团。
3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，还包括β-actin探针，所述β-actin探针的序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述β-actin探针的5’端设置有VIC荧光报告基团，3’端设置有MGB淬灭基团。
5.一种检测幽门螺杆菌的引物组，其特征在于，包括ureI引物对，所述ureI引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的ureIF和序列如SEQ ID NO.2所示的ureIR，还包括如权利要求3所述的探针。
6.根据权利要求5所述的引物组，其特征在于，还包括β-actin引物对，所述β-actin引物对包括序列如SEQ ID NO.4所示的β-actinF和序列如SEQ ID NO.5所示的β-actinR。
7.一种多重实时荧光定量PCR检测胃黏膜组织中幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，包括多重实时荧光定量PCR反应液、阴性质控品、阳性标准品和内参标准品；所述多重实时荧光定量PCR反应液包含buffer、dNTPs、Taq酶、Nuclease-Free H2O和如权利要求6所述的引物组；所述阳性标准品为包含ureI核酸序列的产品；所述阴性质控品为大肠杆菌；所述内参标准品为β-actin标准品。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒需要进行多重实时荧光定量PCR，其扩增的最佳反应温度和时间为：95℃5min，95℃15s，然后60℃45s运行40个循环。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述多重实时荧光定量PCR反应体系的总体积为25μl时，其中包括10×buffer 2.5μl，2.5mM的dNTPs 2μl，5U/μl的Taq酶0.25μl，ureIF 0.5μl，ureIR 0.5μl，ureIP 0.1μl，β-actinF 0.5μl，β-actinR 0.5μl，β-actinP0.1μl，Template 2.5μl，Nuclease-Free H2O 15.55μl。
10.根据权利要求7～9任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为幽门螺杆菌特异性ureI标准品，所述幽门螺杆菌特异性ureI标准品的序列如SEQ ID NO.7所示，所述β-actin标准品的序列如SEQ ID NO.8所示。
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