CN103732751A

CN103732751A - 在幽门螺杆菌中的基因表达和根除系统

Info

Publication number: CN103732751A
Application number: CN201280022816.3A
Authority: CN
Inventors: M·本格扎尔; 亚历山德拉·薇若妮卡·德宝斯基; 米里亚姆·塞何娜奥; 雅克和雅·迪尔耶; 赛弘·帕克; B·马歇尔
Original assignee: Ondek Pty Ltd
Current assignee: Ondek Pty Ltd
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2014-04-16
Also published as: CA2829154A1; US20140072595A1; WO2012119203A1; AU2012225146A1; US9115363B2; JP2014509513A; EP2683827A4; EP2683827A1

Abstract

本发明涉及用于幽门螺杆菌的基因表达和根除系统。特别的，本发明涉及一种基因构建体，其沿着5'至3'的方向包括：(a)启动子序列；和(b)目的DNA序列，其中，所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌中调节所述目的DNA序列表达的多核苷酸序列，以及其中，所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)操纵子序列。

Description

在幽门螺杆菌中的基因表达和根除系统

技术领域

本发明涉及用于幽门螺杆菌(幽门螺杆菌)的基因表达和根除系统。特别地，本发明涉及在幽门螺杆菌中Tet可诱导的基因表达系统，转化的幽门螺杆菌可以用于基因体外和/或体内的可控表达。本发明进一步涉及控制幽门螺杆菌形成集落能力的方法,特别地涉及遗传修饰的幽门螺杆菌,其通过修饰或删除幽门螺杆菌利用某些糖的能力。

背景技术

世界上大半的人口长期地感染胃病原体幽门螺杆菌。感染通常是在儿童初期获得的并且持续一生，其中大部分感染个体保持无症状。幽门螺杆菌感染是消化性溃疡疾病的主要原因(uipers等。1995)，并且是胃腺癌发展的重要的危险因素(Wilson&Crabtree2007；Amieva&El-Omar2008；Wroblewski等。2010)。此外，幽门螺杆菌的治疗随着抗生素抗性的出现变得愈加困难(Zullo等2007；Graham&Shiotani2008)并且因此需要鉴别抗生素治疗的备选方案。阐明幽门螺杆菌持续性的机制可能导致发现新的药物靶点以及开发选择性的根除疗法。

遗传学，包括插入诱变、基因置换和基因过度表达已经通过研究重组体和突变株表现型惊人地有助于解释细菌的生命现象。这个方法已经广泛用于表征一些幽门螺杆菌毒力因子如尿素酶、CagA、VacA和鞭毛(Algood&Cover,2006)。尽管起初有用，但在细菌遗传学领域越来越多的观点在于使用敲除突变株限制研究至完全功能的损失，因为该方法不能允许研究是否特异基因或一组编码毒性决定因素的基因对于保持感染状态（一旦已经被建立）而言是所必需的，或者是否这些毒性决定因素对于整个侵染循环是所需的(Gandotra等2007；Wroblewski等2008)。此外，影响细菌生长的严重的表型受到补偿性适应，其在生理学的或遗传水平上或者二者水平上。因此，基于靶基因的诱导型表达的遗传工具更适于构造条件性的敲除用于生理学的和表型的研究。值得注意的，基于使用条件性敲除的遗传学的研究能够使得调查员测试靶基因表达和它们相应产物的暂时需求，区分了它们在感染不同步骤期间的作用，例如感染的形成集落和维持。该方法对于持续和终身感染的幽门螺杆菌感染而言是特别重要的。

最近，基于大肠杆菌中Laclq系统的诱导系统的质粒已经被开发以研究幽门螺杆菌中的必要的基因(Boneca等2008)。不幸地，该Laclq系统没有有效地抑制基因表达并且它需要大量诱导物分子以诱导基因表达，这使得用作用于在动物模型中研究侵染过程的工具是不可行的。此外,多种幽门螺杆菌菌株的DNA限制性屏障和DNA修饰会有区别，这阻止了质粒在该细菌中的系统应用。

因此，需要一种遗传学的工具，其基于在体外和体内都发挥功能的幽门螺杆菌中的靶基因诱导型表达。此外，一直有需求来开发用于幽门螺杆菌的根除方法，特别是根除遗传修饰的幽门螺杆菌，其可被用作用于肽的生物学传递载体等。

发明概述

发明人已经开发了一种用于幽门螺杆菌的四环素型可诱导的基因表达系统。所使用的条件性敲除策略容许在感染期间在各种时点打开或关闭单个靶基因。

因此，在第一方面中，本发明提供了一种基因构建体，其沿着5'至3'的方向包括:(a)启动子序列和(b)目的DNA序列，其中所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）中调节所述目的DNA序列表达的多核苷酸序列，以及其中所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)DNA操纵子序列。

在一些实施方案中，所述目的DNA序列编码至少一种异源抗原，或其功能片段。在一些实施方案中，所述异源抗原或其功能片段来自病原微生物，优选选自病毒、细菌、原生动物和真菌的病原微生物。

在一些实施方案中，所述异源抗原选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、埃-巴二氏病毒抗原、水痘-带状疱疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、鼻病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、诺沃克病毒抗原、披衣抗原、甲病毒抗原、风疹病毒抗原、狂犬病病毒抗原、马伯格氏病毒抗原、埃博拉病毒抗原、乳头状瘤病毒抗原、多形瘤病毒抗原、间质肺病毒抗原、冠状病毒抗原、霍乱弧菌抗原、镰状疟原虫抗原、间日疟原虫抗原、卵形疟原抗原、三日疟原虫抗原、诺氏疟原虫抗原、肺炎链球菌抗原、酿脓链球菌抗原、幽门螺杆菌抗原、无乳链球菌抗原、脑膜炎奈瑟氏球菌抗原、淋病奈瑟氏菌抗原、白喉棒杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、百日咳杆菌抗原、嗜血杆菌抗原、衣原体抗原和大肠杆菌抗原。

在一些实施方案中，本发明的构建体进一步包括(c)基因终止序列。

在第二方面中本发明提供了一种基因构建体，其沿着5'至3'的方向包括:(a)启动子序列和(b)尿素酶操纵子，其中所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌中调节所述尿素酶操纵子表达的多核苷酸序列，以及其中所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)操纵子序列。

在一些实施方案中，所述尿素酶操纵子是从幽门螺杆菌菌株中分离的。

优选地，所述尿素酶操纵子包括亚基A和B。

优选地，所述基因构建体是质粒载体。在一些实施方案中，所述质粒载体能够将本发明的基因构建体插入幽门螺杆菌的染色体中。优选地，基因构建体的插入染色体中是通过同源重组。

在一些实施方案中，在启动子修饰为包括tet操纵子序列之前是外源的或包括通常或天然未被发现的和/或未由幽门螺杆菌产生的外源的核酸。优选地，所述启动子是内源的或包括通常发现于幽门螺杆菌内和/或由幽门螺杆菌产生的内源的核酸。更优选地，所述启动子是用于尿素酶的启动子，特别地幽门螺杆菌的尿素酶亚基A。在一些实施方案中，所述启动子选自amiE启动子、核心尿素酶启动子、revtetR启动子和flaA启动子。

一旦获得，则所述启动子被修饰成引入四环素(tet)操纵子序列。

在第三方面中，本发明提供了一种分离的遗传修饰的幽门螺杆菌，其包括基因构建体，所述基因构建体沿着5'至3'的方向包括:(a)启动子序列和(b)目的DNA序列，其中所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌中调节所述目的DNA序列表达的多核苷酸序列，以及其中所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)操纵子序列。

在第四方面中，本发明提供了一种分离的遗传修饰的幽门螺杆菌，其包括基因构建体，所述基因构建体沿着5'至3'的方向包括:(a)启动子序列；(b)尿素酶操纵子；和(c)基因终止序列，其中所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌中调节所述尿素酶操纵子表达的多核苷酸序列，以及其中所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)操纵子序列。

在第五方面中，本发明提供了一种遗传修饰的幽门螺杆菌的方法，其包括：

(i)提供一种基因构建体，其沿着5'至3'的方向包括:(a)启动子序列和(b)目的DNA序列，其中所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌中调节所述目的DNA序列表达的多核苷酸序列，以及其中所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)操纵子序列；和

(ii)转化所述幽门螺杆菌以生产所述遗传修饰的幽门螺杆菌。

在第六方面中，本发明提供了一种免疫原组合物，其包括根据第三方面和第四方面的遗传修饰的幽门螺杆菌和药用可接受的载体。

在一些实施方案中，该免疫原的组合物进一步包括佐剂。

在第七方面中，本发明提供了一种用于保护哺乳动物抵抗病原微生物感染的方法，其包括给药免疫有效量的根据第六方面的免疫原组合物的步骤。

在第八方面中，本发明提供了一种控制幽门螺杆菌在哺乳动物粘膜形成集落能力的方法，所述方法包括以下步骤：通过修饰或删除所述幽门螺杆菌中的磷酸甘露糖异构酶代谢控制脂多糖(LPS)的Lewis抗原，其中添加甘露糖至所述哺乳动物的饮食对于维持幽门螺杆菌在粘膜形成集落是必要的。

优选地，Lewis抗原的损失导致树状细胞在所述哺乳动物中改善的功能。

在本发明的一些实施方案中，该幽门螺杆菌被特别地选择作为有用的生物学载体以将试剂递送至哺乳动物的粘膜。优选地，幽门螺杆菌菌株包括选自以下列ATCC索取号保藏于美国模式培养物保藏中心(ATCC)的幽门螺杆菌菌株：43504；43504D-5；43526；43579；43629；49396；49503；51110；49503；51111；51407；51652；51653；51932；和53727。还参见例如，美国专利No.:5,459,041，通过参照引入本文。其它优选的幽门螺杆菌菌株包括以下列索取号保藏于国家测量局的幽门螺杆菌菌株：V09/009101；V09/009102；V09/009103；V10/014059；V10/014060；和V09/009104。

在本发明中所包含的哺乳动物的非限制性实例是灵长类动物、犬科动物、马属动物、牛、猪、绵羊和啮齿动物。

考虑到具体幽门螺杆菌、质粒载体及其他本文中所述和其他本领域技术人员已知的配方例如在雷明顿药物科学第二十版本中所描述的（麦克出版社，其正文被特别地通过参照引入本文）的递送装置的具体类型和比例，容易制备在本发明的实践中使用的各种组合物的递送形式。

附图说明

图1显示驱动TetRs在幽门螺杆菌中表达的ptetR构建体的示意图。

图2显示通过幽门螺杆菌X47菌株mdab：：ptetR1-7表达TetRs的Western印迹分析。用转化pMdaB-ptetR6的大肠杆菌菌株充当阳性对照(pos)。X47受体菌株mdab::rpsL-CAT充当阴性对照(neg)。使用以1:2000稀释的多克隆兔抗TetR抗体检测TetRs。黑色箭头表示TetR蛋白质带。

图3显示四环素应答的启动子。(A)野生型ureA启动子，P_ureA和四环素应答的启动子urePtetOIII和uPtetOIII的核苷酸序列。-10和-35启动子序列被加下划线。框表示Tet操纵子序列。箭头表示转录起点并且星表示在uPtetO构建体中发现的-10框中C至T的突变。(B)代表性的uPtetO构建体的代表性图。白色tetO框表示野生型P_ureA启动子序列已经替换为tetO序列；(C)urePtetO构建体的代表性图。

图4显示在幽门螺杆菌中由uPtetO驱动的GFP表达。如所示，细菌被转化并且生长在BHI至对数期(OD₆₀₀=0.5)并且GFP活性被24小时过后测定。荧光强度被归一化至细胞密度并且用相对荧光单位表示。数据是平均值并且误差线表示标准偏差。不表达TetR的uptetOl(开口条)和uptetO2(阴影线条)菌株的GFP活性与野生型自动荧光相比。

图5显示在幽门螺杆菌中由uPtetO驱动的尿素酶表达。(A)X47urePtetO菌株的尿素酶活性。尿素酶活性用野生型亲本(WT)尿素酶活性的百分数来表示。urePtetO构建体在条下被指定。(B)具有修饰的ureA启动子的X47菌株在C57BL/6J小鼠形成集落两周。修饰至ureA启动子不防止形成集落。形成集落研究被进行而没有事先为小鼠适应X47urePtetO菌株。

图6显示在幽门螺杆菌中GFP表达的Tet调节。在菌株中GFP诱导与不同的ptetR构建体比较。如所示细菌被转化并且在BHI中生长至对数期(OD₆₀₀=0.5)，之后添加100ng/mL ATc(阴影线条)。24小时后测定GFP活性。载体uptetO GFPl和uptetO-GFPl已经转化入(A)TrpA、(B)GltDH或(C)DapB基因座。。三个独立地形成的克隆用来对每个构建体测量GFP活性。全部荧光测量被进行一式三份。荧光强度被归一化至细胞密度并且用相对荧光单位表示。数据是平均值并且误差线表示标准偏差。

图7显示最优的诱导物浓度、生长被ATc抑制和诱导动力学的测定。(A)诱导物浓度。幽门螺杆菌被如所示转化并且生长在BHI中至对数期(OD₆₀₀=0.5)并且添加增加量的ATc。24小时后测定GFP活性。(B)TetR控制GFP表达的时程。在10%SDS-PAGE凝胶上分离用uptetO1启动子表达GFP的幽门螺杆菌的裂解液(18mg蛋白质)。泳道1，通过X47缺乏TetR构成地表达GFP(pos)；泳道2，亲本野生型X47(neg)；泳道3，抑制的GFP(+tetR)；泳道4-9，通过100ng/ml ATc诱导TetR控制GFP的时程。

图8显示在幽门螺杆菌中urePtetO的tet调节。在缺少或存在50ng/mL ATc时，细菌被培养。免疫印迹法(A)通过Tet-ON菌株诱导UreB的表达。(B)在Tet-OFF菌株中抑制尿素酶表达。尿素酶活性检验。尿素酶活性用野生型亲本(WT)尿素酶活性的百分数来表示。在条下指出urePtetO构建体。(C-E)表达TetR的urePtetO菌株的尿素酶活性。(F-G)表达revTetR的urePtetO菌株的尿素酶活性。。

图9显示体内urePtetO的Tet调节。(A)X47耐受四环素。感染上野生型亲本X47菌株并被补充范围内dox浓度的小鼠一周的细菌接种量。这是三个独立试验的合并数据，动物组n=3。(B)感染上野生型X47并且补充有5微克/mL的小鼠的细菌接种量，在感染之后两周和四周被评估。动物组n=6。(C-D)其在感染野生型X47(WT)或urePtetO菌株之后一周(n=3)和(E)两周(n=6)，小鼠的细菌接种量。小鼠在它们的饮用水中补充以不同的浓度dox，并且urePtetO菌株被在开始感染前诱导。(F)urePtetO菌株的感染依赖于dox补充量。小鼠补充以dox，在口服mdaB::ptetR4；urePtetOl后两周。Dox添加物然后被除去并且细菌接种量在0、1、3、7和14天被评估。在整个实验时期内，一组小鼠不接收任何dox补充(neg)并且第二组接收dox(pos)。动物组n=6。

图10显示通过幽门螺杆菌X47菌株mdab::ptetR1-7表达TetRs阳性对照Western印迹分析。被pMdaB-ptetR6转化大肠杆菌菌株充当阳性对照(pos)。X47受体菌株mdab::rpsL-CAT充当阴性对照(neg)。黑色箭头表示TetR蛋白质带。

图11显示pMdaB-ptetR载体图谱，其被用来靶向在mdaB基因座整合入幽门螺杆菌基因组。

图12显示载体的构建图谱，其被用来通过同源重组靶向插入DNA到幽门螺杆菌基因组的GltDH基因座。(A)pGltDH，克隆载体，(B)pGltDH-RCAT，在GltDH基因座包含rpsL-CAT，被用来形成幽门螺杆菌受体菌株。

图13显示载体的构建图谱，其被用来通过同源重组靶向插入DNA到幽门螺杆菌基因组的TrpA基因座。(A)pTrpA，克隆载体，(B)pTrpA-RCAT，在TrpA基因座包含rpsL-CAT，被用来形成幽门螺杆菌受体菌株。

图14显示载体的构建图谱，其被用来通过同源重组靶向插入DNA到幽门螺杆菌基因组的DapB基因座。(A)pHdapB，克隆载体，(B)pHdapB-RCAT，在DapB基因座包含rpsL-CAT，被用来形成幽门螺杆菌受体菌株。

图15显示tet应答的融合GFP的uPtetO构建体图谱。(A)uPtetO-GFP的明细图。(B)uPtetO-GFP，其克隆入pBluscript变体中。

图16显示tet应答的uPtetO-GFP的构建体图谱，其被克隆入受体载体中，用于靶向整合入幽门螺杆菌基因组中，其在(A)GltDH基因座，(B)trpA基因座和(C)dapB基因座。

图17显示制造用于幽门螺杆菌根除的糖旁路的方法，其中甘露糖和半乳糖补充在饮食中保持幽门螺杆菌敲入突变株。

图18显示在LPS上表达Lewis抗原。幽门螺杆菌细菌被生长在血琼脂板上，其有或者没有甘露糖(0.5%)并且被处理用于LPS提取和使用抗Lewis Y抗原的Western印迹。Lewis抗原在LPS上的存在被检测为在大约26kDa的带。泳道1，WT，用甘露糖；泳道2和3，HP0043缺失突变体，分别使用或不使用甘露糖；泳道4和5，HP0043缺失突变体补充GMP焦磷酸化酶，其分别使用或不使用甘露糖；泳道6和7，HP0043缺失突变体的克隆#1补充GMP焦磷酸化酶和己糖激酶，其分别使用或不使用甘露糖；泳道8和9，HP0043缺失突变体的克隆#2补充GMP焦磷酸化酶和己糖激酶1，其分别使用或不使用甘露糖。

图19显示在LPS上表达Lewis抗原和生长抑制。幽门螺杆菌细菌被生长在液体介质中，其有或者没有甘露糖(0.5%)并且被处理用于LPS提取和使用抗Lewis Y抗原的Western印迹。Lewis抗原在LPS上的存在被检测为在大约26kDa的带。Wt，野生型，RC，受体菌株(ΗΡ0043敲除)，#116克隆1携带甘露糖旁路和#117克隆2携带甘露糖旁路。

图20显示对于8个携带甘露糖旁路的克隆在存在或者没有甘露糖时的细胞生长。

图21显示体内介导的重组体幽门螺杆菌的甘露糖根除。利用携带甘露糖旁路的幽门螺杆菌攻击小鼠，其通过在饮用水5%甘露糖喂养小鼠之后2周形成集落。在甘露糖饮食补充5天之后，小鼠被处死并且测量每个胃的菌落形成单位。

图22显示在幽门螺杆菌中ere表达的TetRs调节。细菌生长在液体培养，有或者没有50ng/ml ATc，并且通过免疫印迹进行分析。用转化pMdaB-PtaTaat-TetRs的大肠杆菌菌株充当阳性对照(pos)。X47菌株充当阴性对照(neg)。Cre被使用浓度为1微克/mS的多克隆兔抗Cre抗体进行检测。

图23显示Lox6671盒的示意图。该盒的侧翼是两个lo.x位点(Lox66和Lox71)，他们的非同序列核心序列以相同的方向定位仪容许cre介导切除lox位点之间的序列。核心尿素酶启动子和dapA基因位于lox位点之间。PureA可以通过Sail进行切除，留下dapA上游的RBS。

图24显示在幽门螺杆菌中Cre//ox切除。在ureBI基因座在构造lox6671盒的不同的步骤ureBI基因座的示意图。数字显示使用箭头表示的引物ureB seqF和urel seqR所预期的PCR片段大小。

图25显示在幽门螺杆菌中的C/lox切除。显示幽门螺杆菌菌株X47mdaB::ptetR2;trpA::uPtetO(l/2)-Cre(clone1-8)基因组DNA的DNA电泳用作PCR中的模板，该PCR采用引物ureB seqF和urel seqR。X47(I)的基因组DNA和质粒DNA pBI-Lox6671(C2)用作对照。

图26显示在幽门螺杆菌中的tetRs和tetR表达。菌株X47mdaB::PtaTaat-tetRs克隆1-4的tetRs表达和菌株X47mdaB::PamiE-tetR的tetR表达的蛋白质印迹分析。用转化pMdaB-PtaTaat-TetRs的大肠杆菌菌株充当阳性对照(pos)。X47菌株充当阴性对照(neg)。使用多克隆兔抗TetR抗体检测TetRs。

图27显示(A)四环素应答的启动子uPtet05构建体的示意图。白盒表示两个tetO位点。星表示在所有uPtetO构建体中发现的在-10框中的C至T突变。(B)(l-6)uPtet05构建体的核苷酸序列。核糖体结合位点(RBS)和起始密码子被加下划线并且这些序列的突变被黑体字表示。

图28显示构建体l-6uPtet05-Cre(A)的cre表达，(A)携带质粒pTrpA-(l-6)uPtet05-Cre的大肠杆菌菌株的蛋白质印迹。用pTrpA-uPtet02-Cre(pos)或pTrpA-RCAT(neg)转化的大肠杆菌菌株分别充当阳性和阴性对照。(B)幽门螺杆菌X47trpA::(l-6)uPtet05-cre的蛋白质印迹，其中，携带pTrpA-uPtet02-Cre(pos)或X47trpAr.RC(neg)的大肠杆菌菌株分别充当阳性和阴性对照。Cre被使用浓度为1微克/mS的多克隆兔抗Cre抗体进行检测。

图29显示cre正义-反义盒的构造示意图。pMA-反义包含trpA上游和下游500bp序列，其在转录终止子(黑盒子)、多克隆位点和PamiE启动子的侧翼。(l-6)uPtet05-cre融合被克隆入pMA-反义的MCS中，以形成最终的cre可诱导的正义-反义盒。黑色箭头表示转录起点。

图30显示在幽门螺杆菌中的Lox6671整合的识别。幽门螺杆菌菌株X47mdaBr.PureA-tetRs;trpA::的基因组DNA如(2/3/4/6)uPtetO-cre；ureBI::Lox6671(均为克隆1+2)用作使用引物ureB seqF和ureI_seqR的PCR的模板。X47ureBI::rpsL-CAT(CI)、X47(C3)和X47mdaB::ptetR2;trpA::uPtet02-Cre(C4)的基因组DNA和质粒DNA pBI-Lox6671(C2)用作对照。

图31显示合成四环素可诱导的基因表达盒(IEC)的示意图。该盒包括两个元件:受到flaA启动子{PflaA)控制的四环素阻遏基因tetRs，以及通过tet应答启动子uPtet04控制的靶基因fliC。TetRs被构成地表达和结合到单个tetO位点，该位点存在于-35和-10框之间。TetRs可以是by ATc诱导以容许fliC的表达。非编码DNA的间隔区存在于PflaA和uPtet04之间以分离IEC的两个臂。该盒的侧翼为两个由黑盒子表示的转录终止子。IEC的每一个元件侧翼为两个独特的限制性位点，这容许其可以被其他启动子或基因交换。图32显示在幽门螺杆菌B128中IEC-Ts-FHCsyn的识别。

幽门螺杆菌转基因克隆1-5中提取的质粒被用EcoRV和BamHl消化。pb128and pHel2-IEC-Ts-FliCsyn所用的预期限制性图谱包括6kb、5kb和2.7kb脱氧核糖核酸片段。没有观察到正确的限制性图谱。作为参考，用于从大肠杆菌提取的pB128(6kb)和pHel2-IEC-Ts-FliCsyn的限制性图谱(5kb和2.7kb)被提供，其被EcoRV和BamHl消化（EB）或未消化（U）。

图33显示B128pHel2-IEC-Ts-FliCsyn转基因的蛋白质印迹。(A)（A）FliCsyn(55kDa)被使用1/1000稀释的多克隆兔抗FliC抗血清检测，并且(B)TetRs(23kDa)被使用1:1000稀释的多克隆兔抗TetR抗体检测。细菌被通过添加50ng/ml无水四环素(ATc)诱导。幽门螺杆菌B128充当阴性对照(neg)。

图34显示在幽门螺杆菌中的TetR调节Cve/lox切除系统的示意图。Tet阻遏物的组成型表达被在mdab基因座的PamiE驱动。Cre重组酶表达被在trpA基因座的tet应答的启动子uPtetO控制。Cre的四环素诱导表达将导致侧翼为整合在ureBI基因座的lox66和lox71位点(Lox6671盒)PureA-dapA融合的切除。

序列描述

在本文中引用下列核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO:l pMdaB-衍生物，其来自pBlu-SK-alt，含有与HP0630和HP0631同源的区域，并且含有多克隆位点。

SEQ ID NO:2pMdaB-RC AT-衍生物，其来自pMdaB，rpsL-CA T。

SEQ ID NO:3pMdaB-ptetRl-衍生物，其来自pMdaB，PamiE-revtetR。

SEQ ID NO:4pMdaB-ptetR2-衍生物，其来自pMdaB，PamiE-tetR。

SEQ ID NO:5pMdaB-ptetR3-衍生物，其来自pMdaB，PfiaA-revtetR。

SEQ ID NO:6pMdaB-ptetR4-衍生物，其来自pMdaB，PflaA-tetR。

SEQ ID NO:7pMdaB-ptetR5-衍生物，其来自pMdaB，PtaTaat-revtetR。

SEQ ID NO:8pMdaB-ptetR6-衍生物，其来自pMdaB，PtaTaat-tetR。

SEQ ID NO:9pMdaB-ptetR7-衍生物，其来自pMdaB，PtaCaat-revtetR。

SEQ ID NO:10pBlu uPtetOl-GFP-衍生物，其来自pBlu-BI，PtetOl-GFP。

SEQ ID NO:11pBlu_uPtet02-GFP-衍生物，其来自pBlu-BI，uPtet02-GFP。

SEQ ID NO:12pBlu_uPtet03-GFP-衍生物，其来自pBlu-BI，uPtet03-GFP。

SEQ ID NO:13pTr-衍生物，其来自pBlu-SK-alt，含有与HP1277同源的区域，并且含有多克隆位点。

SEQ ID NO:14pTrpA-RCAT-衍生物，其来自pTrpA，rpsL-CAT。

SEQ ID NO:15pGltDH-衍生物，其来自pBlu-SK-alt，含有与HP0379和HP0380同源的区域，并且含有多克隆位点。

SEQ ID NO:16pGltDH-RCAT-衍生物，其来自pGltDH，rpsL-CAT。

SEQ ID NO:17pHdapB-衍生物，其来自pHSG576,含有与HP0509和HP0511同源的区域，并且含有多克隆位点。

SEQ ID NO:18pHdapB-RCAT-衍生物，其来自pHdapB,rpsL-CAT。

SEQ ID NO:19urePtetOI-尿素酶启动子，其携带两个四环素操纵子插入位点,分别在-35之前，和在-35和-10之间。

SEQ ID NO:20urePtetOII-尿素酶启动子，其携带one四环素操纵子插入位点,在-35和-10之间。

SEQ ID NO:21urePtetOIII尿素酶启动子，其携带three四环素操纵子插入位点,分别在-35之前，在-35和-10之间，和在-10之后。。

SEQ ID NO:22urePtetOIV-尿素酶启动子，其携带two四环素操纵子插入位点，分别在-35和-10之间，和在-10之后。

SEQ ID NO:23urePtetOV-尿素酶启动子，其携带one四环素操纵子插入位点,在-10之后。

SEQ ID NO:24tetl ptetR构建。

SEQ ID NO:25tet2ptetR构建。

SEQ ID NO:26tet3ptetR构建。

SEQ ID NO:27tet4ptetR构建。

SEQ ID NO:28tet5ptetR构建。

SEQ ID NO:29tet6ptetR构建。

SEQ ID NO:30tet7ptetR构建。

SEQ ID NO:31tet8ptetR构建。

SEQ ID NO:32tet9ptetR构建。

SEQ ID NO:33tetlO ptetR构建。

SEQ ID NO:34tetl1ptetR构建。

SEQ ID NO:35tetl2ptetR构建。

SEQ ID NO:36tetl3ptetR构建。

SEQ ID NO:37tetl4ptetR构建。

SEQ ID NO:38mbtet正向引物，其用于克隆ptetR进入pBlu mdaB。

SEQ ID NO:39mbtet反向引物，其用于克隆ptetR进入pBlu mdaB。

SEQ ID NO:40ureArcatl，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:41ureArcat2，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:42ureArcat3，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:43ureArcat4，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:44ureArcat5，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:45ureArcat6，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:46ureArcat7，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:47ureArcat8，用于灭活ureA，其利用repsL-CAT。

SEQ ID NO:48ureAtetOl，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:49ureAtet02，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:50ureAtet03，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:51ureAtet04，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:52ureAtet05，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:53ureAtet06，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:54ureAtet07，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:55ureAtet08，其用于重构ureA启动子。

SEQ ID NO:56urePseq引物，其用于测序ureAB启动子。

SEQ ID NO:57tetOGFPl，其用于构建uPtetO-GFP。

SEQ ID NO:58tetOGFP2，其用于构建uPtetO-GFP。

SEQ ID NO:59tetOGFP3，其用于构建uPtetO-GFP。

SEQ ID NO:60tetOGFP4，其用于构建uPtetO-GFP。

SEQ ID NO:61tetOGFP5，其用于构建uPtetO-GFP。

SEQ ID NO:62tetOGFP6，其用于构建uPtetO-GFP。

SEQ ID NO:63MdaBl是pMdaB克隆载体。

SEQ ID NO:64MdaB2是pMdaB克隆载体。

SEQ ID NO:65MdaB3是pMdaB克隆载体。

SEQ ID NO:66MdaB4是pMdaB克隆载体。

SEQ ID NO:67GltDHl是pGltDH克隆载体。

SEQ ID NO:68GltDH2是pGltDH克隆载体。

SEQ ID NO:69GltDH3是pGltDH克隆载体。

SEQ ID NO:70GltDH4是pGltDH克隆载体。

SEQ ID NO:71TrpAl-pTrpA克隆载体。

SEQ ID NO:72TrpA2-pTrpA克隆载体。

SEQ ID NO:73TrpA3-pTrpA克隆载体。

SEQ ID NO:74Trp A4-pTrpA克隆载体。

SEQ ID NO:75DapBl-pHdapB克隆载体。

SEQ ID NO:76DapB2-pHdapB克隆载体。

SEQ ID NO:77DapB3-pHdapB克隆载体。

SEQ ID NO:78DapB4-pHdapB克隆载体。

SEQ ID NO:79DapB5-pHdapB克隆载体。

SEQ ID NO:80DapB6-pHdapB克隆载体。

SEQ ID NO:81MS Ndel-Cre-正向引物，其用于构建pTrpA-uPtet02-Cre。

SEQ ID NO:82MS Cre-Sall-反向引物，其用于构建pTrpA-uPtet02-Cre。

SEQ ID NO:83MS_ureBseq-正向引物，其用于Lox盒。

SEQ ID NO:84MS_urelseq-反向引物，其用于Lox盒。

SEQ ID NO:85MS Ndel-FliC-正向引物，其用于构建pMA-IEC-Ts-FliCsyn。

SEQ ID NO:86MS FliC-Sall-反向引物，其用于构建pMA-IEC-Ts-FliCsyn。

SEQ ID NO:87Cre，幽门螺杆菌密码子优化的。

SEQ ID NO:88Lox6671盒。

SEQ ID NO:89tetRs，幽门螺杆菌密码子优化的。

SEQ ID NO:90luPtet05。

SEQ ID NO:912uPtet05。

SEQ ID NO:923uPtet05。

SEQ ID NO:934uPtet05。

SEQ ID NO:945uPtet05。

SEQ ID NO:956uPtet05。

SEQ ID NO:96pTrpA-as4uPtet05-Cre。

SEQ ID NO:97IEC-LLO。

SEQ ID NO:98fliCsyn，幽门螺杆菌密码子优化的。

SEQ ID NO:99IEC-Ts-fliCsyn。

SEQ ID NO:100pHel2-IEC-Ts-FliCsyn。

术语定义

如本文中使用的，某些术语可以具有以下限定的含义。除非在上下文中另外进行了清楚说明，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式"a"、"an"和"the"包括复数参考。例如，术语"一细胞"包括多个细胞，包括其混合物。同样，如这里所述使用"一化合物"用于治疗或制备药物包括使用本发明的一种或多种化合物用于这种治疗或制备，除非上下文中另外进行了清楚说明。

如本文中使用的，术语"包括"意图是指该组合物和方法包括列举的元件然而并非排除其它的。"基本上由...构成"当用于限定组合物和方法时，应该是指排除其它任何对该组合具有实质重要性的元件。因此，基本上由这里所限定的原件构成的组合物不会排除来自分离和净化方法的痕量染污物和药用可接受的载体如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。"由...构成"应该意指排除其它成分的微量元素和实质的方法步骤用于给药本发明的组合物。通过这些过渡术语所限定的实施方案在本发明的范围之内。

幽门螺杆菌的全部菌株被归入本申请的范围，只要它们具有功能性尿素酶基因。特别地优选的幽门螺杆菌菌株包括选自以下列ATCC索取号保藏于美国模式培养物保藏中心(ATCC)的菌株：43504;43504D-5;43526;43579;43629;49396;49503;51110;49503;51111;51407;51652;51653;51932;和53727。还参见例如，美国专利No.:5,459,041，通过参照引入本文。其它优选的幽门螺杆菌菌株包括以下列索取号保藏于国家测量局的幽门螺杆菌菌株：V09/009101;V09/009102;V09/009103;V10/014059;V10/014060和V09/009104。

如本文中使用的，术语"分离"用于描述幽门螺杆菌细胞、多核苷酸或多肽，其在这样的环境中，该环境不同于幽门螺杆菌细胞、多核苷酸或多肽自然地存在的环境。分离的遗传修饰的幽门螺杆菌细胞可以是存在于幽门螺杆菌细胞的混合种群中。

"遗传修饰的"幽门螺杆菌是指一种幽门螺杆菌细菌，其在他的表型和/或基因型方面不同于相应野生型幽门螺杆菌的那些。更具体地说，本发明的遗传修饰的幽门螺杆菌是已经用本发明基因构建体转化的那种。细菌，通常包括幽门螺杆菌，的遗传修饰方法是本领域众所周知的;参看例如Sambrook,J.and Russell,D.W.(2001),"Molecular Cloning-A LaboratoryManual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,3rd Edition.

术语"尿素酶"或"尿素酶操纵子"是指编码幽门螺杆菌尿素酶的基因，其已经被描述和测序（参见例如，Labigne等人,(1991),J.Bacteriol.,173:1920-1931)。在涉及尿素酶表达和分泌的七个基因中，仅仅两个基因编码该尿素酶的两个结构亚基尿素酶A和B。这两个多肽形成多肽复合物(操纵子)，其具有尿素酶活性。

尿素酶活性可以通过许多方式进行测定。例如，众所周知尿素酶转化脲为碳酸铵，其然后分解成氨水和二氧化碳。因此，过去一个为检测幽门螺杆菌的试验包括下列步骤：使胃材料样品接触包含脲和指示剂（即当pH提高时会改变颜色的酸碱指示剂）的组合物。如果尿素酶存在于胃材料中时，它分解脲，其导致在进一步分解后形成氨水，并且造成酸碱指示剂改变颜色。幽门螺杆菌尿素酶活性还可以通过为受试者口服给药脲随后监控所释放的二氧化物和氨水来进行检测。各种用于测试尿素酶活性的实验描述于美国专利No.4,748,113和US专利申请No.20030082664，其引入本文作为参考。

本文中所使用的术语"功能片段"是指任何多核苷酸、多肽等的片段(即与自然村在的形式尺寸方面降低或截断），其仍与自然村在的分子以相同方式发挥功能的能力。

本文所使用的术语"核酸"是指任何长度的核苷酸聚合物形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸。因此，这个术语包括但不局限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或这样一种聚合物，其包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、化学上或生物化学修饰的非天然的或衍生的核苷酸碱基。

术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"在本文可互换地使用并且是指任何长度的氨基酸聚合物形式，其可以包括编码和非编码氨基酸，化学上或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰肽主链的多肽。

两个氨基酸序列或两个核酸的"同一性百分比(同源性）"是使用下列算法测定的：arlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990,修改于Karlin&Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877,1993)。该算法被结合进Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)。用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，记分=100,词长=12，获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，记分=50，词长=3，获得与参考多肽同源的氨基酸序列（例如SEQ ID NO：2）。为获得用于比对的缺口比对，Gapped BLAST被进行利用，如下列所述：Altschul等(Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,1997)。在利用BLAST和Gapped BLAST程序是，各自程序的缺省参数(例如XBLAST和NBLAST)被使用。这些可以按照超级链接地址"ncbi.nim.nih.gov"在万维网上发现。

如本文中使用的，术语"外源核酸"是指一种核酸，其本质上不会通常或自然发现和/或通过幽门螺杆菌生产。如本文中使用的，术语"内源核酸"是指一种核酸，其本质上通常或自然发现和/或通过幽门螺杆菌生产。"内源核酸"还称为"天然的核酸"或相对于幽门螺杆菌为"天然的"的核酸。

如本文中使用的，术语"异源核酸"是指这样一种核酸，其中以下中的至少一个是真实的:(a)该核酸对于幽门螺杆菌是外来的("外源的")(即未自然地发现);(b)该核酸包括自然发现在幽门螺杆菌中的核苷酸序列(例如是"内源的"）(例如该核酸包括幽门螺杆菌内源的核苷酸序列)，但是可以以非自然的量(例如大于预期或者大于自然地发现的量）产生于细胞中，或在序列方面与内源的核苷酸序列不同，以便与内源发现的蛋白相同的编码蛋白质(具有相同的或者基本上相同的氨基酸序列)被以非自然的量产生于细胞中(例如大于预期或者大于自然地发现的量）;(c)该核酸包括两种或更多种未以本质上彼此相同的关系发现的核苷酸序列或区段(segment)，例如该核酸是重组体。

如本文中使用的，"重组体"意思指一种特别的核酸(DNA或RNA)是各种的综合克隆、限制性酶切和/或连接步骤的产物导致一种构建体，其具有结构上的编码或非编码序列，其与自然系统中发现的内源的核酸可区分开。通常，编码该结构上的编码序列的DNA序列可以被从cDNA片段和短的低聚核苷酸连接子装配，或从一系列合成寡核苷酸装配，以提供一种合成核酸，其能够从一种包含于细胞或在非细胞转录和翻译系统中的重组转录单元表达。这种序列可以以开放读框的形式提供，该开放读框被内部的非翻译序列或内含子（通常存在于真核类基因）的连起来。包括有关序列的基因组DNA还可以用于形成重组体基因或转录单元。非翻译DNA的序列可以存在于开放读框的5'或3'端，在此处这种序列不妨碍编码区的操作或表达，并且可能实际上会通过各种的机制发挥作用调节期望的产物的生产。

因此，例如术语"重组体"多核苷酸或"重组体"核酸是指一种不是自然存在的核酸，例如是通过人工综合两种通过人的干预以其他方式分割的区段(segment)序列。这个人造的组合常常是通过化学合成方式或者通过人工操作分离的核酸片段例如通过遗传工程技术完成的。这样通常是用于用编码相同或保守氨基酸的简并密码子替换密码子，同事通常会引入或除去序列识别位点。或者，通常进行是为了将具有期望功能的核酸区段连接在一起以形成期望的功能组合。这个人造的组合常常是通过化学合成方式或者通过人工操作分离的核酸片段例如通过遗传工程技术完成的。

同样，例如术语"重组体"多肽是指一种多肽，其不是自然存在的核酸，例如是通过人工综合两种通过人的干预以其他方式分割的氨基酸区段(segment)序列。因此，例如包括异源的氨基酸序列的多肽是重组体。

"载体"是指一种重组体核酸，通常重组DNA，其已经为了表达和/或传播具体的核苷酸序列而形成，或将用于构造其它重组体核苷酸序列。

术语"DNA调节序列"、"控制元件"和"调控元件"可互换地在这里使用，是指转录和翻译控制序列如启动子、增强因子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等，其在幽门螺杆菌细胞中准备和/或调节表达编码序列和/或生产编码多肽。

术语"tet"、"tet阻遏物"或者"TetR"在这里可互换地使用并且是指tet阻遏物诱导系统。

术语"转化"是与"遗传修饰"可互换地使用并且是指一种永久的或暂态在幽门螺杆菌细胞中在引入新核酸后诱导的遗传变化。

遗传变化("修饰")可以通过下列完成：将新DNA结合入幽门螺杆菌细胞基因组中，或通过暂态或稳定的维持新DNA作为附加元件如质粒或者表达载体，其可能包含一种或多种选择性标记以帮助它们维持在重组体幽门螺杆菌细胞中。遗传修饰的适当的方法包括转染、接合、原生质体融合、电穿孔法、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。这些方法的一般讨论可以发现在：Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology，第三版本,Wiley&Sons,1995。

如本文中使用的，"转化核酸序列"是指一种质粒载体，或其它表达盒，其包含编码本发明基因构建体的核酸序列。在一些本发明的实施方案中，该核酸序列可以编码一种或多种抗原。"转化核酸序列"还可以用来是指根据本发明某些实施方案的"转基因"。在本发明的另一实施方案中，转化核酸序列包括核酸序列，其编码启动子和/或其它调控元件。

"基因构建体"是一种核酸序列包括至少两种元件(a)启动子序列和(b)目的DNA序列，优选地编码尿素酶亚基A和B的操纵子。在一些实施方案中，基因构建体还包括(c)基因终止序列。

"可操作连接"是指毗连，其中所描述的组分保持这样一种关系，即允许它们以其预定的方式发挥功能。例如，启动子可操作连接至编码序列，如果启动子实现其转录和表达。如本文中使用的，术语"异源的启动子"和"异源的控制区域"是指通常本质上与特定核酸无关的启动子及其他控制区域。例如"对于编码区异源的转录控制区域"是一种转录控制区域，其通常本质上与编码区无关。

术语"启动子"，在引用本发明的基因构建体使用时，是指一种多核苷酸序列能够调节目的DNA序列或尿素酶操纵子在幽门螺杆菌中体外和体内表达。更具体地说，启动子序列已经修饰成包括这里所限定的四环素(tet)操纵子序列。在一些实施方案中，启动子是幽门螺杆菌内源的。在一些实施方案中，该启动子选自amiE启动子、核心尿素酶启动子、revtetR启动子和flaA启动子。

术语"保守氨基酸替换"是指在蛋白质中，具有相似侧链氨基酸残基的互换性。例如具有脂族侧链的氨基酸组由以下组成：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的氨基酸组由以下组成：丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组由以下组成：天门冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组由以下组成：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性的侧链的氨基酸组由以下组成：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组由以下组成：半胱氨酸和蛋氨酸。保守氨基酸替换的示范性组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天门冬酰胺-谷氨酰胺。

"疫苗组合物"、"疫苗"、"免疫原组合物"和类似术语是指一种组合物包括活的菌株、表达本发明基因构建体的遗传修饰的幽门螺杆菌，由此当为动物给药时，幽门螺杆菌将建立慢性感染和引起哺乳动物中抵抗幽门螺杆菌本身或这里所描述目的DNA表达产物的免疫反应，例如，如果目的DNA编码抗原，则哺乳动物中的免疫反应将抵抗幽门螺杆菌中的抗原，由此，提供抵抗抗原的至少部分保护性免疫。这样的保护性免疫可以由各种可观察到的或可检测的状态证明，包括但不限于：一种或多种病征的减少、较短的病程、组织损伤的减少、健壮组织的再生、致病微生物从哺乳动物的清除以及哺乳动物良好状态感觉的提高。虽然高度地期望，本领域技术人员可以理解没有疫苗预计在每个被给药疫苗的个体中诱导完成保护免于疾病，或者保护性免疫预计持续个体的整个人生而没有周期性"增强型"给药疫苗组合物。同时可以理解的是，包含本文中所述的遗传修饰的幽门螺杆菌活疫苗可以按照专业保健医生的意愿施用于没有呈现病症但是被认为是在感染危险中或已知已经暴露于疾病例如接近或接触感染哺乳动物或污染空气、液体或表面的个体。

如这里所述"治疗有效量"的遗传修饰的本发明幽门螺杆菌理解为包括有效的引起期望响应但是不足以引起中毒反应的量。期望响应例如可能构成在血样中形成足够的和/或可接受的可检测的抗体滴度水平。施用于哺乳动物的制剂的剂量和治疗持续时间可以通过照料需要治疗哺乳动物对象的专业保健医生来确定，并且将考虑对象的年龄、性别和重量以及具体的幽门螺杆菌和表达的核酸分子。

术语"口服的"、"肠内的"、"经肠道"、"经口"、"非肠胃外的"、"非肠道外"等实质通过沿着消化道的路线或模式为哺乳动物给药遗传修饰的本发明幽门螺杆菌。口服给药疫苗组合物的途径的实例包括但不限于从口腔吞咽液体或固体形式疫苗组合物通过鼻空肠管（nasojejunal）或胃造口术管给药疫苗组合物，十二指肠内给药疫苗组合物和直肠给药例如使用释放本文中所述的活菌苗菌株到消化道的下肠道的栓剂。

术语"诱导针对抗原的免疫耐受性"包括粘膜输送目的DNA的产物例如抗原，通过分泌所述产物的分离的遗传修饰的幽门螺杆菌，用于制备用于粘膜输送的药物、医疗食品和保健食品。

"异源的"抗原是对于幽门螺杆菌而言非天然的，即本质上不是由幽门螺杆菌表达或者在引入幽门螺杆菌之前未表达的。

如本文中使用的，"可检测的免疫反应"是形成于哺乳动物中应答抗原的抗体(体液的)或细胞溶解(细胞的)响应，其可以使用常规实验室方法测量包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、酶联ImmunoSPOT(ELISPOT)、免疫荧光法分析(IFA)、补体结合分析(CF)、蛋白质印迹(WB)或其等同。

如本文中使用的，"在粘膜形成集落"是指本发明的螺杆菌在哺乳动物组织衬里建立感染优选地慢性感染的能力包括但不限于颊粘膜、食道的粘膜、胃粘膜、鼻粘膜、支气管的粘膜和子宫内膜。优选地，粘膜是胃粘膜。

如本文中使用的，"慢性感染"意思指具有周或月左右的长持续时间的感染，这与持续若干天左右的短时期的"急性感染"或"暂态感染"相反。

优选的实施方案的描述

在详细地描述本发明前，应将理解的是本发明不局限于特别地例证的方法并且当然可以改变。同样应当理解，本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案的目的，，并且不意图用于进行限制仅仅由所附权利要求限制的范围。

全部在这里引用的出版物、专利和专利申请，无论在上或在下，都通过参照以其全部内容引入本文。然而，本文中提及的出版物是为了描述和公开在这些出版物中所报道并且可以在本发明中使用的规程，试剂和载体的目的而引用。但并不承认任何内容使得本发明可以被之前的发明所公开。

此外，本发明的实践使用，除非另有陈述，药理学、分子生物学(包括重组体技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统方法，其在本领域技术人员的技能范围内。这些技术是本领域技术人员众所周知，并且在文献中完全地说明。见例如Coligan等"Current protocols in Protein Science"(1999)Volume I和II(John Wiley&Sons Inc.)；Sambrook等,(MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd&3rd Editions,Cold Spring HarborLaboratory press(1989)(2001)；和Bailey,J.E.and Ollis,D.F.,BiochemicalEngineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait,ed.,1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney,等，1987)；"Methods in Enzymology"系列(Academic Press,Inc.)；"Handbook of Experimental Immunology"(D.M.Weir&C.C.Blackwell,eds.)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等,eds.,1987和期刊)"Polymerase Chain Reaction"(Mullis等,eds.,1994)；和"Current Protocols in Immunology"(J.E.Coligan等,eds.,1991)。

在广泛的方面中，本发明提供了一种基因构建体，该基因构建体沿着5'至3'的方向包括:(a)启动子序列和(b)目的DNA序列，其中所述启动子序列包括能够在Helicobacter pylori中调节所述目的DNA序列表达的多核苷酸序列，以及其中所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)DNA序列目的序列。

如在别处描述的，优选的启动子是来自幽门螺杆菌的启动子，其能够调节启动子下游的基因表达。

特别优选的启动子是与尿素酶操纵子特别是UreA有关的那些。分离启动子的方法在本领域中是众所周知的，但是

通过标准技术从分离的幽门螺杆菌中获得的简略基因组DNA被插入合适的穿梭载体中，例如具有选择性标记的穿梭质粒例如抗生素标记。

广泛地，适当的穿梭载体将包括一个、两个、三个或更多个以下特征：克隆位点、幽门螺杆菌复制起点、大肠杆菌复制起点和抗生素抗性基因和/或选择性标记。适用于这个目的或容易地能适应的这些目的的本领域已知的载体包括例如重组体穿梭质粒pHR106，其被描述于Roberts等{Appl EnvMircobiol,54:268-270(1988))；PJIR750和PJIR751质粒，其被描述于Bannam等{Plasmid,29:233-235(1993))；无启动子的PPSV启动子选择载体，描述于Matsushita等(Plasmid,31,317-319(1994))；穿梭质粒pJIR1456和pJIR1457,描述于Lyras等{Plasmid,39,160-164(1988))；和pAK201穿梭载体，描述于Kim等{Appl Environ Microbiol,55,360-365(1989)，其内容以其全部内容引入本文作为参考。幽门螺杆菌复制起点的除去将该穿梭载体转化为自杀载体。

然后启动子被改变或修饰以引入四环素{tet)操纵子序列的编码序列。启动子的改变可以使用本领域已知的方法产生，如低聚核苷酸介导(定点)诱变和PCR诱变。Site定点诱变(Carter等,(1986),Nucleic Acids Res.,13:4331；r et al.,(1987),Nucl.Acids Res.,10:6487)，盒式诱变(Wells等,(1985),Gene,34:315)，限制性选择诱变(Wells等,(1986),Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415)或其它已知的能够在克隆的DNA进行以产生尿素酶变体DNA的技术。

银弹四环素(tet)操纵子序列的编码序列已经引入，则产生了本发明的基本基因构建体。然后，核酸转移规程被使用包括转化/转染、电穿孔法、脂质体介导核酸转移、N-[l-(2,3-Dioloyloxy)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐介导的转化和其它的将基因构建体引入所选择的幽门螺杆菌中的方法。根据在本领域中的知识和设计选择，本领域技术人员将容易地能够选择合适的工具和方法用于选择已经成功被转化的幽门螺杆菌。

在本发明的一个实施方案中，遗传修饰的幽门螺杆菌被修饰成幽门螺杆菌在哺乳动物宿主饮食中需要甘露糖和/或半乳糖补充以便保持幽门螺杆菌感染。如在其他部分所描述的，本发明的一个目的是生产遗传修饰的幽门螺杆菌，其能够安全地用作生物学的运载工具用于表达外来的肽例如抗原。为了这个目的，幽门螺杆菌菌株被要求可以建立粘膜感染哺乳动物足够长时间，以便表达肽。一旦遗传修饰的幽门螺杆菌已经表达外源试剂，则优选将其除去。除去该遗传修饰的幽门螺杆菌的一种方式是使用本文中所述的tet系统。另一方法是使用糖旁路。螺杆菌染色体组分析表明甘露糖仅仅由葡萄糖制成。众所周知幽门螺杆菌LPS被修饰有Lewis抗原(岩藻糖和半乳糖)，这对于形成集落以及通过树状细胞的DC信号受体的免疫调节而言是必要的。因此，LPS的Lewis抗原的代谢控制可以分别提供幽门螺杆菌集群现象的控制/根除和免疫的调节。在一个实施方案中，幽门螺杆菌的磷酸甘露糖异构酶(ΗΡ0043)被删除以生产遗传修饰的幽门螺杆菌，其需要甘露糖补充以保持形成集落。

现将仅仅通过参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。然而，应该理解下面的实施例是说明性的，并且将不会以任何方式作为对本文中所述发明的共性进行限制。

实施例1构建表达TetR和revTetR的幽门螺杆菌菌株

为了表达四环素抑制子，选择了四个不同的幽门螺杆菌启动子，amiE,flaA以及野生型和突变的尿素酶操纵子的核心启动子(Davies et al.2002)。通过多重融合PCR，将编码tetR和revtetR的序列融合到每个幽门螺杆菌启动子，以产生一组启动子-tetR(ptetRl-^)构建体(图1)。将这些构建体克隆到pMdaB质粒中，产生质粒pMdaB-ptetR1-8(图11)。利用这些质粒自然转化受体菌株幽门螺杆菌X47(X47mdaB::rpsL-CAT)允许将ptetR(l-7)启动子在mdaB基因座插入到染色体中，通过同源重组。通过免疫印迹分析在这些X47mdaB::ptetR菌株中TetR和revTetR的表达。与大肠杆菌阳性对照(pos)相比，在X47mdaB::ptetR菌株中，TetR的表达显著低(图2和图10)。TetR表达菌株的信号强度大于等同的revTetR表达菌株。

实施例2构建幽门螺杆菌四环素应答启动子

为了产生四环素应答启动子，将一个以上tet操纵子(tetO)序列引入到ureA启动子序列中，同时尽力最小化对关键启动子元件的破坏。对于引入tetO，鉴定了3个主要位点，-35盒上游，-35盒和-10盒之间，以及恰好转录起始位点的下游(图3A)。设计了两组tet应答启动子。第一组tet应答启动子uPtetO(l-3)被设计成驱动和调节靶基因在幽门螺杆菌染色体的任意位置表达。它们由在-10盒以及一个以上tetO位点包含C至T突变的核心ureA启动子组成(图3B)。第二组组tet应答启动子urePtetO(l-V)被设计成调节，ureA和ureB(尿素酶操纵子)在它们原始基因座的表达。设计并构建了在不同位点含有最多达到3个tetO位点的多个启动子构建体，其利用PCR方法(图3C)并且用于产生X47幽门螺杆菌菌株，其在ureA启动子中携带一个以上tetO位点，命名urePtetO。

uPtetO启动子在不存在tet抑制子时的强度在三个不同受体基因座进行分析，其采用报告基因gfp(mui2)(Cormack et al.1996)。GFP活性在携带uPtetOl的X47中比具有uPtetOl的菌株更强，并且GFP活性的定量显示uPtetO1和uPtetO2的强度也依赖于受体基因座，因为GFP活性在从trpA基因座表达GFP的菌株中比gltDH和dapB基因座要更强(图4)。urePtetO{\-V)菌株的尿素酶活性被评估，使用尿素酶活性检验，并且与野生型亲本菌株进行比较(图5)。在携带urePtetOl,II和V的菌株中尿素酶活性与野生型亲本菌株类似，而尿素酶活性在具有urePtetOlll的菌株中要低75%，而在具有urePtetOTV的菌株中要低40%。为了排除二次突变的出现，其在遗传改造X47urePtetO菌株过程中出现，会影响形成集落并且为了检验何种尿素酶表达水平对于集落形成是必须的，对重组菌株进行评估它们在C57BL/6J小鼠中形成集落的能力(图5)。在口服攻击后一个月，评估胃部集落负载。所有菌落都从小鼠胃中成功地重新分离。在菌落urePtetOTV和urePtetOlll中感染率和负载均下降。最后，ureA启动子区域被在从感染小鼠胃部重新分离的克隆中进行测序，并且发现urePtetO序列在小鼠中传代后仍然是稳定的。（数据未显示）

实施例3利用ATc在幽门螺杆菌中调节uPtetO

使用GFP作为报告基因以评估uPtetOl和uPtetO!启动子的诱导和抑制能力。X47mdaB::ptetR受体菌株被uPtetO-GFP构建体转化以产生一批表达GFP和TetR的菌株（表1）

表1

具有四环素应答GFP表达的X47菌株

无水四环素(ATc),四环素的衍生物具有对于TetR和revTetR二者很高的结合亲合性和低毒和抗菌活性(Gossen&Bujard1993；Kamionka等2004)，用作诱导物以测量uPtetOl和uPtetOl的诱导和抑制。基于观察到的荧光强度，添加50ng/mL ATc至血琼脂板导致分别在表达TetR或revTetR菌株中诱导或抑制GFP表达。添加100ng/mL ATc至生长在BHI培养基中的表达TetR的菌株导致对于forptetRl uPtetOl4-9倍诱导GFP表达，对于forptetR4uPtetOl为13-80倍，在所有三个受体基因座的foldptetR6uPtetOl为2-5倍。对于uPtetOl菌株GFP诱导低得多，对于ptetRl为1.5-3倍，forptetra为3-8倍，对于forptetR6是3-8倍(图6)。然而，在表达TetR的菌株中GFP活性没有到达缺少TetR时观察到的水平，这是当uPtetO\-GFP位于TrpA基因座最值得注意的(图6A)。

实施例4在幽门螺杆菌中诱导uvteto是剂量和时间依赖的

在幽门螺杆菌中进一步表征tet诱导型表达系统是通过increasing诱导物浓度和通过评估在若干不同的时点的报告基因的表达而进行的。在存在不同的浓度的ATc时生长细菌。GFP活性的量化证明100ng/mL ATc的浓度产生最大的GFP活性(图7A)。

用25ng/ml ATc诱导导致降低2.4倍的GFP活性。这些实验证明诱导是剂量依赖的并且最大的诱导可以在浓度为100ng/mL ATc时获得。此外，如同在液体培养中测量的，利用低于最小抑菌浓度(MIC)10倍的浓度ATc到达最大的诱导。

圆盘扩散分析用来证明通过ATc诱导GFP表达。注射ATc的圆盘置于含有ptetRl和uPtetO\-GFP的细菌菌苔上。在培养24小时之后，GFP表达的晕圈在每个圆盘周围是明显的。并且通过在表达TetR的菌株中进行免疫印迹来分析uPtetOl-GFP诱导的动力学(图7B)。在包含ptetrl和ptetra的细菌中，在添加Atc之后16小时观察到最大的GFP活性。含有ptetR6的细菌显示强大的但是延缓诱导诱导。

这些实验表明uPtetOl-GFP的诱导是时间依赖并且诱导的动力学依赖ptetR构建体的。

实施例5测试对于条件基因互补受体菌株的体内形成集落能力

为了排除将影响形成集落的二次突变的发生，以及为了评定GFP指示基因在tet可诱导的转录的控制下的表达稳定性，重组体菌株被评估它们在C57BL/6J小鼠形成集落的能力。动物被填喂X47mdaB::ptetR5受体菌株，其被转化pTrpA-uPtetO\-GFP,pGltDH-uPtetOl-GFP或pHdwpB-uPtetOl-GFP。表达GFP的细菌被成功地再分离，在感染后1周，用于所有菌株测试(数据未显示)。

实施例6基于四环素诱导型表达的尿素酶表达调节

在幽门螺杆菌中，尿素酶表达的调节被在X47mdaB::ptetR受体菌株中被研究，其被转化urePtetO构建体以形成一系列包含修饰的ureA启动子并且表达TetRs(表2)的菌株。

表2

具有四环素应答ureA和ureB表达的X47菌株

通过免疫印迹和尿素酶活性检验分析ATc对urePtetO启动子的调节。免疫印迹显示在携带TetR抑制子的菌株中限制ATc之后（Tet-ON系统）(图8A)，以及在携带revTetR抑制子的菌株中添加ATc之后（Tet-OFF系统）(图8B)，UreB亚基的量会降低到检测限制以下。对于Tet-OFF系统的构建体I、II和V，观察到了不完全抑制(图8B)。携带ptetRi的菌株没有展示出对ATc的应答（数据未显示）。

在不存在ATc时，Tet-ON菌株的尿素酶活性(图8C-E)降低到2U/mL的检测限制以下。添加ATc完全恢复了下列菌株中的尿素酶活性：ptetR2；urePtetOW(图SC)，ptetRi；urePtetOl，II and III(图8D)。尿素酶活性在下列菌株中仅仅部分被恢复：ptetR2\urePtetOl和V(图^C\ptetR3；urePtetOTV(图8D)andptetR&，urePtetOV(图8E)。其他Tet-ON菌株尿素酶活性比野生型尿素酶活性低10%。Tet-OFF菌株的尿素酶活性降低到野生型亲本X47菌株的35%和10%之间。

实施例7在幽门螺杆菌中诱导urePtetO是剂量和ptetR依赖的

更灵敏的尿素酶平板检验用于检测残余尿素酶活性以及在存在不同浓度ATc时Tet-ON菌株的urePtetO诱导的低水平。对于ptetRA菌株，浓度1ng/mL的ATc足以诱导所有5个urePtetO启动子，但是尿素酶活性在浓度超过25ng/mL时降低。在不存在ATc时，在24小时后，观察到非常低水平的尿素酶活性，并且在48小时后更显著。对于ptetR6菌株，分别对于urePtetOW和urePtetOTV在浓度为5ng/mL和10ng/mL时，24小时后，观察到尿素酶活性。由于诱导urePtetOlll的尿素酶活性仅仅在25ng/mL和50ng/mL时48小时后是明显的。在浓度超过50ng/mL时尿素酶活性会降低，并且在缺少ATc时，在48小时后对于所有三个urePtetO启动子都观察到了非常低水平的尿素酶活性。

尿素酶平板中所观察到的颜色改变是由于尿素酶的活性，如果平板接种预先诱导的mdaB::ptetR2；urePtetOW菌株会在接种30分钟内发生颜色改变。尿素酶活性是通过从置于接种未处理细菌的平板上圆盘扩散的ATc而诱导的，并且当接种尿素酶阴性X47ureA::rpsL-CA T菌株时，平板保持黄色。

实施例8幽门螺杆菌在体内忍受低水平四环素

文献调研显示使用四环素系统体内调节基因表达的最常见研究中使用多西环素(dox)而不是ATc作为诱导剂。

处于成本考虑，选择dox用于体内研究幽门螺杆菌tet系统并且进行先导试验以确定野生型幽门螺杆菌能够在C57BL/6J小鼠形成集落过程中忍受的最大剂量dox。动物口服灌注野生型亲本X47菌株，并且饮用水补充一系列范围浓度dox。在感染后一周，细菌负载在100ng/mL时显著降低，并且从补充100ng/mL的小鼠不能分离细菌(图9A)。在dox浓度超过1ng/mL时，细菌负载降低2个log，然而，在更长的感染点（2和4周），补充5ng/mL的小鼠中细菌负载与未处理的小鼠类似(图9B)。

实施例9在幽门螺杆菌中通过四环素体内诱导tet-诱导尿素酶

使用C57BL/6J感染模型评估通过dox调节urePtetO以驱动尿素酶的表达。小鼠口服若干Tet-ON，mdaB::ptetR；urePtetO菌株之一并且补充一系列范围dox浓度，其在X47的忍受范围内。尿素酶已知是形成集落必需的必要基因，并且因此Tet-ON urePtetO菌株不应该在不存在诱导剂时形成集落。许多初步试验证明dox能够体内诱导urePtetO(图9C-D)。菌株mdaB::ptetR4；urePtetOI和mdaB::ptetR6；urePtetON能够在感染一周后重新分离了，当动物分别补充0.1—5ng/mL和5-20ng/mL dox时。在感染后两周，菌株mdaB::ptetR4；urePtetO V能够从补充5pg/mL dox的动物重新分离(图9E)。感染urePtetO菌株依赖于dox补充(图9F)。小鼠在感染后补充dox两周，以建立成功的形成mdaB::ptetRA；urePtetOI的集落。在撤回dox补充物之后一天和三天，该菌株能够重新分离，并且在7天后不能够被分离(图9F)。感染菌株mdaB::ptetM；urePtetOI通过补充dox能够被维持至少4周。

实施例10根除策略

我们已经发现甘露糖的代谢是实现幽门螺杆菌根除的有希望的候选途径。事实上，螺杆菌基因组分析暗示甘露糖仅仅从葡萄糖制造。已知幽门螺杆菌LPS被Lewis抗原修饰(果糖和半乳糖)，其对于通过树突细胞的DC迹象受体的集落形成和免疫调控是关键的。因此，LPS的Lewis抗原的代谢控制能够分别提供对幽门螺杆菌形成集落/根除和免疫调控的控制。

图17，显示了制备用于幽门螺杆菌根除的糖旁路的过程，其中，甘露糖和半乳糖补充在饮食中维持了幽门螺杆菌敲入突变体。为了建立该旁路，两个幽门螺杆菌中缺少的酶被敲入到基因组中：己糖激酶用于对甘露糖在转入细胞后进行磷酸化，以及丙酮磷酸酶(GMP)。需要注意的是，幽门螺杆菌能够转运甘露糖，这允许在饮食中进行补充。与葡萄糖不同，甘露糖的血液含量非常低，其为微摩尔水平，而葡萄糖为5mM。

为了构建甘露糖糖旁路，幽门螺杆菌的磷酸甘露糖异构酶(HP0043)被删除。然而，HP0043是双功能酶，其还具有丙酮磷酸酶功能，其从甘露糖-1磷酸制备GDP-甘露糖。因此，将大肠杆菌的丙酮磷酸酶敲入以恢复代谢途径。同样，具有宽特异性的己糖激酶（酵母己糖激酶1）被敲入以磷酸化所转运的甘露糖为甘露糖-6-磷酸。

HP0043完全删除的突变体的产生是使用之前所述反向选择盒rpsl-cat而进行的。在UreAB基因座和Hxkl之间以及在UreB基因座之后设计表达GMP。基因修饰的序列由下列构成：

通过对基因组DNA进行诊断PCR，完成对基因修饰以及基因插入的确认。

利用或者没有甘露糖补充时，对甘露糖糖旁路重组菌株和野生型的Lewis抗原表达进行检验。图18清楚地显示甘露糖旁路基于Lewis抗原恢复在甘露糖补充后工作。

幽门螺杆菌重组菌株的形成集落的能力在小鼠模型中进行检测，在饮食中补充或不补充甘露糖时。需要注意的是，HP0043敲除菌株不能够以有力方式在小鼠形成集落(数据未显示)。

敲除HP0043:gmp(ureAB):hxkl(ureBI)的菌株生长在含有0.5%甘露糖的血琼脂上，收集并用于口服攻击5只小鼠的组。在攻击后一周处死小鼠，并且检验集落形成，其通过从胃匀浆培养细菌在琼脂Petri盘上。结果示于表3。

表3

饮食	形成集落小鼠(n=5)
		0%甘露糖	1/5
水中0.5%甘露糖	1/5
		水和食物中0.5%甘露糖	1/5
水中5%甘露糖	3/5

当饮用水中甘露糖浓度高达5%时，甘露糖补充恢复了敲除HP0043:gmp(ureAB):hxkl(ureBI)的集落形成。

重组菌株的不完全恢复有可能由于菌株的低尿素酶活性。事实上，在尿素酶操纵子插入两个基因hxkl和GMP干扰尿素酶活性。因此，通过合成由hxk1和GMP基因构成的新型操纵子对旁路进行重新构建，并且插入到幽门螺杆菌基因组的另一位置。

携带新甘露糖旁路的重组菌株发现恢复了在缺乏甘露糖补充时在LPS上生物合成Lewis抗原，以及在体外补充甘露糖后的生长灵敏（分别为图19和20）。尽管该结果没有预料，但他给我们提供了更高的代谢对照，因为细胞生长在添加甘露糖后以及生物合成Lewis抗原后被抑制。我们认为原因是甘露糖旁路非常有效地利用培养基中残余的甘露糖，但过多的甘露糖对于细胞是有毒性的。

我们进一步鉴定了所调节的途径，因为仅过表达己糖激酶会在仅存在甘露糖时抑制幽门螺杆菌的生长。目前所测试的其他糖不能抑制细胞生长，这强调了抑制机制是甘露糖特异性的。因此，似乎在幽门螺杆菌中，甘露糖-6-磷酸的紧密调节对于细胞生长是必需的。

为了评估，新甘露糖旁路的根除能力，利用携带甘露糖旁路的重组幽门螺杆菌攻击小鼠，在形成集落2周后，小鼠在饮用水中被喂养5%甘露糖，并且评估细菌负载。在甘露糖处理后，细菌负载降低1～2Log(图21)。

实施例11在幽门螺杆菌中的基因表达系统

利用TetR调节的Cre重组酶表达构建幽门螺杆菌菌株

为了在幽门螺杆菌中条件表达Cre重组酶，两个Tet应答启动子uPtetO1和uPtetOl被选择用于控制cre表达。它们由下列构成：核心尿素酶启动子，在-10盒含有C至T突变，以及正好在转录起始点的下游有一个tetO位点。uPtet02在-35和-10盒之间包含第二tetO位点。合成的幽门螺杆菌密码子优化版本的cre基因被扩增，并且克隆至质粒pTrpA-uPtetO1–GFP和pTrpA-uPtet02-GFP以替换GFP。利用这些质粒(pTrpA-uPtetO(1/2)-Cre)自然转化受体菌株幽门螺杆菌X47mdaB::ptetR2；trpA::rpsL-CAT允许uPtetO-cre整合融合在染色体中，其通过同源重组在trpA基因座。通过免疫印迹分析所构建菌株X47mdaB::ptetR2；trpA::uPtetO-cre中cre的条件表达。细菌生长在液体培养基中，分别不存在ATc或存在50ng/ml ATc时。在两个菌株中，cre表达在存在ATc时被诱导，其中在uPtetO1控制下的表达与uPtet02相比显著得更高(图22)。

在幽门螺杆菌菌株中测试Cre/lox根除

侧翼融合有两个lox位点的启动子-dapA的Lox6671盒(图23)，用于测试幽门螺杆菌中Cre重组酶的功能。该盒被设计和合成为含有ureA启动子和dapA基因。PureA-dapA融合的侧翼为两个lox位点(lox66和lox77)，其中它们非回文核心序列以相同的方向指向，其允许Cre介导根除在lox位点之间的序列。lox位点的序列被突变成loxP驱动。Cre-介导的lox66和lox71位点之间的重组，产生了一个野生型和双突变loxP位点。因为双突变loxP位点表现出对Cre重组酶的降低得多的结合亲和力，因此，利用突变的Cre/loxP系统的Cre-介导的根除优选正向。

Lox6671盒被克隆在载体pBlu-BI中，产生了质粒pBI-Lox6671。利用pBI-Lox6671自然转化X47mdaB::ptetR2;trpA::uPtetO(I/2)-cre;ureBI::rpsL-CAT得到菌株X47mdaB::ptetR2;trpA::uPtetO(1/2)-cre;ureBI::Lox667L。

使用所构建菌株的基因组DNA进行PCR以确认在ureBI整合该盒。在没有诱导时，在血琼脂上培养细菌，并且分离基因组DNA。所有测试的克隆都展现出比X47野生型对照的带稍大的PCR带(图24)。该带对应具有一个lox位点的ureBI基因座的期望大小。该实验显示Cre在幽门螺杆菌中是有功能的，并且促进了lox介导的基因根除。然而，在没有TetR诱导时发生Cre/lox根除，意味着抑制Cre不足以防止根除，尽管Cre水平低于免疫印迹的检测极限。

优化TetR-诱导Cre/lox根除系统

为了在幽门螺杆菌中优化诱导型Cre/lox系统，tetR被更换为幽门螺杆菌密码子优化版本的tetR(tetRs)以提高tet抑制子的表达水平。tetRs被克隆到质粒pMdaB-PureA-hydA以产生质粒pMdaB-PureA-TetRs。所构建的质粒用于转化受体菌株X47mdaB:rpsL-cat，通过自然转化以产生X47mdaB::PureA-tetRs。tetRs在该菌株中的表达通过免疫印迹进行分析。在X47mdaB::PureA-tetRs中tetRs的表达与菌株X47mdaB::ptetR2相比更高，但是低于大肠杆菌阳性对照（pos）中的表达（图25）。

通过修饰cre上游的启动子uPtetO进一步优化系统，以降低基础cre表达。设计了一系列6个tet应答启动子，其具有不同的翻译表达效率(l-6)uPtet05(图26)。这些启动子基于uPtetO，其具有两个tetO位点，其位于-35盒的上游，以及在-35和-10盒之间，这与urePtetOI类似。为了降低翻译效率，起始密码子被从ATG更换为CTG和TTG(4-6)uPtet05，另外，核糖体结合序列从TAGGAG变更为TAGCAG(1-3)uPtetO5。合成启动子变体为与cre5’端的融合，并且克隆在质粒pTrpA-uPtet02-Cre中以产生6个质粒pTrpA-(1-6)uPtet05-Cre。

利用质粒自然转化受体菌株X47trpA::rpsL-cat以产生菌株X47mdaB::(1-6)uPtet05-cre。这些菌株和携带质粒pTrpA-(l-6)uPtet05-Cre的大肠杆菌用于评价在不存在tet抑制剂时uPtetO启动子变体的强度。

如图27中的免疫印迹所示，基于uPtet05的构建体的强度与具有pTrpA-uPtet02-Cre的对照菌株相比弱得多。当将起始密码子在uPtet05中从ATG变成TTG时，cre的表达水平会逐步降低并且在该改变与突变体RBS((1-3)uPtetO5)相结合时会继续下降。在幽门螺杆菌菌株X47mdaB::(1-6)uPtetO5-cre中，cre表达会降低至检测极限之下，除了构建体6uPtetO5显示出弱带之外。

进行后续几轮自然转化菌株X47mdaB::PureA-tetRs，以便首先整合进(1-6)uPtet05-cre构建体以及其他Lox6677。最终菌株X47mdaB::PureA-tetRs;trpA::(2/4/5/6)uPtetO-cre:ureBI::Lox6671的基因组DNA用作模板在PCR中以确定Lox6671盒如前所示的表达。所有四个菌株显示了与ureBI基因座相应的带，其具有一个LoxP位点，表明低于Western印迹检测极限的Cre水平能够促进Lox6671盒的根除(数据未显示)。

使用反义RNA表达降低基础cre表达

在tet抑制子系统中，通常观察到沉默基因的最小残余弱基础表达。对于Cre重组酶，该表达足以剪除lox侧翼的DNA序列。进行另一方法是优化幽门螺杆菌中的Cre-Lox系统，通过利用反义RNA干扰更紧密地控制cre表达水平。设计正义-反义RNA盒为可诱导地转录cre mRNA以及组成型地从相同的基因转录反义RNA(图28)。通过克隆6个(l-6)uPtet05-Cre融合或者仅仅将cre基因克隆至pMA-反义构建这些盒，以产生pTrpA-as(l-6)uPtet05-Cre和pTrpA-as-Cre。利用pTrpA-as(1-6)uPtet05-Cre自然转化幽门螺杆菌受体菌株X47mdaB::PureA-tetRs；trpA::rpsL-cat，随后如上所述在ureBI基因座整合Lox6671盒。通过PCR测试所得到的菌株X47mdaB::Pure A-tetRs;trpA::as(2/4/6)uPtetO-cre;ureBI::Lox6671种Lox6671盒的整合，但是所有构建体都显示了对应具有一个LoxP位点ureBI基因座的带(图29)。

产生基于质粒的tet诱导抗原表达盒

设计可诱导表达盒(IEC)包括两个成分：组成型启动子(flaA启动子)，其控制四环素(tetRs)的表达;以及可诱导启动子(uPtet04),其被tetR负调节，控制靶基因的表达(图30)。uPtet04的设计由下列构成：核心ureA启动子，其具有一个tetO位点在-35和-10盒之间(类似于urePtetOII)。这两个以相反方向朝向的原件是通过非编码间隔序列隔开的。该盒的侧翼是两个转录终止子以分离整合至穿梭载体pHel2中的单元。

不使用四环素抑制子的基因和采用listeriolysin基因作为靶基因合成可诱导表达盒(pMA-IEC-LLO)。为了完成诱导盒，将幽门螺杆菌密码子优化的基因（tetRs）克隆至pMA-IEC-LLO中以得到pMA-IEC-Ts-LLO。listeriolysin基因被更换为幽门螺杆菌密码子优化的Salmonella flagellin亚基C基因(fliCsyn)以形成pMA-IEC-Ts-FliCsyn。最后，将具有fliCsyn的IEC克隆在穿梭载体pHel2中。将所得到的质粒pHel2-IEC-FliCsyn转化至大肠杆菌P2150中，并且随后通过细胞间质粒转移转化至幽门螺杆菌菌株B128。通过限制性酶切检验转化接合子，但并没有显示出正确的图谱（图31）。质粒DNA被幽门螺杆菌修饰，并且限制性内切酶通常被这类修饰抑制。然而，就分子量而言，在所有克隆中出现了两个未消化的质粒，其中一个对应B128内源性质粒(pB128)，另一个对应pHel2-IEC-Ts-FliCsyn。

通过免疫印迹分析在转录接合子B128pHel2-IEC-Ts-FliCsyn中fliCsyn的条件表达和TetRs的表达。分别在没有补充或补充50ng/ml ATc的血琼脂平板上培养细菌。tetRs高度表达，并且所有测试的克隆都显示出表达FliCsyn，在利用无水四环素(ATc)诱导时(图32)。

幽门螺杆菌X47(Ermak et al.1998)菌株常规生长在37摄氏度下，在微厌氧条件下，在Columbia血琼脂(CBA)平板上，其含有5%马血清和Dent抗生素补充物(Oxoid)。适当时，在幽门螺杆菌中进行抗生素选择，通过在培养基中补充氯霉素或链霉素，最终浓度为10微克/mL幽门螺杆菌液体培养物。细菌生长在Brain Heart Infusion(BHI)培养基或BruccellaBroth，其补充有10%Newborn Calf Serum(NCS)和Dent’s抗生素补充物。将接种细菌的培养物重悬浮在PBS中得到0.05的起始OD600，并且在37摄氏度下在微厌氧条件下和120rpm下进行培养。在没有向液体培养基中添加幽门螺杆菌菌株之前进行生长研究。大肠杆菌DH5a生长在Luria-Bertani培养液中。必要时，添加抗生素至下列终浓度：青霉素100ng/ml和氯霉素20微克/ml。

构建幽门螺杆菌菌株，其表达TetR和revTetR

产生HP启动子-tetR融合构建体(ptetR)。

四个不同的幽门螺杆菌启动子用于产生若干不同的启动子-tetR构建体以驱动组成型表达TetRs在幽门螺杆菌中(ptetRl-8，图1)。ptetR1～4是通过短融合PCR产生的(Shevchuk et al.2004)。简言之，对于ptetRl，amiE启动子是从26695基因组DNA(NCBI accession number NC000915)扩增的，其使用引物tet1和tet2，tetR是利用引物tet3和tet9从pWH1925BD扩增的(Schnappinger et al.1998)。引物tet4和tet10用于扩增融合PCR产物并且引入两侧的Sai I和BamH I位点。对于ptetRl，revtetR扩增自pWH1925r2(Scholz et al.2004)。ptetR1和ptetRA,thQflaA启动子用于驱动表达tetR!revtetR，并且是使用tet5～tet10产生的。不同的策略用于产生核心尿素酶启动子-tetR融合1～8。核心启动子非常小，因此，三轮PCR，使用三个长正向引物和一个短反向引物，用于融合启动子以逐步方式至tetR/revtetR基因。

步骤1：长正向引物tetl1与反向引物tet9，步骤2：正向引物tet12(ptetR5-6突变)或tet13(ptetRl-^)与引物tet9，随后是步骤3，其使用正向引物tet14与反向引物tet10以引入两侧的Sai I和BamH I位点。所有ptetR构建物都被克隆至载体pHRdx(Takeshita et al.1987;Croxen et al.2006)中以得到pH_Rdx-ptetR(1-8)。进行了许多尝试以将ptetR构建体引入X47受体菌株的HP0954基因座，通过同源重组，但都失败了。因此，引物mbtetF和mbtetR用于扩增ptetR构建体并且引入两侧Sbf I和EcoR I切割位点用于克隆至Pst I和EcoR I消化的pMdaB克隆载体得到pMdaB-ptetR(1-7)构建体(图11)。利用这些质粒构建体自然转化幽门螺杆菌受体菌株X47mdaB::rpsL-CAT得到X47mdaB::ptetR（1-7)。所得到链霉素抗性转化体的染色体DNA被检查得到正确的等位基因插入。

构建克隆载体，用于将基因整合至受体基因做内，pMdaB pGltDH,pTrpA和pHdapB

pGltDH:1kb的HP0380的C-末端，并且利用引物GltDH1和GltDH2扩增，1kb的HP00379是利用GltDH3和GltDH4扩增的。这两个片段通过短融合PCR连接在一起，使用引物GltDH1和GltDH4得到2kb PCR产物，其含有小MCS位点插入在HP0380和HP0378，两侧为Cla\和SacW限制性位点。该片段被克隆至pBlu-SK-alt的载体骨架中(Xho I和Sai I位点在pBluescript SK(-)中被限制性内切酶切除并且再连接)得到pGltDH，一种克隆载体，其中目标DNA可以被克隆至mini MCS的独特限制性位点中，并且通过同源重组掺入至幽门螺杆基因组的HP0380和HP0379之间(图12A)。

pTrpA:类似的策略用于得到pTrpA，采用引物TrpAl～TrpA4，最终构建体含有小MCS插入到HP1277的中间。该载体用于引入目标DNA序列至HP1277的中间(图13A)。

pMdaB:通过采用引物MdaBl和MdaB2,以及MdaB3和MdaB4，扩增mdaB基因(HP0630)两侧的两个1kb区域。这两个片段通过短融合PCR连接在一起，使用引物MdaB1和MdaB4已得到2.1Kb的PCR产物，其含有小MCS位点，插入到HP0630和HP0631之间，两侧是Cla I和Not I限制性位点。该片段被克隆至pBlu-SK-alt的载体骨架以得到pMdaB，一种克隆载体，其中目标DNA可以被克隆至mini MCS的独特限制性位点中，并且通过同源重组掺入至幽门螺杆基因组的HP0630和HP0631之间。

pHdapB:使用引物DapBl和DapB2,以及DapB3和DapB4扩增HP0510两侧的60bp区域，并通过融合PCR连接在一起，得到1.2kb产物，其中，HP0510被小MCS替换。引物DapB5和DapB6用于扩增融合产物并且引入Hind III和EcoR I限制性位点。最终产物被克隆至pHSG576，得到pHdapB,一种克隆载体，其中目标DNA可以被克隆至MCS的独特限制性位点中，转化至幽门螺杆菌中，得到HP0510被目标DNA序列替换的菌株(图14A)。

质粒构建体，其用于产生受体X47菌株，以将外源DNA在受体基因座引入

反向选择盒,rpsL-CAT,侧翼为BamH I限制性位点，被克隆至pGltDH,pTrpA,pMdaB和pHdapB的BamH I限制性位点，以分别得到pGltDH-RCAT,pTrpA-RCAT,pMdaB-RCAT和pHdapB-RCAT(图12B,13B和14B)。这些构建体用于获得受体X47菌株,gltDH::rpsL-CAT，trpA::rpsL-CAT，mdaB::rpsL-CAT和dapB::rpsL-CAT，这些是对于将目的DNA序列引入到适当受体基因座中所必需的。

构建四环素应答启动子,uPtetO，其具有GFP作为报告基因;pBlu_uPtetO-GFP

类似的三步PCR方法用于制备ptetR{5-^>)以得到uPtetO(l-3)—GFP构建体。简言之，利用引物tetOGFPl和tetOGFP5扩增gfp-mut2(步骤1)。在步骤2，正向引物tetOGFP2,tetOGFP3和tetOGFP4与反向引物tetOGFP5分别用于uPtetOl-GFP,uPtet02-GFP和uPtetOh-GFP，最终引物tetOGFP5和tetOGFP6用于完成3个构建体(步骤3),其中最终构建体包含修饰的核心突变体尿素酶启动子（含有一个以上tetO结合位点，图3B）融合至gfp-mut2，被Nde I切割位点分开，并且两个末端均有多个独特的限制性位点(图15A)。每个构建体都被BamH I消化并且连接至BamH I消化的pBlu BI质粒的骨架上(Benghezal et al.2010)，得到载体pBlu_uPtetO(1-3)-GFP(图15B)。

构建幽门螺杆菌四环素应答启动子，urePtetO

设计多个tetO修饰的ureA启动子构建体(urePtetOl-V)，其含有最多三个tetOn位点在不同的位置，并且利用短融合PCR进行构建（图3C）。用于制备每个urePtetO构建体的引物对列于表6中。

简言之，分别扩增ureA启动子上游1kb和下游2kb。通过PCR使用长引物尾部重新构建ureA启动子区域，在融合两个扩增的片段之后。使用引物ureArcat7和ureArcat8扩增最终的3kb产物，urePtetO(l-V)。

构建ureA敲除菌株：

通过短多重PCR产生ureA::rpsL-CAT构建体。简言之，分别使用引物ureArcatl和ureArcat2,以及ureArcat3和ureArcat4从26695基因组DNA扩增片段1和3，并且使用引物ureArcat5和ureArcat6扩增rpsL-CAT选择盒(中间片段)。巢式引物ureArcat7和ureArcat8用于扩增融合PCR产物。用最终PCR融合产物自然转化幽门螺杆菌菌株X47以得到受体菌株X47ureA::rpsL-CAT，其中ureA和ureA启动子被替换为rpsL-CAT。

构建urePtetO菌株:

用urePtetO(\-V)构建体自然转化受体菌株X47ureA::rpsL-CAT得到菌株X47urePtetO(I-V)。通过使用引物urePseq测序来确认所得到链霉素抗性转话题的正确等位基因替换。

构建GFP报告子菌株以鉴定幽门螺杆菌中的uPtetO四环素调节。

通过Sai I和Xba I双限制性消化从pBlu_uPtetO-GFP(1-3)切出uptetO-GFP(1-3)构建体，并且克隆至类似消化的pGltDH,pTrpA和pHdapB载体中，以得到pGltDH-uPtetO-GFP(l-3),pTrpA-uPtetO-GFP(l-3)和pHdapB-uPtetO-GFP(1-3)质粒(图16A-C)。X47mdaB::ptetR（1-6)菌株被转化pTrpA-RCAT,pGltDH-RCAT和得到各自的受体菌株。受体菌株然后被转化适当的含有质粒的uPtetO-GFP，得到一组X47mdaB::ptetR;uPtetO-GFP菌株(表4)，其在四环素诱导启动子的控制下，从三个受体基因座之一表达GFP，并且还表达TetR或revTetR。表达revTetR的菌株将在不存在诱导剂分子的情况下表达GFP，表达TetR的菌株将只在诱导剂时表达GFP。

构建X47mdaB::ptetR；urePtetO菌株

用ureA::rpsL-CAT构建体自然转化菌株X47mdaB::ptetRI（1-7)得到受体菌株,X47mdaB::ptetR;ureA::rpsL-CAT(1-7)。这些菌株全被转化urePtetO(l-V)构建体,得到了完整的一系列X47mdaB::ptetR;urePtetO菌株(表4)。

表6

用于制备urePtet0构建体的引物对

免疫检验-SDS-PAGE和Western印迹分析

生长在氯霉素或链霉素平板上的细菌的完整细菌裂解液重悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中。沉淀细菌，并且重悬浮在裂解缓冲液中(50mMTris-HCl,250mM NaCl,1%triton X-100)并且在冰上孵育15分钟。然后，对样品进行超声处理10秒钟。通过4摄氏度下13,000rpm离心10分钟，除去不溶的细胞碎片。将细胞裂解物与十二烷基硫酸钠（SBS）样品缓冲液混合，并且在95摄氏度下孵育10分钟。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白质，并电转至PVDF(0.22微米，Immobulon,Millipore)膜，在4℃上，利用90V恒定电压，在转移缓冲液中(192mM甘氨酸，25mM Tris，20%[vol/vol]甲醇)持续2小时。膜被使用2%BSA(Sigma)在PBST(150mM NaCl,10mM Tris-Cl,pH7.0,0.1%[vol/vol]Tween20)中进行封闭，并且与适当的一级抗体进行孵育，清洗，然后与含有辣根过氧化物酶（HRP）缀合物的二级抗体进行孵育。再次清洗膜，并且通过化学发光（Sigma）完成对二级HRP缀合物的检测。为了检测TetR和revTetR，兔多克隆IgG抗-TetR(MoBiTec)，以1：2000进行稀释，被用作一级抗体。为了检测UreB亚基，小鼠单克隆IgG抗-UreB(Austral Biologicals)，以1:8000进行稀释被使用。为了检测GFP，兔多克隆抗GFP(Ondek)，以1:2000进行稀释被使用。二级抗体，小鼠抗-兔-HRP以及兔抗-小鼠-HRP(JacksonImmunoResearch Laboratories)以1:10000进行稀释，被使用。化学发光被使用LAS3000(Fujifilm)(software Image reader LAS3000V2.2)进行检测。

尿素酶活性检验

尿素酶平板检验:

将细菌重悬浮在PBS中至OD600为0.1，并将20微升悬浮液点在新鲜的尿素酶平板。(Brucella broth,7%NCS,1mM尿素,酚红100mg/L,万古霉素6mg/L,pH大约6.2—足以由于pH指示剂看到平板颜色改变，但不够酸以抑制尿素酶阴性菌株的生长)，其含有ATc，浓度为0～250ng/mL。在微缺氧条件下将平板进行孵育，并且每隔24小时检查颜色改变。

盘扩散检验:

细菌被铺在尿素酶平板上，并且将黑盘置于接种的盘上。将10微升ATc加在每个盘上，并在微缺氧条件下将平板进行孵育，并且每隔30小时检查颜色改变。

液体尿素酶检验:

将细菌在含有或者不含50ng/mL ATc的CBA平板上连续培养2代。将细菌重悬浮在冷的缓冲液A中(25mM磷酸盐缓冲液,pH6.8)，并标准化至OD600为4.0。将50微升标准化的细菌悬浮液用50微升缓冲液B（25mM磷酸盐缓冲液，pH6.8,0.2%tween-20)。在96孔板中，25微升稀释的细菌缓冲液被50微升缓冲液C稀释（25mM磷酸盐缓冲液，pH6.8，250μM酚红），并且在37摄氏度下孵育5分钟。75微升尿素溶液(0.5M)然后被加入，并且每个72秒测量560nm处的光吸收，持续75轮，其使用POLARstar Omega(BGM Labtech)platereader。活性被测量为光吸收随着时间的变化速度，并且表达为野生型亲本菌株尿素酶活性的百分比。所有尿素酶活性测量都进行三份，并且所有试验都重复三次。

GFP报告子检验

盘扩散检验:

细菌接种在CBA平板上，并且在37摄氏度下孵育14小时。将空白盘置于细菌菌落上，并接种30微升ATc溶液，孵育48小时，之后，观察GFP表达，使用LAS3000(Fujifilm)(光源-Blue-460nm EPI,FilterGFP510DF10)。

GFP荧光:

细菌被接种至新鲜CBA平板，其具有或者不含有50ng/mL ATc，并在24小时孵育后观察。对于Tet-OFF菌株，ptetR(2,4,6)细菌在含有ATc的CBA平板上传代2次，以给细菌足够的时间抑制GFP表达。

液体培养

5mL培养物培养14小时，然后除非明确指出，用200ng/mL ATc诱导。通过离心收获细菌，用PBS清洗两次，并重悬浮至OD600为2.然后，将0.1ml细菌悬浮液转移至黑色96孔板，在485nm下激发后测量520nm的荧光，其使用POLARstar Omega platereader。

动物实验

6-7周大的C57BL/6J雌鼠被口服给药一次200微升1x109CFU/mL细菌，其已经在CBA平板上（含有50ng/mL ATc）进行传代以诱导四环素应答基因的表达。小鼠被白虎冲脱氧四环素，在他们的含有5%蔗糖的饮用水中。在所指出的时间点处死小鼠，并取出胃并且在1mL BHI中匀浆，使用组织裂解试剂(Retch)。匀浆液被系列稀释，并且接种在幽门螺杆菌选择平板上(CBA含有5%马血清,Dent,多粘菌素B2500U/L或0.2975mg/L,萘啶酸l0mg/L以及杆菌肽（Bacitracin）l00mg/L)。对集落进行计数以计算细菌负载。检查重新分离的集落用于tet应答基因的表达，并且适当时进行测序。

在该研究中使用的幽门螺杆菌菌株和质粒列于表4中。幽门螺杆菌X47菌株菌株常规生长在37摄氏度下，在微厌氧条件下，在Brain HeartInfusion(BHI)血琼脂(BHIB)或Heart Infusion(HI)血琼脂(HIB)平板上，其含有5%马血清和5%Newborn Calf Serum(NCS)。适当时，在幽门螺杆菌中进行抗生素选择，通过在培养基中补充氯霉素或链霉素，最终浓度为10微克/mL幽门螺杆菌液体培养物。细菌生长在Brain Heart Infusion(BHI)培养基，其补充有10%Newborn Calf Serum(NCS)和Dent’s抗生素补充物。将接种细菌的培养物重悬浮在PBS中得到0.05的起始OD600，并且在37摄氏度下在微厌氧条件下和120rpm下进行培养。大肠杆菌DH5a生长在Luria-Bertani培养液中。必要时，添加抗生素至下列终浓度：青霉素100ng/ml和氯霉素20微克/ml。

使用MS—Ndel-Cre F和MS Cre-Sall R扩增幽门螺杆菌26695密码子优化的cre重组酶(SEQ ID NO:87)基因。利用Nde I和Sai I消化lkbPCR片段，并且克隆至类似消化的载体pTrpA-uPtetO1–GFP或pTrpA-uPtet02-GFP（表4），以产生pTrpA-uPtetO1–Cre和pTrpA-uPtet02-Cre。

用质粒pTrpA-uPtetO1–Cre或pTrpA-uPtet02-Cre自然转化幽门螺杆菌受体菌株X47mdaB::ptetR2;trpA::rpsL-CAT，产生菌株X47mdaB::ptetR2;trp A::uPtetO(1/2)-cre(表4)。

设计和合成合成盒Lox6671(SEQ ID NO:88)，其含有PureA-dapA融合，两侧为lox66和lox71cre重组酶识别位点(pMK-RQ-Lox6671)(图22)。该盒被EcoR I和Bgl II双限制性消化切出，并且克隆至类似消化的载体pBlu BI以得到质粒pBI-Lox6671。

X47ureBI::rpsL-CAT的基因组DNA用作模板以扩增反向选择盒，rpsL-CAT，整合在ureB和urel基因之间。用ureBI-RCA T PCR产物自然转化幽门螺杆菌菌株X47mdaB::ptetR2；trpA::uPtetO(l/2)-cre得到受体菌株X47mdaB::ptetR2；trpA::uPtetO(I/2)-cre；ureBI::rpsL-CAT，以将Lox6671盒引入ureBI基因座中。这些菌株被转化pBI-Lox6671，得到X47mdaB::ptetR2；trpA::uPtetO(I/2)-cre；ureBI::Lox6671菌株(表4)。此外，受体菌株X47ureBI::rpsL-CAT被用pBI-Lox6671转化以产生对照菌株X47ureBI::lox6671。

合成和使用tetR基因序列的幽门螺杆菌26695密码子优化版本。合成的tetRs(SEQ ID NO:89)通过用EcoR I和Bgl II双限制性消化从pMA-T-TetRs切出并克隆至类似消化的载体pMdaB-PureA-hydA以得到质粒pMdaB-PureA-TetRs。用该质粒自然转化受体菌株X47mdaB::rpsL-CAT得到X47mdaB::PureA-tetRs。

构建幽门螺杆菌菌株，其具有TetRs调节的Cre-Lox系统以及不同的Cre表达效率

构建pTrpA-(l-6)uPtet05-Cre

设计和合成一组六个不同的可诱导启动子-cre5变体(pMK-(l-6)uPtet05-Cre5')。这些启动子变体含有两个tetO位点，野生型或突变RBS和ATG,CTG或TTG作为启动密码子(图23)。uPtet05-Cre5融合被从pMK-(1-6)uPtet05-Cre55通过利用Bgl II和BamH I双限制性消化切出，并克隆至类似消化的载体pTrpA-uPtet02-Cre，得到pTrpA-(l-6)uPtet05-Cre质粒(SEQ ID N0s:90～95)。通过利用Nde I限制性消化确认构建。融合(!/4)uPtet05-Cre5被类似克隆至pTrpA-6uPtet05-Cre得到质粒pTrpA-(l,4)uPtet05-Cre。

构建幽门螺杆菌菌株，其具有TetRs调节的Cre-Lox系统

用pTrpA-RCAT自然转化X47mdaB::PureA-tetRs以得到受体菌株X47mdaB::PureA-tetRs;trpA:rpsL-CAT。该菌株被转化所构建的质粒pTrpA-(1-6)uPtet05-Cre。所得到的菌株被依次转化pBI-RCAT和pBI-Lox6671，以得到菌株X47mdaB::PureA-tetRs;trpA::(1-6)uPtetO5-cre;ureBI::Lox6671。

构建表达Cre反义RNA的幽门螺杆菌菌株，其具有TetRs调节的Cre-Lox系统

构建pTrpA-as(l-6)uPtet05-Cre(SEQ ID NO:96)

设计和合成盒以诱导转录目的基因的mRNA并且从相同基因拷贝在trpA基因座(pMA-Antisense)稳定表达反义RNA(图28)。pT rp A-(1-6)uPtet05–Cre的(1-6)uPtet05-cre变体被切除并克隆至pMA-Antisense，通过用Bgl II和Not I消化以得到pTrpA-as(l-6)uPtet05-Cre。质粒被用于转化受体菌株X47mdaB::PureA-tetRs;trpA::rpsL-CAT，以得到X47mdaB::PureA-tetRs;trpA::as-(l-6)uPtet05-cre。随后，菌株被依次转化pBI-RCAT和pBI-Lox6671得到菌株X47mdaB::PureA-tetRs;trpA::as-(l-6)uPtet05-cre;ureBI::Lox6671。

免疫检验-SDS-PAGE以及Western印迹分析

细菌生长在选择平板或在选择液体培养基中24小时。收获细胞并且重悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中。然后，在37摄氏度下对样品进行超声处理15分钟。13,000rpm离心1分钟，除去不溶的细胞碎片。通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白质，并电转至PVDF(Immobilon-PTransfer0.45微米，Millipore)膜，利用100V恒定电压，在转移缓冲液中(192mM甘氨酸，25mM Tris，20%[vol/vol]甲醇)持续1小时。膜被使用2%BSA(Sigma)在PBST(150mM NaCl,10mM Tris-Cl,pH7.0,0.1%[vol/vol]Tween20)中进行封闭，并且与适当的一级抗体进行孵育，清洗，然后与含有辣根过氧化物酶（HRP）缀合物的二级抗体进行孵育。再次清洗膜，并且通过化学发光（Sigma）完成对二级HRP缀合物的检测。为了检测Cre重组酶，兔多克隆IgG抗-Cre(abeam)以1:1000稀释被使用作为一级抗体。为了检测TetR，兔多克隆IgG抗TetR(abeam)以1:1000稀释被使用作为一级抗体。二级抗体兔抗-小鼠-HRP(Jackson ImmunoResearchLaboratories)被以1:5000稀释使用。化学发光被使用LAS3000(Fujifilm)(software Image reader LAS3000V2.2)进行检测。

构建基于pHel2的穿梭载体，其含有tet诱导抗原表达盒

tet诱导表达盒被设计为含有在PflaA控制下的tetRsyn基因和在uPtetO4控制下的靶基因。利用幽门螺杆菌密码子优化的listeriosylin基因作为靶基因并且没有tetRsyn gene(pMA-IEC-LLO)(SEQ ID NO:97)合成该盒。在第一个克隆步骤中，tetRsyn被从pMA-T-TetRsyn取出，通过双限制性内切酶消化采用EcoR I和Bgl II，并且克隆到经过类似消化的载体pMA-IEC-LLO中以得到质粒pMA-IEC-Ts-LLO。第二fliCsyn(SEQ IDNO:98)被扩增，其使用引物MS—Ndel-FliC F和MS—FliC-Sall R以及质粒pMK-RQ-FliCsyn作为模板。所得到的PCR片段和pMA-IEC-Ts-LLO被使用Nde I和Sail进行消化以在载体中克隆fliCsyn替换LLO基因(pMA-正C-Ts-FliCsyn)(SEQ ID NO:99)。最后，利用Xho I消化所构建的质粒，以切除整个可诱导表达盒。将该盒克隆在类似消化的载体pHel2中以产生穿梭载体pHel2-IEC-Ts-FliCsyn(SEQ ID NO:100)。

pHel2-IEC-Ts-FLiCsyn从大肠杆菌至幽门螺杆菌的细胞间转移

重组穿梭载体pHel2-IEC-Ts-FliCsyn从大肠肝菌接合至幽门螺杆菌，其中大肠杆菌菌株p2150作为供体，P2150[pRK2013]作为协助菌株。幽门螺杆菌受体菌株B128在选择性血琼脂平板上生长24小时。含有重组穿梭载体的大肠杆菌和P2150[pRK2013]生长在含有1mM DAP的液体培养基中过夜。收集所有细菌并分别重悬浮在磷酸缓冲液盐水或LB培养基中。细菌菌株按照下列相对OD₆₀₀混合在一起：25微升10OD600单位的供体；25微升10OD600单位的辅助细胞；以及250微升10OD600单位的供体的受体。将细胞混合物铺在血琼脂平板上，其补充有1mM DAP并在微厌氧条件下37摄氏度下孵育4小时。然后将细菌混合物涂布在新鲜的血琼脂平板上，其补充有选择性抗生素和Dent，并在微厌氧条件下37摄氏度下孵育。在3～5天后观察所得到的转录接合体B128pHel2-IEC-Ts-FliCsyn。

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Claims

1.一种基因构建体，其沿着5'至3'的方向包括：

(a)启动子序列；和

(b)目的DNA序列，

其中，所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌中调节所述目的DNA序列表达的多核苷酸序列，以及

其中，所述启动子序列被修饰成包括四环素(tet)操纵子序列。

2.一种基因构建体，其沿着5'至3'的方向包括：

(a)启动子序列；和

(b)尿素酶操纵子，

其中，所述启动子序列包括能够在幽门螺杆菌中调节所述尿素酶操纵子表达的多核苷酸序列，以及

3.根据权利要求1或2所述的基因构建体，其中，所述目的DNA序列编码至少一个异源抗原或其功能片段。

4.根据权利要求3所述的基因构建体，其中，所述异源抗原或其功能片段来自病原微生物。

5.根据权利要求4所述的基因构建体，其中，所述病原微生物选自病毒、细菌、原生动物和真菌。

6.根据权利要求4所述的基因构建体，其中，所述异源抗原选自人类免疫缺陷性病毒(HIV)抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、埃-巴二氏病毒抗原、水痘-带状疱疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、鼻病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、诺沃克病毒抗原、披衣抗原、甲病毒抗原、风疹病毒抗原、狂犬病病毒抗原、马伯格氏病毒抗原、埃博拉病毒抗原、乳头状瘤病毒抗原、多形瘤病毒抗原、间质肺病毒抗原、冠状病毒抗原、霍乱弧菌抗原、镰状疟原虫抗原、间日疟原虫抗原、卵形疟原虫抗原、三日疟原虫抗原、诺氏疟原虫抗原、肺炎链球菌抗原、酿脓链球菌抗原、幽门螺杆菌抗原、无乳链球菌抗原、脑膜炎奈瑟氏球菌抗原、淋病奈瑟氏菌抗原、白喉棒杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、百日咳杆菌抗原、嗜血杆菌抗原、衣原体抗原和大肠杆菌抗原。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的基因构建体，其中，所述构建体进一步包括：

(c)基因终止序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的基因构建体，其中，所述基因构建体是质粒载体。

9.根据权利要求8所述的基因构建体，其中，所述质粒载体能够将所述基因构建体插入幽门螺杆菌的染色体中。

10.根据权利要求9所述的基因构建体，其中，所述基因构建体插入染色体中是通过同源重组。

11.根据权利要求2至10中任一项所述的基因构建体，其中，所述尿素酶操纵子分离自幽门螺杆菌菌株。

12.根据权利要求11所述的基因构建体，其中，所述尿素酶操纵子包括亚基A和亚基B。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的基因构建体，其中，所述启动子在被修饰成包括tet操纵子序列之前对于幽门螺杆菌是外源的。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的基因构建体，其中，所述启动子是用于尿素酶的启动子。

15.根据权利要求14所述的基因构建体，其中，所述尿素酶启动子是幽门螺杆菌的素酶亚基A。

16.根据权利要求1至12中任一项所述的基因构建体，其中，所述启动子选自amiE启动子、核心尿素酶启动子、revtetR启动子和flaA启动子。

17.一种分离的基因修饰的幽门螺杆菌，其包括：

根据权利要求1至16中任一项所述的基因构建体。

18.一种基因修饰幽门螺杆菌的方法，其包括：

(i)提供根据权利要求1至16中任一项所述的基因构建体；和

(ii)转化所述幽门螺杆菌以生产所述遗传修饰的幽门螺杆菌。

19.一种控制幽门螺杆菌在哺乳动物粘膜形成集落能力的方法，所述方法包括以下步骤：

通过修饰或删除所述幽门螺杆菌中的磷酸甘露糖异构酶代谢控制脂多糖(LPS)的Lewis抗原，

其中，添加甘露糖至所述哺乳动物的饮食对于维持幽门螺杆菌在粘膜形成集落是必要的。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述Lewis抗原的丧失导致在所述哺乳动物中提高的树状细胞功能。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中，所述幽门螺杆菌选自以下列ATCC索取号保藏于美国模式培养物保藏中心(ATCC)的幽门螺杆菌菌株：

43504；43504D-5；43526；43579；43629；49396；49503；51110；49503；51111；51407；51652；51653；51932；和53727。

22.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述幽门螺杆菌选自以下列索取号保藏于国家测量局的幽门螺杆菌菌株：V09/009101；V09/009102；V09/009103；V10/014059；V10/014060；和V09/009104。

23.一种免疫原组合物，其包括：

根据权利要求17所述的分离的遗传修饰的幽门螺杆菌；和

药用可接受的载体。

24.根据权利要求23所述的免疫原组合物，其进一步包括佐剂。

25.一种用于保护哺乳动物抵抗病原微生物感染的方法，其包括下列步骤：

给药免疫有效量根据权利要求23或24所述的免疫原组合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述哺乳动物是灵长类动物、犬科动物、马属动物、牛、猪、绵羊和啮齿动物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。