CN105734138B - 基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法 - Google Patents

基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，属植物质体基因工程研究技术领域。本发明的方法以四环素基因及四环素特异性识别序列的核心操控区为基础，生物合成带有四环素核心操控区的prrnO1O2启动子，并在原核细胞中验证该启动子的活性，在该启动子的驱动下GFP基因表达；构建四环素诱导表达载体，筛选出适应细菌生长的最高四环素使用浓度为5μg/mL；最后构建四环素调控系统下的GFP表达载体，在未加入四环素时，prrnO1O2启动子的功能被抑制，加入四环素后，GFP基因表达出绿色荧光蛋白。本发明的有益效果在于：利用四环素调控系统控制叶绿体启动子的活性，从而避开了核基因组对质体基因组的调控干扰，为进一步的质体基因工程育种提供有有效的方法和途径。

Description

基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法
技术领域
本发明涉及一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，属植物质体基因工程研究技术领域。
背景技术
叶绿体基因工程是伴随着叶绿体基因组研究的不断深入而出现的，目前叶绿体基因组转化技术已在烟草、番茄、马铃薯、拟南芥、大豆、胡萝卜、花椰菜、油菜、水稻和棉花等高等植物中获得了成功。
与细胞核转基因技术相比，叶绿体基因转化具有明显的优势。（1）、通过DNA片段同源重组，可以精确地控制外源基因的插入位点；（2）、安全性及稳定性好。绝大多数植物的叶绿体基因为母系遗传，大大降低了基因扩散所引起的生态风险性；（3）、外源基因可得到超量表达。叶绿体转基因植物中，外源基因的表达量通常比核转化植株的表达量高出数十倍至数百倍。表达产物的区域化，也为目标蛋白的提取提供了方便。
大肠杆菌的四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列(operator)，转座子Tn10编码的TetR（tet repressor）蛋白可以与上述操纵序列紧密结合，阻止转录起始复合物的形成，从而达到从转录水平抑制四环素抗性基因的表达。当外源的四环素分子穿过大肠杆菌细胞膜进入细胞后，可特异结合TetR蛋白，使其构相改变,从操纵序列解离下来，于是转录起始复合物可以形成。四环素调控系统具有独特之处：（1）、关键元件均来自原核生物，由于原核与真核生物基因组的巨大差差异，该系统对真核基因组的表达几乎没有影响；（2）、原核基因缺乏多效性，简化了对转基因表型的解释；（3）、该系统的诱导因子是抗生素，与其他调控系统的诱导 (如热休克、激素等)相比，在活体内不具有多态效应；（4）、诱导所需的Tc剂量较低，对细胞和哺乳动物是无害的；（5）、外源基因表达的水平与所加的Tc浓度在一定范围内相关，可通过控制Tet的浓度来控制基因表达的水平，了解基因不同水平的表达对细胞。
目前对Tet调控系统已经广泛应用于医学治疗，是目前应用最广的一种诱导系统，与Cre/loxP重组酶系统联合应用控制Cre重组酶基因的表达，但在很多植物上至今还未得到成功，四环素诱导表达系统在质体基因工程上的报道更是甚少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。通过四环素调控系统控制叶绿体基因的表达，为今后质体基因工程的研究提供一种有效的方法。
一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a、查阅资料及在NCBI数据库中查得到四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列（如图1），两区域能够特异性识别四环素蛋白因子。并根据本Bio3-GFP表达载体设计本发明中涉及的特异性引物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、及SEQ ID NO:5，其中：SEQ ID NO:1:和SEQ ID NO:2用于扩增步骤b中的新合成prrnO1O2启动子序列，SEQ ID NO:3:和SEQ ID NO:4用于扩增TetR基因序列，SEQ ID NO:1:和SEQ ID NO:5启动子prrn，将Tet两个核心操纵区嵌入启动子prrn中（如图2），单下划线部分为操纵子O1，位于TATA-box方框标注的上游第2个碱基处；双下划线为部分为操纵子O2，位于prrn启动子转录起始位点A灰色底纹标注下游第3个碱基处；将该启动子送昆明硕阳生物公司全基因合成，上下分别游引入Hind III、Xba I酶切位点，以小写字母表示，命名该启动子为prrnO1O2；
b、 用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2引物对从新合成的基因序列上扩增prrnO1O2，使用Trans Fast Fly DNA 聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增体系含ddH2O 14 μL，5×PCR 缓冲液（Mg2+）5μL，2.5mmol L–1 dNTPs 2.5 μL，引物各1 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，稀释模板DNA 1μL。PCR 扩增参数为 95℃ 2 min，95℃ 20 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s；35个循环。将回收目的片段分别连接到pEASY-Blunt simple克隆载体，并转化至大肠杆菌感受态细胞TransT1, 经过常规的纯化培养和蓝白斑筛选、PCR鉴定，取阳性克隆进行鉴定并测序；将该菌株进行常规的扩大培养，并进行质粒纯化回收；
c、将带有启动子片段prrnO1O2的载体与Bio3-GFP载体均使用Hind III/Xba I双酶切，酶切反应体系为30μL，包括ddH2O 12μL，10×M buffer 3μL，Hind III 1.5μL，Xba I1.5μL，质粒12μL；37℃反应3 h，凝胶电泳观察后回收目的片段后，用T4连接酶连接(如图3B)，连接反应体系为10μL：包括ddH2O 1μL，T4 ligation buffer 1μL，T4 ligation 0.5μL，目的片段5.5μL，载体片段 2μL；检测新合成的prrnO1O2启动子是否具有启动子活性，在60μg/mL的Amp培养基上能够正常生长且菌体呈现出绿色（如图5），表明该启动子能够在细菌中启动下游GFP基因的表达；
d、用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4引物对从原有载体上扩增得到的TetR基因序列连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-prrn-GFP 用SalI/Kpn I双酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接(如图3A)，PCR及酶切检测表达载体的正确性，命名为Bio3-prrn-TetR；在60μg/mL的Amp抗生素的培养基上，同时设置四环素浓度梯度，分别0、1、2.5、5、10、15、20μg/mL，结果显示在四环素的浓度为5μg/mL是菌体正常生长，而10μg/mL时细菌没有生长，说明四环素的使用最高浓度为5μg/mL；
e、用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO5引物对用于扩增prrn+TetR+psbA表达盒，构建四环素诱导下的GFP基因的表达载体，连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-TetR均使用Hind III单酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接(如图3C)，检测正确后，命名为Bio3-TetR-pO1O2-GFP（如图4）；在60μg/mL的Amp培养基上，含有该表达质粒的大肠杆菌能够正常生长，但是GFP基因没有表达出绿色荧光蛋白（如图6），说明TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子的功能；而后加入5μg/mL的盐酸四环素，GFP蛋白表达，显示出绿色的菌体，但表达量降低（如图7）；
f、结果判定
带有核心操纵子的prrnO1O2启动子在原核细胞中能够启动下游GFP基因的表达；TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子；而加入5μg/mL的盐酸四环素后，下游GFP蛋白表达；说明这是一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。
本发明的有益效果在于：利用新合成的叶绿体启动子，并在大肠杆菌中检测其活性，同时利用四环素调控系统来调控叶绿体基因的表达，为叶绿体基因工程的研究提供一种有效的方法。
附图说明：
图1为Tet操纵子序列。*号碱基代表回纹序列的中心碱基；箭头表示回纹序列；方框内则代表与TetR蛋白直接作用的碱基序列；
图 2 为 prrnO1O2启动子序列结构。其中单下划线部分为操纵子O1，；双下划线为部分为操纵子O2，位于prrn启动子转录起始位点A（灰色底纹标注）下游第3个碱基处；上下分别游引入Hind III、Xba I酶切位点，以小写字母表示；
图3为三种表达载体的构建示意图。A表示prrnO1O2启动子活性检测的Bio3-prrnO1O2-GFP表达载体图；B表示Tet浓度检测的Bio3-prrn-TetR示意图；C表示四环素诱导下的GFP基因的Bio3-TetR- prrnO1O2-GFP表达载体示意图；
图4为上述三种表达载体的酶切检测图。M：Trans2k Plus II DNA marker；1：Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP用Hind III单酶切；
2：Bio3-prrnO1O2-GFP用Hind III/Xba I双酶切；3：Bio3-prrn-TetR用SalI/KpnI双酶切；
图5为检测新合成的prrnO1O2启动子在大肠杆菌中的活性；
图6为Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表达载体在没有四环素诱导时大肠杆菌的生长情况；
图7为Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表达载体在加入5μg/mL的四环素时大肠杆菌生长情况。
具体实例方式：
下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。本实施例的方法步骤同发明内容部分描述的方法步骤。
实施例1：
1.准备材料
1.1 仪器
PCR仪、超低温冰箱、离心机、超净操作台、电泳仪、紫外凝胶成像系统，超纯水系统；
1.2 实验试剂
感受态细胞、pEASY-Blunt克隆载体、DNA聚合酶购置于北京全式金生物公司，T4连接酶、各种限制性内切酶购于Takara生物公司，质粒回收试剂盒、凝胶回收试剂盒购于庄萌国际；
1.3引物设计
本发明中所用到的引物序列SEQ ID
NO:1（5’- CAAGCTTGCTCCCCCGCCGTCGTTCAAT -3’）、
NO:2（5’- GTCTAGAGCTAGCCTGTCCACCAGTCAT -3’）、
NO:3（5’- CGTCGACATGTCTAGATTAGATAAAAGTA -3’）、
NO:4（5’- CGGTACCTTAAGACCCACTTTCACATTTA -3’）、
NO:5（5’- CAAGCTTCATGAATAAATGCAAGAAAAT -3’）由北京华大基因公司合成。
2.实验方法和结果
2.1 四环素诱导基因表达的浓度筛选
将构建正确的Bio3-ppsbA-TetR在60μg/mL的Amp LB固体培养基上，同时设置四环素浓度梯度，分别0、1、2.5、5、10、15、20μg/mL，检测在不同Tc浓度下菌体的生长情况，筛选诱导大肠杆菌GFP正常生长、表达四环素浓度。最终的结果表明四环素的浓度为5μg/mL是菌体正常生长，而10μg/mL时细菌没有生长，说明四环素的使用最高浓度为5μg/mL。
2.2 四环素调控下的叶绿体启动子活性检测
将构建好的Bio3-TetR-prrnO1O2-GFP表达载体的菌株在60μg/mL的Amp培养基平板上。一个未加入Tc，另一平板加入5μg/mL的Tc，培养观察两平板中菌株的生长情况。结果表明在60μg/mL的Amp培养基上（未添加Tc），含有该表达质粒的大肠杆菌能够正常生长，但是GFP基因没有表达出绿色荧光蛋白（如图6），说明TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子的功能；而后加入5μg/mL的Tc，大肠杆菌能够正常生长，GFP蛋白表达，显示出绿色的菌体，但表达量降低（如图7）。
序列表
<110> 云南农业大学
<120> 基于四环素操控系统检测叶绿体启动子活性的方法
<130> 2015
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
caagcttgct cccccgccgt cgttcaat 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
gtctagagct agcctgtcca ccagtcat 28
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
cgtcgacatg tctagattag ataaaagta 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
cggtacctta agacccactt tcacattta 29
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
caagcttcat gaataaatgc aagaaaat 28
<210> 6
<211> 259
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc gtgggattga cgtgaggggg 60
cagggatgga ctctatcatt gatagagtct atatttctgg gagggagtct ccctatcagt 120
tccctatcag tgatagagag atagagagtc tccctatcag tgatagagat caccacaacg 180
gtttcccact agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tggcaagcat 240
gactggtgga caggctagc 259
<210> 7
<211> 624
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 7
atgtctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaag attttttacg 240
taataacgct aaaagtttta gatgtgcttt actaagtcat cgcgatggag caaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc ttaa 624

Claims (1)

1.一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a、 查阅资料及在NCBI数据库中查得到四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列，两区域能够特异性识别四环素蛋白因子；并根据本Bio3-GFP表达载体设计本发明中涉及的特异性引物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、及SEQ ID NO:5，其中：SEQ ID NO:1:和SEQ ID NO:2用于扩增步骤b中的新合成prrnO1O2启动子序列，SEQ ID NO:3:和SEQ ID NO:4用于扩增TetR基因序列，SEQ ID NO:1:和SEQ ID NO:5用于扩增启动子prrn，将Tet两个核心操纵区嵌入启动子prrn中，单下划线部分为操纵子O1，位于TATA-box方框标注的上游第2个碱基处；双下划线为部分为操纵子O2，位于prrn启动子转录起始位点A灰色底纹标注下游第3个碱基处；将该启动子送昆明硕阳生物公司全基因合成，上下分别游引入Hind III、Xba I酶切位点，以小写字母表示，命名该启动子为prrnO1O2，其序列如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
b、用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2引物对从新合成的基因序列上扩增prrnO1O2, 使用Trans Fast Fly DNA 聚合酶进行PCR扩增；PCR扩增体系含ddH2O 14 μL，5×PCR 缓冲液（Mg2+）5μL，2.5mmol L–1 dNTPs 2.5 μL，引物各1 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，稀释模板DNA 1 μL；PCR 扩增参数为 95℃ 2 min，95℃ 20 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s；35个循环；将回收目的片段分别连接到pEASY-Blunt simple克隆载体，并转化至大肠杆菌感受态细胞Trans T1,经过常规纯化培养和蓝白斑筛选、PCR鉴定，取阳性克隆进行鉴定并测序；将该菌株进行扩大培养，并进行质粒纯化回收；
c、 将带有启动子片段prrnO1O2的载体与Bio3-GFP载体均使用Hind III/Xba I双酶切，酶切反应体系为30μL，包括ddH2O 12μL，10×M buffer 3μL，Hind III 1.5μL，Xba I1.5μL，质粒12μL；37℃反应3 h，凝胶电泳观察后回收目的片段后，用T4连接酶连接，连接反应体系为10μL：包括ddH2O 1μL，T4 ligation buffer 1μL，T4 ligation 0.5μL，目的片段5.5μL，载体片段 2μL；检测新合成的prrnO1O2启动子是否具有启动子活性；在60μg/mL的Amp培养基上能够正常生长且菌体呈现出绿色，表明该启动子能够在细菌中启动下游GFP基因的表达；
d、用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4引物对从原有载体上扩增得到的TetR基因序列连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-GFP用Sal I/Kpn I双酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接，PCR及酶切检测表达载体的正确性，命名为Bio3-prrn-TetR，在60μg/mL的Amp抗生素的培养基上，同时设置四环素浓度梯度，分别0、1、2.5、5、10、15、20μg/mL，结果显示在四环素的浓度为5μg/mL是菌体正常生长，而10μg/mL时细菌没有生长，说明四环素的使用最高浓度为5μg/mL；
e、用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5引物对用于扩增prrn+TetR+psbA表达盒，构建四环素诱导下的GFP基因的表达载体，连接到pEasy-Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3-prrn-TetR均使用Hind III单酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接，检测正确后，命名为Bio3-TetR-pO1O2-GFP；在60μg/mL的Amp培养基上，含有该表达质粒的大肠杆菌能够正常生长，但是GFP基因没有表达出绿色荧光蛋白，说明TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子的功能；而后加入5μg/mL的盐酸四环素，GFP蛋白表达，显示出绿色的菌体，但表达量降低；
f、结果判定
带有核心操纵子的prrnO1O2启动子在原核细胞中能够启动下游GFP基因的表达；TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子；而加入5μg/mL的盐酸四环素后，下游GFP蛋白表达；说明这是一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。
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