CN105400814A

CN105400814A - 一种培育抗虫转基因玉米的方法

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Publication number: CN105400814A
Application number: CN201510845655.3A
Authority: CN
Inventors: 韩庚辰; 张�杰; 邓德芝; 姜付坤; 王智勇; 钱雪娅; 耿丽丽
Original assignee: Beijing Aoruijin Seed Co ltd
Current assignee: Beijing Aoruijin Seed Co ltd
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: CN105400814B

Abstract

本发明公开了一种培育抗虫转基因玉米的方法。本发明所提供培育抗虫转基因玉米的方法，包括将抗虫基因导入目的玉米，得到表达所述抗虫基因的转基因玉米的步骤；所述转基因玉米与所述目的玉米相比，抗虫性提高；所述抗虫基因为下述a)或b)或c)的DNA分子：a)核苷酸序列如序列表中序列3所示；b)核苷酸序列如序列表中序列3的第1-2007位所示；c)核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质。与转入优化前Cry1Ah基因的转基因玉米相比，本发明所提供的人工合成的抗虫基因的转基因玉米，其Cry1Ah蛋白的表达量明显提高；同时抗虫性也明显提高。

Description

一种培育抗虫转基因玉米的方法

技术领域

本发明涉及一种培育抗虫转基因玉米的方法。

背景技术

目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如1)AT含量较高，超过60％，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’-UTR序列和3’末端的polyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001％或者几乎检测不到。

玉米螟是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米螟危害造成玉米产量损失在5％左右。我国是玉米螟的多发和重发区，20世纪70年代以来，几乎每两年就大发生一次，年损失玉米380-640万吨，相当于一个中等玉米省的产量。

由于玉米的内源抗虫性是受多基因控制的，且心叶期靶标害虫和穗期靶标害虫基因各自独立遗传，用常规育种方法培育抗螟杂交种不仅周期长，而且很难获得兼抗两个世代玉米螟的亲本。同时，玉米抗螟基因很有可能与高产性状呈负相关，20年来各国抗螟育种均未取得明显进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育抗虫转基因玉米的方法。

本发明所提供的培育抗虫转基因玉米的方法包括将抗虫基因导入目的玉米，得到表达所述抗虫基因的转基因玉米的步骤；所述转基因玉米与所述目的玉米相比，抗虫性提高；所述抗虫基因是编码序列9所示蛋白质的基因。

其中，所述抗虫基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持抗虫蛋白的氨基酸序列不变的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

本发明中，所述抗虫基因具体为下述下述a)或b)或c)的DNA分子：

a)核苷酸序列如序列表中序列3所示；b)核苷酸序列如序列表中序列3的第1-2007位所示；c)核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质(命名为Cry1Ah蛋白)。

在本发明的一个实施例中，所述将抗虫基因导入目的玉米是通过将表达所述抗虫基因的重组DNA片段导入所述目的玉米完成的。

所述重组DNA片段通过重组表达载体导入所述目的玉米。

本发明中所述重组DNA片段均指能够在宿主细胞中表达序列表中序列9所示蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述抗虫基因转录的启动子，还可包括终止子。进一步，所述重组DNA片段还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128，种子贮存蛋白质特异的启动子，例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子等。可用于本发明的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的植物表达载体构建表达所述抗虫基因的所述重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中启动所述抗虫基因转录的启动子为Ubi启动子；所述Ubi启动子的序列为序列表中序列6，或与序列6至少具有80％的同一性，且具有启动子功能。

在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中终止所述抗虫基因转录的转录终止序列如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80％的同一性，且具有转录终止功能。

在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中还包括由Ω序列和Kozak序列顺次连接而成的OMK序列；所述OMK序列如序列表中序列5所示，或与序列5至少具有80％的同一性，且具有增强子功能。

在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段由所述Ubi启动子、所述OMK序列、所述抗虫基因和所述转录终止序列顺次连接组成，命名为Ubi-OMK-mCry1Ah-PolyA-T-NOS，其序列为序列表中序列11。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体含有所述重组DNA片段，将该重组表达载体命名为pS3300-UMG2-UC2A，其序列为序列表中序列12。

其中，序列3由2010个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子，编码序列表中序列9所示的Cry1Ah蛋白。序列5由67个核苷酸组成。序列6由2009个核苷酸组成。序列7由488个核苷酸组成。序列9由668个氨基酸组成。序列11由4605个核苷酸组成，其中第1-2009位为Ubi启动子序列，第2010-2076位为OMK序列，第2083-4092位为mCyr1Ah序列，第4118-4605位为转录终止序列。序列12由15099个核苷酸组成，其中第151-2159位为Ubi启动子序列，第2160-2226位为OMK序列，第2233-4242位为mCyr1Ah序列，第4268-4755位为转录终止序列。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

利用本发明所提供的培育抗虫转基因玉米的方法培育得到的抗虫转基因玉米也属于本发明的保护范围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

在本发明的一个实施例中，所述玉米具体为玉米HiII。在本发明中，所述抗虫具体为抗玉米螟。

实验证实，本发明所提供的人工合成的抗虫基因(序列3)的转基因玉米，其Cry1Ah蛋白蛋白的表达量明显提高，每克(鲜重)叶片中Cry1Ah蛋白的表达量可达3.18μg，而原始基因表达量仅为1.01μg。同时，本发明所提供的人工合成的抗虫基因(序列3)的转基因玉米对靶标害虫的抗性也明显提高，转入mcry1Ah基因的T₆代植株，在玉米5-6叶期接虫后，无明显的虫害，表现正常；而转cry1Ah基因(优化前，序列2)及非转基因植株，在接虫后，虫害非常严重。

附图说明

图1为载体pS3300-UMCT-UMG2、pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的质粒图谱。其中，A为pS3300-UMCT-UMG2的质粒图谱；B为pS3300-UMG2-UCA的质粒图谱；C为pS3300-UMG2-UC2A的质粒图谱。

图2为转基因玉米Cry1Ah基因、mCry1Ah基因和mG2-aroA基因的PCR检测图谱。其中，A为转基因玉米Cry1Ah基因的PCR检测图谱；1：CK⁺(质粒阳性对照)；2：Marker；3：CK^-(未加DNA)；4：CK^-(非转基因玉米)；5-24：转Cry1Ah基因玉米事件。B为转基因玉米mCry1Ah基因的PCR检测图谱；1：CK⁺(质粒阳性对照)；2：Marker；3：CK^-(未加DNA)；4：CK^-(非转基因玉米)；5-24：转mCry1Ah基因玉米事件。C为转基因玉米mG2-aroA基因的PCR检测图谱；1：CK⁺(质粒阳性对照)；2：Marker；3：CK^-(未加DNA)；4：CK^-(非转基因玉米)；5-14：转Cry1Ah基因玉米事件；15-24：转mCry1Ah基因玉米事件。

图3为转基因玉米苗期草甘膦的耐受性检测结果。

图4为转基因玉米田间抗虫性检测结果。其中，A为海南抗虫的转mCry1Ah基因玉米株系；B为海南不抗虫的非转基因对照株系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、密码子优化型抗虫基因的获得

本实施例根据Cry1Ah全长基因(核苷酸序列如序列表中序列1所示，参见中国专利申请：200410009918.9)编码蛋白的前667个氨基酸序列(前667个氨基酸序列如序列表中序列8所示，对应的核苷酸序列如序列表中序列2所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用玉米偏好密码子对Cry1Ah基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有密码子，并调整了密码子的使用频率(表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为序列表中序列3。序列3与Cry1Ah基因(序列1)的1-2001bp(即序列2)的同源性只有70％，而G+C含量由原来的37.4％增加到56.3％。同时为了便于克隆，在起始密码子后添加GGC三个核苷酸。序列3所示基因即为密码子优化型抗虫基因，将其命名为mcry1Ah。密码子在Cry1Ah基因和mcry1Ah基因中的使用频率见表1。为方便克隆，发明人在序列3的5’端引入SpeI酶切位点，在3’端引入AatII酶切位点，最终序列如序列表中序列4所示。序列4的第7-2016位即为序列3。序列1的第1-2001位(即序列2)编码序列表中序列8所示蛋白，序列3以及序列4的第7-2016位均编码序列9所示蛋白(与序列8所示蛋白相比多出序列9自N端起的第2个氨基酸残基)，将该蛋白命名为Cry1Ah蛋白。

表1玉米优选密码子标准

实施例2、mcry1Ah转基因玉米的获得

一、重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的构建

为了提高mcry1Ah基因(序列3)在受体生物中的表达水平，发明人在构建mcry1Ah基因的重组表达载体时，在mcry1Ah基因的5’端添加了Ω序列和Kozak序列，Ω/Kozak序列(简称OMK)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白基因编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，5’端有一个UAUUUUUACAACAA序列以及4个UUAC序列，这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白的序列。启动子选用组成性启动子Ubi启动子，其序列如序列表中序列6所示。再则，在编码序列3’端设计了2个连续的终止密码子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS稳定终止序列。PolyA+T-NOS序列如序列表中序列7所示。其中，PolyA具有维持mRNA稳定等作用，T-NOS终止序列确保了翻译的准确终止。

携带有cry1Ah和mcry1Ah基因的重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A的构建具体程序如下：

a.SpeI和AatII酶切pS3300-UMCT-UMG2质粒(质粒图谱如图1中A所示)，回收大片段。

其中，pS3300-UMCT-UMG2质粒的载体全序列如序列表中序列13所示。该质粒中含有耐草甘膦基因mG2-aroA(序列10，参见中国专利申请：201210107071.2)。

b.人工合成cry1Ah基因(序列2)和mcry1Ah基因(序列3)，并在两端添加SpeI和AatII酶切位点，得到“ACTAGT+序列2+TGA+GACGTC”所示DNA片段以及序列4所示DNA片段；将这两个DNA片段用SpeI和AatII双酶切后与步骤1回收的大片段进行连接反应，获得重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A(两质粒的质粒图谱分别如图1中B和C所示)。

重组表达载体pS3300-UMG2-UCA的结构描述为：将PS3300-UMCT-UMG2质粒的酶切位点SpeI和AatII之间的小片段替换为“序列表中序列2+TGA”所示DNA片段后的重组质粒。

重组表达载体pS3300-UMG2-UC2A的结构描述为：将PS3300-UMCT-UMG2质粒的酶切位点SpeI和AatII之间的小片段替换为序列表中序列3所示DNA片段后的重组质粒。在该载体上，将含有mcry1Ah基因的表达盒命名为Ubi-OMK-mCry1Ah-PolyA-T-NOS；其序列具体如序列表中序列11所示。该载体的全序列具体如序列表中序列12所示。

二、重组表达载体转化玉米获得转基因玉米

1、玉米转化起始材料的获得

取玉米HiII授粉后9～13天的幼穗，剥去苞叶，进行表面消毒。从消毒后的幼穗中剥取幼胚，将其放入感染培养液(配方参考：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1))中清洗一到两次，备用。

2、重组表达载体转化农杆菌

将步骤一制备的重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A分别转化农杆菌LBA4404(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)。

将经过鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2-UCA的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UMG2-UCA。将经过鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2-UC2A的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UMG2-UC2A。

3、农杆菌转化玉米幼胚

将上述步骤1经感染培养液清洗过的幼胚放入OD₆₀₀为0.3-0.5左右的上述步骤2制备的农杆菌的菌液中，放置5分钟，然后将幼胚置于共培养培养基(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)上，在20℃左右黑暗条件下共培养3天，以未进行农杆菌转化的幼胚作对照。

实验同时设置了向受体玉米幼胚中转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的对照。

4、转基因玉米再生苗的获得

将上述步骤3共培养后的幼胚转入选择培养基(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)，在选择培养基中加入终浓度为1mM的草甘膦作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次，直至生长出松脆，颜色鲜黄且生长旺盛的草甘膦抗性愈伤组织。

将所得草甘膦抗性愈伤组织转入诱导培养基(参考文献：MethodsinMolecularBiology,vol.343:AgrobacteriumProtocols,2/e,volume1)进行诱导分化，一个月后即可获得成熟的胚状体。再将胚状体放到MS培养基上生根，即得到T₀代转基因玉米的再生苗。T₀代转基因玉米成熟后获得T₁代转基因玉米的种子，T₁代转基因玉米的种子继续自交繁殖得到T₂代转基因玉米的种子。依此类推，获得T₆代转基因玉米的种子。将T₆代转基因玉米的种子播种后获得T₆代转基因玉米植株。

5、T₆代转基因玉米植株的鉴定

对T₆代转基因玉米植株进行PCR鉴定，具体如下：

首先，分别提取T₆代转基因玉米植株的基因组DNA，具体操作如下：

1)选取转基因玉米再生植株幼嫩叶片0.1-0.2g，在液氮研磨，转移至1.5ml的Eppendorf管中；

2)加入0.7ml的CTAB溶液(配方：Tris终浓度100mM，NaCl终浓度1.4M，EDTA终浓度20mM，CTAB终浓度2％(w/v)，巯基乙醇终浓度0.1％(v/v))，60℃，45分钟，每隔10分钟，颠倒混匀一次。

3)加入0.7ml的酚∶氯仿(体积比为1:1)，颠倒几次，1000rpm离心5分钟，转移上清至新离心管。加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比为24:1)，混匀，1000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管。

4)在离心管加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μL的无菌水中，用于PCR检测。

其次，以上述提取的T₆代转基因玉米植株的基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。操作如下：

1)对转入Cry1Ah基因(序列2)玉米植株进行目的基因(Cry1Ah)的检测，以非转基因玉米作阴性对照，以未加入模板的反应体系为空白对照，以pS3300-UMG2-UCA质粒作为阳性对照，以转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的玉米作为空载对照。PCR扩增引物如下：

1Ah_F：5’-TTAATTGATTTAATATGGGGATTTG-3’(序列2的第241-265位)；

1Ah_R：5’-ACACGCCCTGACCTAGTTGAG-3’(序列2的第1118-1138位的反向互补序列)。

扩增产物长度为898bp。

反应体系(20μL)：DNA1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl₂(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。扩增反应条件为：94℃，5min预变性；35个cycles(94℃，1min；57℃，1min；72℃，1min)；72℃延伸10min。

检测结果如图2中A所示，泳道5-24所示的20株转入Cry1Ah基因的T₆代转基因玉米植株均扩增得到大小为898bp的目的条带；而阴性对照组(非转基因玉米)、空白对照组和空载对照组均没有扩增出目的条带。这一结果说明Cry1Ah基因已经整合进T₆代转Cry1Ah基因玉米的基因组中。

2)对转入mCry1Ah基因(序列3)玉米植株进行目的基因(mCry1Ah)的检测，以非转基因玉米作阴性对照，以未加入模板的反应体系为空白对照，以pS3300-UMG2-UC2A质粒作为阳性对照，以转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的玉米作为空载对照。PCR扩增引物如下：

1mAh_F：5’-CTCAGTCCTCAAGATTCAGACCTTCG-3’(序列3的第501-526位)；

1mAh_R：5’-AAAGTTCTCAAGCACTGGGTTGGTGT-3’(序列3的第869-894位的反向互补序列)。

扩增产物长度为394bp。

反应体系同上。反应体系(20μL)：DNA1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl₂(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。扩增反应条件为：94℃，5min预变性；35个cycles(94℃，1min；57℃，1min；72℃，1min)；72℃延伸10min。

检测结果如图2中B所示，泳道5-24所示的20株转入mCry1Ah基因的T₆代转基因玉米植株均扩增得到大小为394bp的目的条带；而阴性对照组(非转基因玉米)、空白对照组和空载对照组均没有扩增出目的条带。这一结果说明mCry1Ah基因已经整合进T₆代转mCry1Ah基因玉米的基因组中。

3)分别对转入Cry1Ah基因(序列2)和mCry1Ah基因(序列3)的玉米植株进行抗性基因mG2-aroA(序列10)的检测，以非转基因玉米作阴性对照，以未加入模板的反应体系为空白对照，以pS3300-UMG2-UC2A质粒作为阳性对照，以转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的玉米作为空载对照。PCR扩增引物如下：

mG2_F：5’-CCACCTGGCTCCAAGTCTATCA-3’(序列10的第142-163位)；

mG2_R：5’-GCGTCAACCTGTGCTCCAAA-3’(序列10的第715-734位的反向互补序列)。

扩增产物长度为593bp。

反应体系同上。扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40min，35个循环，最后72℃延伸10min。

检测结果如图2中C所示，泳道5-14所示的10株转入Cry1Ah基因的T₆代转基因玉米植株以及泳道15-24所示的10株转入mCry1Ah基因的T₆代转基因玉米植株均扩增得到大小为593bp的目的条带；而阴性对照组(非转基因玉米)和空白对照组均没有扩增出目的条带(空载对照组由于携带mG2-aroA基因因而扩增出了目的条带)。这一结果说明mG2-aroA基因已经整合进T₆代转Cry1Ah或mCry1Ah基因玉米的基因组中。

实施例3、转基因玉米植株Cry1Ah蛋白表达的ELISA检测

实验材料：选取12个转基因事件相同生长阶段(五叶期)的T₆代转基因玉米(转Cry1Ah基因、转mCry1Ah基因，以及转pS3300-UMCT-UMG2空载体)各10株。同时以未转基因的玉米作为阴性对照。

样品处理：各取功能叶(上三叶)叶片1g(鲜重)左右混合，液氮磨碎后，转入10ml离心管中加入3ml样品提取液，剧烈震动，4℃离心1h，取上清为待测样品，备用。

上述鲜重为将叶片用液氮研磨成粉末样品后加入装有提取液的离心管所称重量减去装有提取液的离心管加入粉末样品前的重量。

样品测定方法具体如下：

1、加样：加入50μL酶标二抗到ELISA板(EnviroLogix公司产品，货号：AP003CRBS)每一孔，然后快速加入标样：将Cry1Ah蛋白标样用样品液稀释到3μg/ml，然后2倍稀释11个梯度(包括0孔)每孔加50μL，重复3次。待测样品提取液50μL，重复3次。

其中，Cry1Ah蛋白标样的制备方法如下：将序列1所示的DNA片段连接到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，得到表达Cry1Ah蛋白的原核表达载体pET-28a-Cry1Ah。将pET-28a-Cry1Ah转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导其表达Cry1Ah蛋白，收集菌体后，将菌体通过超声波破碎，将所表达蛋白释放到提取液中，后用His标签蛋白纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司产品，目录号CW0009A)纯化，Cry1Ah蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测。

SDS-PAGE电泳鉴定显示纯度能够达到约95％，经eppendorf蛋白核酸测定仪biophotometerplus测定Cry1Ah蛋白的浓度达到3.0mg/ml。

2、轻微震动混匀每孔样品，要避免样品溅出。

3、室温孵育1-2小时，同时在摇床上以200rpm的速度轻摇。

4、洗板：将样品甩掉，在报纸上摔两下，然后放到洗板机洗板5遍。

5、每孔加入100μl底物缓冲液。

6、避光，孵育15到30分钟。

7、加入100μl终止液。

8、比色：在酶标板上读数，用450nm波长。

9、以不同浓度的Cry1Ah蛋白标准品溶液浓度(ng/mL)作为X轴，以步骤8测量所得的Cry1Ah蛋白标准品的OD值的作为Y轴，用EXCEL绘制标准曲线。

10、将步骤8测量所得的待测样品的OD值代入上述步骤9绘制的标准曲线方程，计算待测样品中Cry1Ah蛋白含量。

11、Cry1Ah蛋白占鲜重的含量＝待测样品中Cry1Ah蛋白含量×待测样品的体积/样品鲜重，单位：μg/g

12、实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线，其标准曲线方程为y＝9035.2x+198.75(R²＝0.9997)。

13、待测样品的检测结果如表2所示，可见，T₆代转基因玉米中Cry1Ah蛋白的表达量均明显高于非转基因玉米(P<0.01)，且转mCry1Ah基因玉米中Cry1Ah蛋白的表达量显著高于转Cry1Ah基因玉米(P<0.05)。转入PS3300-UMCT-UMG2空载体的T₆代玉米植株中Cry1Ah蛋白的表达量和未转基因的玉米植株基本一致，无显著差异。这一结果表明，经过密码子优化后，Cry1Ah蛋白在转基因玉米中的表达量得到了明显的提高。

表2转基因植株Cry1Ah蛋白表达的ELISA检测结果

注：Cry1Ah蛋白浓度单位μg/g，表示每克叶片(鲜重)所测Ccry1Ah蛋白的微克数。

实施例4、转基因玉米植株田间除草剂耐性及抗虫性检测

一、转基因玉米植株田间除草剂耐性检测

1、试验材料：T₆代转Cry1Ah和mCry1Ah基因玉米植株，以及转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的T₆代玉米植株，同时设置非转基因玉米植株对照。

2、试验设计：5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35cm

3、试验处理：按照800ml/亩的用量喷施农达(Roundup，含41％的草甘膦，田间推荐使用剂量为150-250ml/亩)。

4、试验处理时期：5-6叶期。7天后开始观察实验结果。

5、试验结果

如图3(喷施农达15天后)所示：(1)转mcry1Ah基因植株，在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常。(2)转cry1Ah基因植株，在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常。(3)转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的植株，在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常。(4)非转基因植株均已全部死亡。

二、转基因玉米植株田间抗虫性检测

2、试验设计：5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35cm

3、试验处理：将经步骤一喷施草甘膦存活后的转基因植株接虫(非转基因玉米植株未喷施草甘膦)，每株接人工饲养的初孵幼虫(玉米螟)30～40头，用毛笔接种到玉米心叶中，接虫3天后，第2次接虫，接虫数量同第1次。14天后调查玉米叶片受玉米螟的危害程度和幼虫存活数，调查按玉米抗虫性鉴定技术规范NY/T1248.5执行。

4、试验处理时期：在玉米植株发育至8-10叶期(小喇叭口期)时进行人工接虫，接虫时间选择在清晨或傍晚。

5、试验结果

如图4及表3所示：(1)转mCry1Ah基因植株，表现正常，后期的生长期内均无虫害反应；(2)转Cry1Ah基因植株、转入pS3300-UMCT-UMG2空载体的植株和非转基因植株均虫害严重。这一结果表明，转入密码子优化后的mCry1Ah基因的玉米，其抗虫性得到了明显的提高。

表3转基因植株抗虫性鉴定结果

Claims

1.一种培育抗虫转基因玉米的方法，包括将抗虫基因导入目的玉米，得到表达所述抗虫基因的转基因玉米的步骤；所述转基因玉米与所述目的玉米相比，抗虫性提高；所述抗虫基因为下述a)或b)或c)的DNA分子：

a)核苷酸序列如序列表中序列3所示；

b)核苷酸序列如序列表中序列3的第1-2007位所示；

c)核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将抗虫基因导入目的玉米是通过将表达所述抗虫基因的重组DNA片段导入所述目的玉米完成的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组DNA片段通过重组表达载体导入所述目的玉米。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述重组DNA片段和所述重组表达载体中启动所述抗虫基因转录的启动子为Ubi启动子；所述Ubi启动子的序列为序列表中序列6，或与序列6至少具有80％的同一性，且具有启动子功能。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述重组DNA片段和所述重组表达载体中终止所述抗虫基因转录的转录终止序列如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80％的同一性，且具有转录终止功能。

6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述重组DNA片段和所述重组表达载体中还包括由Ω序列和Kozak序列顺次连接而成的OMK序列；所述OMK序列如序列表中序列5所示，或与序列5至少具有80％的同一性，且具有增强子功能。

7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述重组DNA片段的序列为序列表中序列11。

8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体的序列为序列表中序列12。

9.利用权利要求1-8所述方法培育得到的抗虫转基因玉米。