CN102234647A - 一个水稻逆境诱导启动子kt619p的鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种受干旱或盐诱导的水稻启动子及其应用。所述启动子KT619P具有SEQIDNo：1所示的核苷酸序列，或者是在高严谨条件下可与该序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。该启动子在干旱或高盐条件下表现出一定的诱导性。通过构建含有这个启动子的植物表达载体，将其转化到水稻中，在干旱和盐诱导条件下，对转基因材料的抗性愈伤组织和T0代幼苗进行了GUS组织化学染色，结果证实了KT619P启动子在干旱条件诱导下可以更强地驱动报告基因的表达。

Description

一个水稻逆境诱导启动子KT619P的鉴定和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种植物逆境诱导性启动子的分离鉴定和应用。

背景技术

植物基因的启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子（其基因的表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达出来）、诱导型启动子（其基因的表达受某种物质的诱导，没有诱导物存在，基因表达水平很低甚至没有）和组织特异性启动子（其基因的表达分布在植物的某个组织或器官中）。

目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如CAM 35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子（Battraw and Hall，1990; Christensen et al. 1992），然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间（发育阶段特异性）或空间（组织器官特异性）不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

此外,在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上的基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化（Lin et al. 2003; Chen et al. 2006），但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。因此，克服以上转化技术上的困难，就很有必要克隆更多的组织器官特异性或者特定条件诱导型表达的启动子，这样可以根据需要选择不同的启动子诱导目的基因在适合的时间或空间表达。

尽管许多植物（如，水稻，尤其是Oryza sativa.japonica等）的基因组序列已经被揭示（如可参见GenBank登录号AP003843.3、GenBank登录号AP004670.4等），但是大量基因组序列的功能仍旧未知。

为此，本发明人经过长期研究，发现了一个新的逆境诱导型启动子，在植物基因工程改造中具有良好的应用前景。 

发明概述

本发明提供了一个核苷酸启动子序列，其具有逆境诱导表达的功能。另外，本发明还涉及包含该DNA核苷酸序列的表达盒和转基因植物等，并涉及该启动子DNA的应用。

本发明所提供的逆境诱导启动子，来源于稻属水稻（Oryza sativa L. ssp. japonica），是序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，由1000个碱基组成。

具体而言，本发明提供了分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受逆境诱导转录和/或表达，所述分离的DNA的序列选自下列组的序列：

（a）具有SEQ ID NO：1所示的序列；

（b）在严格条件下能够与（a）所述序列的DNA杂交的DNA序列；

（c）与（a）所述序列有至少90%（优选为至少95%）序列同一性的DNA序列；

（d）包含SEQ ID NO：1中至少150个（优选为至少200个）连续核苷酸的DNA序列；和

（e）与（a）-（d）之任一所述序列互补的DNA序列。

       本发明还提供了表达盒，其包含：

（a）本发明所提供的启动子DNA；和

（b）核酸，其可操作地连接在本发明所提供的启动子DNA的下游。

优选本发明所提供的表达盒，其中所述核酸能够赋予植物选自下列组的性状：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所编码反义RNA可以抑制同源基因转录产物含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

另外，本发明提供了用本发明所述的表达盒转化的转基因的植物、植物种子、植物组织或植物细胞，优选其中，本发明所提供的启动子DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在逆境条件下诱导表达。

优选本发明转基因的植物、植物种子、植物组织或植物细胞，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，如，玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、大豆、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甘蔗、甜菜、烟草或拟南芥，优选是水稻。

本发明提供了本发明所述转基因植物的生产方法，其包括：

（1）构建含本发明启动子的表达盒；

（2）将步骤（1）获得的表达盒导入植物细胞；

（3）再生出转基因植物；和

（4）选择出转基因植物，其中本发明的启动子DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在逆境条件下诱导表达；并且

（5）任选地，增殖步骤（4）获得的植物以获得后代。

本发明还提供了赋予植物性状的方法，其包括

（1）选择能够赋予植物性状的核酸：

（2）使用步骤（1）获得的核酸构建本发明所述的表达盒；

（3）将步骤（2）获得的表达盒导入植物细胞；

（4）再生出转基因植物；和

（5）选择出赋予了植物性状的转基因植物；并且

（6）任选地，增殖步骤（5）获得的植物以获得后代，

       其中，所述性状选自下列组：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所转录的反义RNA抑制转化植物中同源基因表达产物含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

发明详述

在第一方面，本发明提供了分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物受逆境的条件下诱导表达。

在本文中，这种分离的DNA也可以被称为逆境诱导性启动子，属于顺式作用元件。在逆境诱导性启动子的驱动下，其下游并与其可操作地连接的基因的表达往往在逆境条件下会大幅度提高。在本发明的具体实施方式中，通过肉眼可观测的染色法直接判别本发明的逆境诱导启动子在各种逆境处理条件下的表达。

在本文中，术语“可操作地连接”指的是一种连接方式，该方式使得连接在下游的核酸的转录和/或表达由本发明的逆境诱导性启动子启始并调控。通常，可操作地连接的核酸是连续的。下游的核酸在保持蛋白翻译读码框的情况下可以间隔少量核苷酸而连接在启动子的下游，接受其调控。

在本文中，术语“分离的”DNA指的是DNA从其天然的环境（如，植物细胞的基因组）中被分离出来了，或者被化学合成或重组表达出来，并且DNA不含或者基本不含其来源物种的其他核酸、细胞和培养基。本发明的分离的DNA具有较短的核酸序列，优选序列长度小于2000个核苷酸，优选小于1500个核苷酸，更优选小于1200个核苷酸。在本发明的具体实施方式中，本发明的分离的DNA是具有1000个核苷酸的SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明的分离的DNA还包括具有SEQ ID NO：1所示的序列的DNA的功能等价体，即具有SEQ ID NO：1的变异序列的DNA，其仍旧能够指导可操作地连接在其下游的核酸在逆境条件下诱导表达。变异序列包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：1所示的序列DNA杂交的DNA序列。本文中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES（pH6.4）和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1SDS、和0.1%SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

变异序列还包括与SEQ ID NO：1所示序列有至少90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的DNA序列。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

变异序列还包括能够保持逆境诱导启动子特性的SEQ ID NO：1所示的序列的片段，例如SEQ ID NO：1中至少150个、200个、300个、500个、800个、直至999个连续核苷酸的DNA序列。

       在第二方面，本发明提供了表达盒，其包含：

       （a）本发明第一方面的DNA；和

（b）核酸，其可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游。

本发明的表达盒在5’-3’的转录方向上包含本发明第一方面的DNA、可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸、任选的转录和翻译的终止区（如，转录终止元件或多聚腺苷酸化信号）。本发明的表达盒还可以包括，在细菌中复制所需的复制起点（例如，来自pBR322或P15A ori的ORI区），土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件（例如，T-DNA的左边界和/或右边界）。本发明表达盒可以包含的其他成分包括，增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等。示例性的增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米矮缩I基因、TMV Ω元件和酵母的启动子的增强子元件。也可以采用病毒前导序列来作为具有增强子效用的远见，如来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列等。示例性的植物内含子包括来自Adh 1、bronze 1、肌动蛋白1、肌动蛋白2的内含子、以及蔗糖合酶内含子。 

在本文中，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸编码异元蛋白的多核苷酸、编码融合蛋白的多核苷酸、反义序列、编码dsRNA序列的多核苷酸，等等。优选是能够赋予植物有益的性状的核酸，所述性状包括：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所转录的反义RNA抑制转化植物中同源基因表达产物含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

       相应地，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸可以编码蛋白的基因，如昆虫抗性基因、细菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因、线虫疾病抗性基因、除草剂抗性基因、影响谷粒组成或品质的基因、养分利用基因、真菌毒素减少基因、雄性不育基因、可选择标记物基因、可筛选标记物基因、阴性可选择标记物基因、阳性可选择标记物基因、影响植物农学特征(如产率)的基因、环境胁迫抗性基因(例如，赋予对干旱、热、寒冷、冷冻、过湿、盐胁迫或氧化胁迫的抗性或耐性的基因)、改善淀粉特性或数量、油品数量或品质、氨基酸或蛋白质组成的基因，等等。另外，可操作地连接在本发明第一方面的DNA的下游的核酸也可以编码dsRNA、反义RNA、siRNA、miRNA，其与其同源的基因多核苷酸序列（如，需要下调表达的植物启动子，寄生植物体生物存活、生长或繁殖所必须的植物基因）互补并导致这些多核苷酸基因表达产物的下调。

       本发明的表达盒可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。

在第三方面，本发明提供了用本发明第二方面的表达盒转化的转基因的植物、植物种子、植物组织或植物细胞。

本发明的具体实施方式已经通过在有代表性的单子叶植物中的有效应用证明了本发明的逆境诱导启动子的植物使用范围，因此本发明的逆境诱导启动子可用于转化任何植物物种，例如来自以下属的植物：苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、小黑麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属、烟草属、南瓜属、蔷薇属、草莓属、百脉根属、驴食草属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡芦巴属、萝卜属、白芥属、颠茄属、曼陀罗属、天仙子属、烟草属、碧冬茄属、毛地黄属、菊苣属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、水仙属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、喇叭舌属、蓝英花属、菜豆属、燕麦属和葱属，优选的植物包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、大豆、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甘蔗、甜菜、烟草或拟南芥，更优选是水稻。

在第四方面，本发明提供了本发明第三方面的植物的生产方法，其包括：

（1）构建本发明第二方面的表达盒；

（2）将步骤（1）获得的表达盒导入植物细胞；

（3）再生出转基因植物；和

（4）选择出转基因植物，其中本发明第一方面的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在逆境条件下被诱导表达；并且

（5）任选地，增殖步骤（4）获得的植物以获得后代。

发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术（可参见Horsch RB等(1985)Science 225：1229；White FF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization， Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等.Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization， Academic Press，1993，pp.128-143，等）。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

在第五方面，本发明还提供了赋予植物性状的方法，其包括

（1）选择能够赋予植物性状的核酸：

（2）使用步骤（1）获得的核酸构建本发明第二方面的表达盒；

（3）将步骤（2）获得的表达盒导入植物细胞；

（4）再生出转基因植物；和

（5）选择出赋予了植物性状的转基因植物；并且

（6）任选地，增殖步骤（5）获得的植物以获得后代，

       其中，所述性状选自下列组：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所转录的反义RNA抑制转化植物中同源基因表达产物含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

本文中，“选择”可以是田间或温室选择，也可以是使用遗传标记的遗传选择。在本文中，“增殖”可以有性繁殖，也可以是无性繁殖。在有性繁殖中，显然可以进行额外的杂交步骤，并选择出继承了转基因性状的后代。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了。

附图说明

图1是水稻KT619基因在干旱和200mM NaCl诱导条件下的表达分析。

图2是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。该载体含潮霉素（hpt）抗性筛选基因，启动子构建在GUS基因的5’端。

图3 是KT619P转基因抗性愈伤在正常生长（CK）、干旱（20% PEG6000）和盐(200mM NaCl)处理条件下的GUS染色分析。

图4 是KT619P转基因T0代幼苗在正常生长（CK）和干旱（空气中急性干旱）处理条件下的GUS染色分析。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英俊生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自Invitrogen公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。

⒈启动子KT619P的分离和鉴定

设计克隆启动子KT619P所需引物：

引物1 ：5’-aagctt GTACACAAAGGACTGTTGAGTAATAG -3’

引物2 ：5’- ggatccGTTTGATAGGGAGGGGGATTTTG-3’

引物1中序列aagctt为Hind III的限制性识别位点，引物2中序列ggatcc为BamHI的酶切位点。

利用启动子的正反向引物（其中带下划线部分的序列为启动子序列），以植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取的水稻(中花11)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是： 95℃预变性5分钟；94℃变性30秒； 55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；32个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T1，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列为预期的KT619P启动子序列。

将测序验证已经插入KT619P启动子序列的质粒用HindIII和BamHI双酶切，连入同样用Hind III 和BamHI双酶切的载体pHPG，挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pHPG-KT619P。

菌落PCR检测所需引物：

引物3：5’- TCTCCGCTCATGACGATAAT -3’

引物4：5’- GACGTAACATGGTGAAGGGG -3’

引物3和引物4为pHPG载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段约为各启动子的长度，以阳性克隆菌液为模板，扩增检测，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；34个循环；72℃延伸10分钟。

所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图2所示，其中：LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的终止子；HindIII和BamHI分别表示内切酶HindIII和BamHI的酶切位点；诱导型启动子即为本发明通过RT-PCR分析选择并克隆出的受逆境诱导的启动子。

⒉转基因水稻的获得

用农杆菌介导法将按具体实施方式2获得的启动子KT619P转化水稻，利用热激法将质粒pHPG-KT619P转入农杆菌AGL0菌株（中国科学院遗传所赠送），利用农杆菌对水稻进行共转化。

⒊转基因水稻中的GUS基因逆境诱导表达分析

3.1 植物材料及处理 

选取两叶期的KT619P转基因水稻材料进行逆境处理。其中干旱处理的材料和样品在以下阶段收集：期1（D1）：叶轻微卷，相对含水量（RWC）在90%-95%；期2（D2）：叶半卷，相对含水量（RWC）在80%-85%；期3（D3）：叶完全卷，相对含水量在70%-75%。D1、D2和D3代表干旱处理的三个阶段。对每个处理阶段，取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃。

200mM 高盐处理的材料和样品也分以上三个时期进行收集和保存。

3.2  RT-PCR表达分析

GUS基因的RT-PCR检测引物：

引物5：5’-TAATGTTCTGCGACGCTCAC -3’

引物6：5’-CGGCGAAATTCCATACCTG -3’

引物5和引物6是根据序列表中SEQ ID No：2序列设计的GUS基因引物，扩增片段321bp。

水稻内参基因Actin的RT-PCR引物：

引物7：5’- TGTTCCTGCCATGTATGT -3’

引物8：5’- ATGTCCCTCACAATTTCC -3’

引物7和引物8是根据序列表中SEQ ID No：3序列设计的Actin基因引物，扩增片段321bp。Actin基因的RT-PCR扩增片段是252bp。

以上引物分别以经过步骤1.1处理后的水稻幼苗cDNA为模板，阴性对照模板为正常生长的中花11幼苗cDNA，检测这些基因在盐处理和干旱处理中的表达变化，PCR检测体系和程序为：

10×buffer          2 ul

10mM dNTP             0.4 ul  

10 mM引物F           0.4 ul 

10 mM引物R          0.4 ul

Taq polymerase    0.4 ul

cDNA                        1 ul 

ddH2O                      15.4 ul

PCR反应条件为：预变性：95℃,5分钟；变性：94℃，30秒,，退火：55℃，30秒，延伸：72℃，30秒，28个循环；72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图2，其中：D表示干旱处理； S表示盐处理；字母后的数字1、2和3分别指干旱处理和盐处理的三个程度；CK为正常生长的转基因苗。GUS指该GUS基因的扩增产物；Actin指水稻 Actin 基因的扩增产物。由图可见，GUS基因在水稻幼苗中呈现出干旱和盐诱导性。

⒋转基因抗性愈伤组织干旱和盐处理后的GUS染色

将转化KT619P启动子所得到的具有潮霉素抗性的愈伤组织，转移到分别含有或不含200mM NaCl和20%PEG6000的MS培养基上，处理1h后，进行GUS染色实验。

图3显示了KT619P转基因抗性愈伤组织经过200mM NaCl和20%PEG6000处理1h时后的GUS染色结果。

通过X-gluc显色检测GUS活性，证实了本发明的启动子KT619P在干旱条件下增强了GUS报告基因的表达。

⒌转基因水稻幼苗干旱处理后的GUS染色

将转化KT619P启动子所得到的转基因幼苗剪取部分叶片进行正常生长条件和空气中干旱30分钟后的GUS染色实验。结果如图4所示，选取的不同的转基因植株，其GUS染色程度呈现一定的干旱诱导性。 

序列表（SEQUENCE LISTING）

 <110>  北京未名凯拓作物设计中心有限公司

<120>  一个水稻逆境诱导启动子KT619P的鉴定和应用

<150>  201010178075.0

<151>  2010-05-20

<160>  3     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1000

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>  1

gtacacaaag gactgttgag taatagcaca ttggtatatt atttatgaat tccagaaagg     60

tcaccatatc tacctactgt tttaggtaaa actagctgtc aatgaatcta aataaacgat    120

tgaagatgaa caagtagcca aagactattc aaagaaagag aagaatttac cagtgtcttg    180

atcaaacagt ttccaagcta tacgtaacat gcagagtgga atgaacaatt ggagtgctgg    240

cataggccat gtttaacatt tgcagattca ctgaagatat tgttgtcgca tcttgatata    300

aaaggctagg aaggtaattg ctttacttgg tcacaagaac caatttggcc agagtgccta    360

atgcattact ctatgtttga gcacacatta ttcactataa ctgtgtagca ttcaagatga    420

tatttgacat attaagaatg aaaaagaaaa ggagaaactt acatctgatt gtgaacttag    480

atggtgtaaa caactggtgc aatttctaaa tgaagattca aatatcatgc cctgttcata    540

tttccaaatc tttctcatct cccttctctg ggtaaatttc acatgcattg caatcgccat    600

tccataggaa aaatgacggc tatgcgcatt gcagattcta cctggaacag agaaaacagt    660

tgttacttta gacagaattt ccacacagaa aagcattttt tcgagaaagc atacctttct    720

ctacgacgcc gacatgttcg cagcaataac ctaatgctat atctcataaa tcaacatgat    780

aatctcaaac agccacaaag atgcaaaggc aaacttgctt acaacacaag taggccattg    840

tctacaactt tagatgcttt tctgacaatt taaaaggaac acatctctgc tcaaccttcc    900

cctccattca ttcagagcac ccaactcctt gaaactaaaa tccactgcct ctttcctcct    960

ccacattgca aaccttccaa aatccccctc cctatcaaac                         1000

<210>  2

<211>  1812

<212>  DNA

<213>  大肠杆菌（Escherichia coli）

<400>  2

atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca     60

ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa    120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatttt    180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca    240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat    300

aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg    360

tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgcg tgaacaacga actgaactgg    420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac    480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg    540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg    600

tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat    660

caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac    720

ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca    780

gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag    840

ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac    900

ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg    960

attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg   1020

gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct   1080

ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc   1140

aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa   1200

aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt   1260

gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg   1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt   1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg   1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt   1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg   1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc   1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata   1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg   1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga   1800

ggcaaacaat ga                                              1812

<210>  3

<211>  1134

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>  3

atggctgacg gtgaggatat ccagcctctt gtctgtgaca atggcactgg aatggtcaag     60

gctgggtttg ctggagatga tgcaccaagg gctgtttttc ctagcattgt tggtcgtcct    120

cgccacactg gtgtcatggt agggatgggg cagaaggatg catatgttgg tgacgaagca    180

cagtccaaga gaggtattct cacgttgaag tacccaattg agcatggtat tgtaagcaac    240

tgggatgaca tggagaagat ctggcatcac actttctata atgagcttcg tgttgcacct    300

gaggagcacc ctgtgttgct cactgaagct cccttgaacc ccaaagccaa cagggagaaa    360

atgacacaga ttatgtttga gacgttcaat gttcctgcca tgtatgttgc aatccaagca    420

gtgctttcac tctatgctag tggccgaaca acaggtattg ttctggactc gggtgatggt    480

gtgagccata ctgttcccat ctatgaagga tatgcacttc ctcatgcaat ccttcgtctg    540

gatcttgctg gccgtgacct cacggattct cttatgaaga tcctcactga aaggggttac    600

tcgttcacaa cctctgccga gcgggaaatt gtgagggaca tcaaggaaaa gcttgcatat    660

gttgcacttg attatgagca agagctggaa actgccaaga acagctcttc aattgagaag    720

agctatgagc tgcctgatgg ccaggtgatt accattggct cagagaggtt taggtgccct    780

gaggtcctct tccaaccatc catgattggt atggagtccg ctggaatcca tgaaacaacc    840

tacaattcca tcatgaagtg cgacgtagat atcaggaagg acctgtatgg caacgtagtg    900

ctgagtggag gcacaacaat gttccctggc atcgccgacc gtatgagcaa ggagatcact    960

gcccttgctc caagcagcat gaagatcaag gttgtcgctc cacctgaacg caagtacagt   1020

gtctggatag gagggtctat cctggcttct ctcagcacct tccagcagat gtggatatcg   1080

aaggatgagt atgatgaatc tggcccagca attgttcaca ggaagtgctt ctga         1134

序列表（SEQUENCE LISTING）

 <110>  北京未名凯拓作物设计中心有限公司

<120>  一个水稻逆境诱导启动子KT619P的鉴定和应用

<150>  201010178075.0

<151>  2010-05-20

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1000

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

 

<400>  1

gtacacaaag gactgttgag taatagcaca ttggtatatt atttatgaat tccagaaagg     60

tcaccatatc tacctactgt tttaggtaaa actagctgtc aatgaatcta aataaacgat    120

tgaagatgaa caagtagcca aagactattc aaagaaagag aagaatttac cagtgtcttg    180

atcaaacagt ttccaagcta tacgtaacat gcagagtgga atgaacaatt ggagtgctgg    240

cataggccat gtttaacatt tgcagattca ctgaagatat tgttgtcgca tcttgatata    300

aaaggctagg aaggtaattg ctttacttgg tcacaagaac caatttggcc agagtgccta    360

atgcattact ctatgtttga gcacacatta ttcactataa ctgtgtagca ttcaagatga    420

tatttgacat attaagaatg aaaaagaaaa ggagaaactt acatctgatt gtgaacttag    480

atggtgtaaa caactggtgc aatttctaaa tgaagattca aatatcatgc cctgttcata    540

tttccaaatc tttctcatct cccttctctg ggtaaatttc acatgcattg caatcgccat    600

tccataggaa aaatgacggc tatgcgcatt gcagattcta cctggaacag agaaaacagt    660

tgttacttta gacagaattt ccacacagaa aagcattttt tcgagaaagc atacctttct    720

ctacgacgcc gacatgttcg cagcaataac ctaatgctat atctcataaa tcaacatgat    780

aatctcaaac agccacaaag atgcaaaggc aaacttgctt acaacacaag taggccattg    840

tctacaactt tagatgcttt tctgacaatt taaaaggaac acatctctgc tcaaccttcc    900

cctccattca ttcagagcac ccaactcctt gaaactaaaa tccactgcct ctttcctcct    960

ccacattgca aaccttccaa aatccccctc cctatcaaac                         1000

 

<210>  2

<211>  1812

<212>  DNA

<213>  大肠杆菌（Escherichia coli）

 

<400>  2

atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca     60

ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa    120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatttt    180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca    240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat    300

aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg    360

tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgcg tgaacaacga actgaactgg    420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac    480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg    540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg    600

tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat    660

caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac    720

ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca    780

gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag    840

ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac    900

ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg    960

attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg   1020

gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct   1080

ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc   1140

aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa   1200

aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt   1260

gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg   1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt   1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg   1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt   1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg   1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc   1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata   1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg   1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga   1800

ggcaaacaat ga                                              1812

 

 

<210>  3

<211>  1134

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

 

<400>  3

atggctgacg gtgaggatat ccagcctctt gtctgtgaca atggcactgg aatggtcaag     60

gctgggtttg ctggagatga tgcaccaagg gctgtttttc ctagcattgt tggtcgtcct    120

cgccacactg gtgtcatggt agggatgggg cagaaggatg catatgttgg tgacgaagca    180

cagtccaaga gaggtattct cacgttgaag tacccaattg agcatggtat tgtaagcaac    240

tgggatgaca tggagaagat ctggcatcac actttctata atgagcttcg tgttgcacct    300

gaggagcacc ctgtgttgct cactgaagct cccttgaacc ccaaagccaa cagggagaaa    360

atgacacaga ttatgtttga gacgttcaat gttcctgcca tgtatgttgc aatccaagca    420

gtgctttcac tctatgctag tggccgaaca acaggtattg ttctggactc gggtgatggt    480

gtgagccata ctgttcccat ctatgaagga tatgcacttc ctcatgcaat ccttcgtctg    540

gatcttgctg gccgtgacct cacggattct cttatgaaga tcctcactga aaggggttac    600

tcgttcacaa cctctgccga gcgggaaatt gtgagggaca tcaaggaaaa gcttgcatat    660

gttgcacttg attatgagca agagctggaa actgccaaga acagctcttc aattgagaag    720

agctatgagc tgcctgatgg ccaggtgatt accattggct cagagaggtt taggtgccct    780

gaggtcctct tccaaccatc catgattggt atggagtccg ctggaatcca tgaaacaacc    840

tacaattcca tcatgaagtg cgacgtagat atcaggaagg acctgtatgg caacgtagtg    900

ctgagtggag gcacaacaat gttccctggc atcgccgacc gtatgagcaa ggagatcact    960

gcccttgctc caagcagcat gaagatcaag gttgtcgctc cacctgaacg caagtacagt   1020

gtctggatag gagggtctat cctggcttct ctcagcacct tccagcagat gtggatatcg   1080

aaggatgagt atgatgaatc tggcccagca attgttcaca ggaagtgctt ctga         1134

 

Claims (8)

1. 一种分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受逆境诱导表达，所述分离的DNA的序列选自下列组的序列：

（a）具有SEQ ID NO：1所示的序列；

（b）在严格条件下能够与（a）所述序列的DNA杂交的DNA序列；

（c）与（a）所述序列有至少90%（优选为至少95%）序列同一性的DNA序列；

（d）包含SEQ ID NO：1中至少150个（优选为至少200个）连续核苷酸的DNA序列；和

（e）与（a）-（d）之任一所述序列互补的DNA序列。

2. 权利要求1所述的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受逆境诱导转录或表达。

3. 一种表达盒，其包含：

（a）权利要求1-2之任一所述的DNA；和

（b）核酸，其可操作地连接在权利要求1-2之任一所述的DNA的下游。

4. 权利要求3所述的表达盒，其中所述核酸能够赋予植物选自下列组的性状：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所编码反义RNA可以抑制同源基因转录产物含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高，尤其是抗发生在植物根部病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

5.用权利要求3或4所述的表达盒转化的转基因的植物、植物种子、植物组织或植物细胞，其中，权利要求1-2之任一所述的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中转录和/或表达。

6.权利要求5所述的植物、植物种子、植物组织或植物细胞，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，如，玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、大豆、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甘蔗、甜菜、烟草或拟南芥，优选是水稻。

7. 权利要求5或6所述的植物的生产方法，其包括：

（1）构建权利要求3或4所述的表达盒；

（2）将步骤（1）获得的表达盒导入植物细胞；

（3）再生出转基因植物；和

（4）选择出转基因植物，其中权利要求1-2之任一所述的DNA能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物根部特异转录和/或表达；并且

（5）任选地，增殖步骤（4）获得的植物以获得后代。

8. 赋予植物性状的方法，其包括

（1）选择能够赋予植物性状的核酸：

（2）使用步骤（1）获得的核酸构建权利要求3或4所述的表达盒；

（3）将步骤（2）获得的表达盒导入植物细胞；

（4）再生出转基因植物；和

（5）选择出赋予了植物性状的转基因植物；并且

（6）任选地，增殖步骤（5）获得的植物以获得后代，

       其中，所述性状选自下列组：

（a）所述核酸所编码的蛋白质产量的提高； 

（b）所述核酸所编码反义RNA可以抑制同源基因转录产物含量的提高；

（c）抗逆性（包括抗旱性、耐寒性、耐高温性、和耐盐性）的提高；

（d）抗植物病虫害能力的提高，尤其是抗发生在植物根部病虫害能力的提高；

（e）营养品质的改善，包括植物中天然具有的营养成分含量的提高和植物非天然具有的营养成分的赋予；和

（f）植物产量的提高，尤其是植物经济性部位产量的提高。

Images