CN101413006A

CN101413006A - 一种干旱诱导的水稻花特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN101413006A
Application number: CNA2008102278730A
Authority: CN
Inventors: 刘敏; 翟晨光; 邓兴旺; 夏勉
Original assignee: BEIJING KAITUODIEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CENTER Co Ltd
Current assignee: BEIJING KAITUODIEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CENTER Co Ltd
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2028-12-02
Also published as: CN101413006B; WO2010063162A1

Abstract

本发明公开了一种干旱诱导的水稻花特异性启动子及其应用。所述启动子具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者是在高严谨条件下可与该序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。该启动子具有花组织特异性，且在干旱诱导条件下表现出一定的诱导性。通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到转基因水稻中，在干旱诱导条件下，对转基因材料的普通叶、剑叶和花等多种不同组织进行了GUS组织化学染色和RT－PCR检测，结果证实了该启动子在干旱诱导下在水稻花组织中驱动基因的表达。该启动子的克隆对于研究水稻雄性不育植株研究具有较大实际意义，可用于创制水稻及其他植物的不育系和保持系双系。

Description

一种干旱诱导的水稻花特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物启动子及其应用，特别涉及一种来自水稻的，表现出组织特异及干旱诱导性的启动子的克隆及其功能分析。

背景技术

高等植物发育过程中花器官的形成是一个十分复杂的过程，它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化，同时伴随大量基因的协同表达。习惯上，将植物基因的启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子(其基因的表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达出来)、诱导型启动子(其基因的表达受某种物质的诱导，没有诱导物存在，基因表达水平很低甚至没有)和组织特异性启动子(其基因的表达分布在植物的某个组织或器官中)。

在某些情况下，导入的外源基因需要在特定的时间内的某个组织中特异表达，组成型表达不仅大量消耗了植物自身的能量，还有可能同时对其它基因的表达与作用产生影响。组织特异性启动子是细胞分化、基因特异性表达、基因工程研究及实际应用中的重要工具，因此分离不同组织特异性启动子是基因工程发展的需要。

杂交水稻为我国粮食增产作出了巨大贡献，其中很重要的便是通过雄性不育工程提高杂交水稻的产量。当一些特异性基因比如致死基因、不育基因等在花特异性启动子的驱动下，可以特异性的在花期表达从而使得植株败育或是不育，雄性不育系主要在杂种优势利用(植物)上作母本，可以省去去雄工作，便于杂交制种，为生产上大规模利用杂种一代优势创造条件。雄性不育系也正是因为可以免除人工去雄，节约人力，降低种子成本，还可保证种子的纯度。目前水稻、玉米、高粱、洋葱、蓖麻、甜菜和油菜等作物已经利用雄性不育系进行杂交种子的生产；对其他作物的雄性不育系，也正在进行广泛的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻花特异性启动子，并在干旱诱导条件下表现出一定的诱导性。

本发明所提供的干旱诱导的花特异性启动子，来源于稻属水稻(Oryzasativa L.ssp.japonica)，是如下a)或b)的核苷酸序列：

a)序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

b)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No：1由1305个碱基组成。

含有本发明启动子的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明通过对芯片杂交微阵列数据进行分析，发现水稻KT250基因(序列如SEQ IDNo：2所示)的表达具有在干旱诱导条件下的花组织特异性，克隆该基因的启动子，命名为KT250-DP(序列如SEQ ID No：1所示)。该启动子具有花组织特异性，且在干旱诱导条件下表现出一定的诱导性。通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到转基因水稻中，在干旱诱导条件下，对转基因材料的普通叶、剑叶和花等多种不同组织进行了GUS组织化学染色和RT-PCR检测，结果证实了该启动子在干旱诱导下在水稻花组织中驱动基因的表达。

本发明启动子可应用于植物杂交育种领域，特别是杂交水稻育种，它的克隆对于水稻雄性不育植株研究具有较大实际意义，例如，该启动子可以用于培育干旱诱导的水稻雄性不育植株。进一步说，应用本发明的启动子可创制水稻及其他植物的不育系和保持系双系：当将不育基因构建于该启动子下游时，在干旱条件的诱导下不育基因表达，形成败育植株，即构成不育系(作为杂交育种中通常所说的“母本”)；当处于正常条件下，不育基因处于不表达状态，此时能形成正常的花粉，为可育，从而使不育性状保持到后代，此时即为保持系。

下面通过实施例，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1是1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增得到的启动子(KT250-DP)片段产物。

图2是1.5％琼脂糖凝胶电泳检测用Bsa I酶切后的启动子(KT250-DP)片段产物。

图3是用Hind III和Nco I酶切载体pCAMBIA1303后1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图4是通过PCR扩增检测阳性克隆的1％琼脂糖凝胶电泳结果。

图5是本发明所构建的表达载体pCAMBIA1303-DP的T-DNA区的图谱。

图6是干旱处理的三个阶段生长的转基因水稻植株图片。

图7显示了干旱诱导本发明的启动子在花中表达的情况。

图8是RT-PCR的检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英俊生物技术公司合成，测序由上海博亚生物技术有限公司完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶及平端化所用的T4 DNA聚合酶均购自于自宝生物工程有限公司，连接试剂盒来自Invitrogen公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pCAMBIA1303来自于CAMBIA。实验中鉴定载体所用的酶与酶切正确的片段大小见表1和图3。

1.芯片杂交微列阵数据选择启动子

1.1植物材料及处理

用于和水稻基因表达微阵列，其制作方法和出处见《Conservation and divergence oflight-regulated genome expression patterns during seedling development in rice andArabidopsis》Plant Cell 17，3239-3256和《A microarray analysis of the rice transcriptome andits comparison to Arabidopsis》Genome Res.15，1274-1283；杂交的植物材料为籼稻品种明恢63(Oryza Sativa L.ssp.indica cv.Minghui 63，购自中国水稻所)。芽样品取自4分蘖阶段(营养期)旗叶和普通叶(除旗叶以外的其它叶片)，圆锥花序样品取自抽穗前的一个星期(生殖期)。用于取芽样品的植物生长在半浓度的霍格兰溶液中至四叶期，然后生长在土壤中直到生殖期。

干旱处理的材料和样品在以下阶段收集：期1(D1)：叶轻微卷，相对含水量(RWC)在90％-95％；期2(D2)：叶半卷，相对含水量(RWC)在80％-85％；期3(D3)：叶完全卷，相对含水量在70％-75％。D1、D2和D3代表干旱处理的三个阶段。对每个处理阶段，取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃。

1.2微阵列杂交和数据分析

按照文献《A microarray analysis of the rice transcriptome and its comparison toArabidopsis》Genome Res.15，1274-1283中描述的方法配制和使用RNAwiz试剂提取经过上述处理的样品的总RNA。每份总RNA的提取物经反转录得到的cDNA第一条链经Cy3或Cy5荧光标记后作为探针。其中，第一链cDNA的合成及其荧光标记按照文献《Conservation and divergence of light-regulated genome expression patterns during seedlingdevelopment in rice and Arabidopsis》Plant Cell 17，3239-3256中描述的方法进行。所有的cDNA探针与水稻基因表达微阵列按照文献《Conservation and divergence of light-regulatedgenome expression patterns during seedling development in rice and Arabidopsis》Plant Cell 17，3239-3256中描述的方法进微阵列杂交、洗涤和扫描。其中，用Axon GenePix4000B扫描仪对杂交微阵列玻片进行扫描，图像保存为TIFF格式的Cy3和Cy5两种，用于后续的分析。杂交实验至少记录三组重复的高质量数据，每组数据来自独立的样品。

检测干旱胁迫条件下的差异表达的基因采用Limma R包(Smyth et al.，2005)，即通过表达的数据构建线性模型而实施空假设检验。在处理过的样品和对照样品的配对比较中，中度的t-值统计方法采用经验的Bayes方法计算，收缩基因的样品变量指向一个共同的值(Smyth et.al.，2004)，通过计算不同转移点的密度比值来代表不同的表达水平。用于控制多重实验的错误率的P值。若P值小于0.05，则说明基因表达水平有显著差异，采用三倍严格的标准以避免假阳性的出现。

从基因表达微阵列上与处理前相比杂交信号增加2倍或2倍以上的cDNA探针所结合的基因表达微阵列上，在旗叶、幼苗和花序中，分别有582、1257和614个干旱正调节基因，从这些核苷酸序列中，选择出KT250基因与水稻基因组DNA进行比较分析，从该基因翻译起始位点前1.0-2Kb中选择候选启动子KT250-DP，其序列如序列表中SEQ ID No：1所示。2.水稻花特异性启动子克隆

设计克隆启动子KT250-DP所需引物：

引物1(上游序列)：5’-GAGG GGTCTC AAGCTT TCAACAAAAACCATCCACTCC-3’引物2(下游序列)：5’-CCTC GGTCTC CCATGG AGATGGATGTGGACGCACTAA-3’

引物1和2中序列GGTCTCN/为Bsa I的限制性识别位点，序列AAGCTT为Hind III的酶切位点，序列CCATGG为Nco I的酶切位点。利用引物1和引物2(其中带下划线部分的序列为启动子序列)，以植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取水稻(日本晴品种)基因组DNA作为模板，从水稻基因组中将启动子扩增出来，扩增片段1305bp。扩增体系和程序为：

2×Taq Mix 25μl

10μM 引物1 2μl

10μM 引物2 2μl

基因组DNA 10pg

ddH₂O 16μl

PCR反应条件为：

预变性：95℃，5分钟；

变性：94℃，40秒，退火：55℃，40秒，延伸：72℃，2分钟，35个循环；

72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物2μl上样，1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小与预期一致，如图1所示，其中右侧泳道为DNA分子量标记物(maker)，箭头表示出目的片段的大小。进行产物直接回收，回收产物用Bsa I酶切，酶切体系为：

10×Buffer 2μl

BsaI 1μl

DNA 10μl

ddH₂O 7μl

37℃反应3小时。

酶切反应结束后，酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，见图2，右侧泳道为DNAmaker，箭头表示出目的片段的大小，回收并纯化1305bp的目的片段。

3.构建表达载体

用Hind III和Nco I酶切载体pCAMBIA1303，1％琼脂糖凝胶电泳检测(见图3，其中右侧为DNA maker，箭头表示相应条带的片段大小)，回收11599bp的载体片段，然后将载体片段与上述步骤2得到的启动子片段连接(用Bsa I酶切后就产生了HindIII和NcoI的限制性末端)，转化大肠杆菌，涂至50mg/L的卡那霉素LB平板上，然后选取阳性克隆进行PCR检测，检测正确的进行测序，并提取相应阳性克隆质粒，命名为pCAMBIA1303-DP。

PCR检测所需引物：

引物3：5’-ATCCAGACTGAATGCCCACA-3’

引物4：5’-GCACCCCAGGCTTTACACTT-3’

引物3和引物4为pCAMBIA1303载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段为1500bp，以阳性克隆菌液为模板，扩增检测，PCR检测体系和程序为：

2×Taq Mix 10μl；

10μM 引物3 0.3μl

10μM 引物4 0.3μl

菌液 3μl

ddH2O 6.4μl

PCR反应条件为：

预变性：95℃，5分钟；

变性：94℃，40秒，退火：55℃，40秒，延伸：72℃，2分钟，31个循环；

72℃，10分钟。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测如图4所示，其中右侧为DNAmaker，箭头表示相应条带的片段大小。

所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图5所示，其中：LB和RB分别为T-DNA的左臂和右臂；hpt表示潮霉素抗性基因；CaMV35S表示花椰菜花叶病毒启动子；GUS-GFP表示gus和GFP融合蛋白基因；HindIII和NcoI分别表示内切酶HindIII和NcoI的酶切位点；诱导型启动子即为本发明通过微列阵数据分析选择并克隆出的干旱诱导的花特异性启动子。

4.农杆菌共转化

利用电击法将质粒pCAMBIA1303-DP转入农杆菌AGL0，利用农杆菌对水稻进行共转化。

5.功能鉴定

5.1启动子检测干旱处理

T1代转基因水稻种子在50mg/L的潮霉素溶液中进行发苗筛选，阳性植株种入土壤，于开花前一周并处于4分蘖期的植株，在尽量不破坏其根系的情况下进行失水处理，分别在未处理D0、叶片半卷曲D1(相对含水量为80-85％)、完全卷曲D2(相对含水量为70-75％)3个处理时间阶段进行三种不同组织的GUS染色及取材的同步实验。

图6显示了在干旱处理的三个阶段生长的转基因水稻植株，其中：A为D1(RWC90-95％)阶段的植株；B为D2(RWC 80-85％)阶段的植株；C为D3(RWC 70-75％)阶段的植株；D为从干旱处理的三个阶段分别采取的单片叶子的放大图片，从左向右，依次是D1，D2，和D3阶段植株的叶子。

通过X—gluc显色检测GUS活性，证实了本发明的启动子在干旱诱导下在水稻花组织中驱动GUS报告基因的表达，如图7所示，干旱处理的三个阶段D1、D2和D3本发明的启动子在花中表达。

5.2RT-PCR检测

RT-PCR检测引物：

引物5：5’-CAACATCGTTCTCAGTGGTGG-3’

引物6：5’-CAGACTCGTCGTACTCAGCCT-3’

引物7：5’-ATTGCTCAAAGTTCAAGGGC-3’

引物8：5’-GACGAGAGAGATACACAACAGGT-3’

引物5和引物6为Actin基因引物，扩增片段248bp；引物7和引物8是根据序列表中SEQ ID No：2序列设计的KT250基因引物，扩增片段484bp，分别以经过步骤5.1处理后的水稻普通叶、剑叶、花cDNA为模板，阴性对照模板为双蒸水和野生型水稻，检测其在这3种组织器官中的表达，PCR检测体系和程序为：

10×Mg²⁺缓冲液 2μl

10mM dNTP 0.3μl

10μM引物5 0.1μl

10μM引物6 0.1μl

10μM引物7 0.1μl

10μM引物8 0.1μl

cDNA 0.8μl

ddH₂O 16.5μl

PCR反应条件为：

预变性：95℃，5分钟；

变性：94℃，40秒，，退火：56℃，40秒，延伸：72℃，2分钟，28个循环；

72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图8，其中：L表示水稻普通叶；F表示水稻剑叶；P表示水稻花；字母后的数字0、1和2分别指干旱处理前、相对含水量为80-85％和相对含水量为70-75％的干旱处理阶段；KT250指该基因的扩增产物；ACTIN指水稻actin基因的扩增产物。可见，KT250在花中表达，并有一定的干旱诱导性。

以上实验证明，本发明所提供的启动子KT250-DP在干旱诱导的条件下在水稻花组织中特异表达。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司

<120>一种干旱诱导的水稻花特异性启动子及其应用

<130>JSP080363

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1305

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>1

<210>2

<211>2117

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>2

Claims

1.一种干旱诱导的水稻花特异性启动子，是如下a)或b)的核苷酸序列：

a)序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述高严谨条件为在0.1×SSPE和0.1％ SDS的溶液中，或者0.1×SSC和0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

3.含有权利要求1所述的启动子的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

4.权利要求1所述的启动子在培育不育系和保持系双系水稻中的应用。