CN101265472A - 一种植物叶片维管束特异性表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种植物叶片维管束特异性表达的启动子，含有该启动子的植物表达载体和转化子，本发明还涉及上述启动子在植物转基因工程中的应用。一种植物叶片维管束特异性启动子，其核苷酸序列如SEQ ID №：1所示。发明人将含有该启动子DNA序列和GUS基因的植物表达载体经农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因植株，经染色鉴定，GUS基因仅仅在水稻叶片微管束中特异表达，因此推测本发明提供的启动子能够驱动外源抗逆基因在植物叶片微管束中特异表达，可应用于定向培育安全性高的转基因植物新品种。

Description

一种植物叶片维管束特异性表达的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种植物维管束特异性表达的启动子，含有该启动子的植物表达载体，以及该启动子的转化子，本发明还涉及上述启动子在植物转基因工程中的应用。

背景技术

启动子是位于结构基因5’端上游区域，能被RNA聚合酶识别并与之结合，从而起始转录基因的一段DNA序列。启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间、以及表达量等，是生物转基因工程中至关重要的因素，也是关系到生物转基因安全的一个重要因素，最早广泛使用的生物转基因启动子是一些组成型启动子，如来源于CaMV的35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因启动子Nos，章鱼碱合成酶基因启动子Ocs，组成型启动子的特点是在所有的组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性，难以达到定向改造植物性状的目的，往往产生一些不需要的结果，甚至负面的效果，另外组成型启动子在时空上的持续表达，也造成植物生长资源的浪费。在生物转基因安全方面，这些组成型启动子的高表达量、强启动效应、对生物种类和组织的不加选择，以及其来源如病毒的不安全性，使采用该类启动子的转基因生物容易成为基因漂移、外源基因泛滥表达的源头，使人们非常担心转基因植物的安全性问题，因此，在基因工程中，定向、安全地改良植物某些形状的先决条件是提供基因时空特异性表达的启动子，构建高效表达的表达载体，使靶标基因精确地在目的组织内按需表达。

维管束是植物重要的功能组织，是输送养分、水分、决定抗逆能力的重要组织，如果能获得调控基因在维管束中特异表达的启动子，使各种外源抗病基因、抗倒伏基因都只在维管束中表达，而不在种子中表达，使植株获得抗性的同时，生产出来的粮食也没有安全隐患，因此分离克隆到这样的启动子，对于植物转基因工程获得抗性品种具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在植物叶片维管束组织特异性表达的启动子，以及获得含有该启动子序列的转化子。

一种植物叶片维管束特异性启动子Op，其核苷酸序列如SEQ ID №：1所示。

一种植物表达载体，其特征是含有上述植物叶片维管束特异性启动子Op。

所述植物表达载体是pCAM-Op。

一种转化子，其特征是含有上述植物叶片维管束启动子Op或植物表达载体pCAM-Op及宿主。

所述转化子为细胞系，愈伤组织或转基因植株。

所述宿主为根癌农杆菌。

所述植物叶片维管束特异性启动子Op在培育转基因植物中的应用。

所述转基因植物为水稻。

所述应用是将植物叶片维管束特异性启动子Op插入靶标基因前转化植物，使靶标基因在植物叶片维管束中特异性表达。

所述的应用是指抗病育种与抗逆性育种。

本发明提供的启动子位于表达载体中的靶标基因前，其结构包括翻译起始密码子在内的bp的DNA序列(SEQ ID NO1，+1位置处为转录起始位点；leader intron序列以下划线标注)，该DNA片段含有大量的顺式调控元件、并在位于翻译密码子前具有一段leader intron序列，将本启动子连接到表达载体中的靶标基因前，可驱动靶标基因在叶片维管束组织中的特异表达，可以提高外源基因在植物叶片维管束中表达量，增加转基因的效果，减轻外源基因由于过量表达而对作物农艺性状的影响。

在植物双元表达载体pCAMBIA1301中，将GUS报告基因前的启动子缺失，并将本发明的水稻OsBTF3基因启动子Op连接到GUS报告基因前，利用农杆菌介导的遗传转化方法进行水稻的转化。对转基因水稻植株进行组织化学染色后，发现转基因植株整体上的GUS基因表达水平相对较低，在叶片中仅在叶脉处显蓝色，证明该启动子具有驱动基因表达的启动活性，且该启动子驱动的GUS基因在水稻叶片维管束中特异表达。

本发明启动子在植物基因工程中的应用潜力很大，尤其在开发抗叶片维管束病害的转基因作物中优势更加明显，可以通过驱动抗病基因在维管束中的特异表达，而提高植物对叶片维管束病害的抗性；同时维管束是无机盐和有机物质等营养物质的输导系统，并具有支持植物体的作用，因此，该启动子在转基因作物开发中，可应用于提高作物抗逆性品种培育研究，由于其微管束组织特异性表达的特性，用其代替35S等组成型启动子，可培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

图1A：pCAMBIA1301示意图；

图1B：利用启动子Op构建驱动GUS表达的载体pCAM-Op示意图。

图2：利用

启动子驱动GUS基因表达情况的分析

A.无启动子表达载体转基因水稻植株叶片；

B.CaMV35S::gus转基因水稻植株叶片；

C.

::gus转基因植株叶片；

D.无启动子表达载体转基因水稻植株叶片维管束组织；

E.CaMV35S::gus转基因水稻植株叶片维管束组织

F.::gus转基因植株叶片维管束组织

具体实施方式

现结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：含有酶切位点的启动子Op的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsBTF3基因的起始密码子上游1380bp序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点，在本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1301(来自于CAMBIA，公开使用载体，中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室分子植病组有保存，公众可以从该实验室得到)为例，靶标基因为GUS基因，具体设计的引物为：正向引物Op1 5’端带BglII酶切位点，反向引物Op2的5’端带EcoR I酶切位点，引物序列如下：

正向引物Op1(5′-CAGATCTACCATCTGCATGAA AACATATGGTACTTTGC-3′)

                  Bgl II

反向引物Op2(5′-CGAATTCGTTGTGATTGGATCTGTGTACCTG-3′)

                  EcoR I

由上海生工生物技术公司合成。

步骤2.启动子Op的获得

以水稻品种日本晴总DNA为模板，利用Op1、Op2扩增启动子Op。试剂采用高保真酶，按常规PCR体系，扩增程序采用如下：95℃预变性15min；95℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸1min30s，36个循环；最后72℃延伸5min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1380bp，连接到pMD18-T(购于TaKaRa公司，中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室分子植病组有保存，公众可以从该实验室得到)载体中，按照热激法转化大肠杆菌DH5α(购于TaKaRa公司)感受态细胞后，经筛选获得转化子pMD18-T-Op，挑取单克隆用Bgl II和EcoR I进行测序验证。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Op(图1)。

实验例2：利用Op启动子驱动GUS报告基因在水稻中表达

步骤1植物表达载体的构建和农杆菌的转化

将实施例1所得pMD18-T-Op用Bgl II和EcoR I酶切，回收后与pCAMBIA1301的Bgl II和EcoR I酶切载体部分，用T4 ligase(购于Takara生物公司)进行连接，得到启动子Op与gus基因融合的植物表达载体pCAM-Op(图2)，利用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室分子植病组有保存，公众可以从该实验室得到)，提取阳性质粒，用BglII、EcoR I进行酶切验证，正确的克隆待用。

对照：转CaMV35S::gus作为对照，利用冻融法将表达载体pCAMBIA1301转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，操作步骤、及验证同pCAM-Op的转化方法。

步骤2、水稻的遗传转化

水稻干种子去壳后，用70％酒精消毒3min，无菌水洗3-4次，再用2％次氯酸钠溶液消毒30min，在诱导培养基(N6max10×100ml，N6min100×10ml，Fe²⁺EDTA 100×10ML、维生素100×10ML，2、4-D 2.5ML，脯氨酸0.3g，CH0.6g，蔗糖30g，Phytagel3g，加蒸馏水至900ML，加少量氢氧化纳调节pH至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装并灭菌待用)上26℃暗培养7天左右，将愈伤用镊子小心取下放到诱导培养基上26℃暗培养4天左右备用。农杆菌介导的遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Hiei Y(Hiei Y，Ohta S and Toshihiro K，et al.Efficient transformation ofrice(Oryzae sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis ofboundaries of the T-DNA[J].The Plant Journal，1994.627 1-6282.)等的方法。

通过农杆菌介导的遗传转化、转化子筛选和转基因植株再生等过程，获得39株Op::gus转基因水稻和12株CaMV35S::gus转基因水稻植株。

步骤3.GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA et al.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive andversatile genefusion marker in higher plant.EMBO J.，1987，6：3901-3907)等的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃下染色8小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

通过GUS组织化学染色，检测了启动子Op在水稻转基因植株中对GUS的启动活性。结果显示，在Op::gus转基因植株叶片中，叶脉部位检测到GUS基因的活性，说明该启动子具有驱动GUS基因表达的活性，且能够驱动GUS基因在叶片微管束处特异表达(图2C)。对CaMV35S组成型启动子与本实验特异性启动子Op进行比较，发现不同启动子驱动的GUS基因在转基因植株的表达有所不同，其中CaMV35S::gus转基因植株的整个叶片中GUS均有高水平表达(图2B)，与之相比Op::gus转基因植株中，Op驱动的GUS基因在整个植株中表达水平相对较低，仅在叶脉组织中表达高水平表达(图2C)，进一步在显微镜下观察发现，在叶片中仅在微管束组织表达(图2F)，与CaMV 35S启动子驱动的GUS基因的表达水平(图2E)具有显著差异。结果表明，特异性启动子Op能够驱动GUS基因在水稻叶片维管束组织中特异性高水平地表达。

SEQ ID No1：

-720 GAATTCGTTG TGATTGGATC TGTGTACCTG TTTTGAGTTT TACAGAGAAA TCTTATGTTT  -661

     AGCATGGCTA AAGTTCAGCC GTGTTTCTTT CTCTCCTCTC TAGCAAGGAC ATTTCTAATT  -601

     GGTTCATCAC TTGTGTTCTA GGATGTGAAA ATTCTAATTG AAGCAATACT TGAATGATGC  -541

     TCACCTGCAT GTGTTGTAGG TTGTGAAAAA TTTCTAATTG AATCATTGCT TCATGTTGGC  -481

     AATTCATTGC ATAATCGTGG TCATTCATTG ATTGCATAAC GATGTACTCC CTCCGTTCCT  -421

     CCGTTCTATA ATATAAAGGA TTTTACTTGC ACTATTTGAC TACTCGTCTT ATTTAAAAAT  -361

     TTTAGAATAA TTATTTATTT TTTAACTTAC TTTATTATCC AAAGTACTTT AAGCACAACT  -301

     TTTCATTTTT TATATTTGCA CAAATTTTTT AAACAAGACG AGTGGTCAAA CAGTACGAGC  -241

     AGAACCCGAA CCCGGTATCG CGGGCGCGTG CATCCGGTGG CGGCCGTGCG CCCACAAGAA  -181

     AAAAACTCAA AATCTCTTAT ATTATGGGAT GGAGAGAGGA AGTATTTTTT CCTCTGAATT  -121

     TATCATTTTT TCCAAAGCAT TCATTCAGTT ACACAAGCGG GTGTGAAAGA GGTGAGCCCG   -61

     TCGGACGGCC AGGATCGATC CCGCGGTTGT TAAAACCCTA ACACCGAGTA AAGAAAAGC

  +1

     AGTCGCAGTG GTTGGCCTCG CGAGCCCTAT CTCCTCCTTC CTAATCCCCT TTCCCCTCCC    61

     CCTCTCCATT CCCCTCGCCG CCGCCGCCGC CACCGCCGCC GCCGCGGCGC GCCGCCCTCC   121

     TCCTCCTCCC ATCCAAGGTG AGACGGCGAC ATCTCCGGCG TCTCCTTCTC CCCTGCAGCA   181

     CTTACTTGTG ATAGATAGTA GGCGCTATGC TTTTACTCGC ACTGCATCAG TACTGGTTCC   241

     CGCTTGCAGC AGCTTTTGTT TGGATTGAGG GTTTTTATCC CCTCTTTTTT ATTATCAATT   301

     GATTACGTAG TGGTTCAATA GATAGTGGGC AGGGATAGTG TTTGTGATTT CCCCCTTTTT   361

     TTTTCTGAAC TTTCTGATTG CACGATTGGG GTTTTAGCAC GCGCGGTTAG GTTCCATGGC   421

     TAGATTTGCT CCGTATGAAA GCAGCGAGGG TGTTTGCGAG GTTTGATTCA AGTGTTCTAT   481

     TACTGGGTCG TGTTGTTTAG ATGGATTGAG GGTGTTAGTT TAGGAGAAGT TGTCCTCTAG   541

     ATTTGCGAAA TCGTAGTAGA GCTGCTCCTC TGATGCTGTT TGACTTGAGT GTCTAAGAGT   601

     AATCTGACCT TTCCTTTTTC CGTTATGGCT TTACTAAAGC AAAGTACATA TGTTTTCATG   660

SEQ ID No2：

5′-CAGATCTACCATCTGCATGAAAACATATGGTACTTTGC-3′

SEQ ID No3：

5′-CGAATTCGTTGTGATTGGATCTGTGTACCTG-3′

Claims (10)

1.一种植物维管束特异性启动子Op，其核苷酸序列如SEQ ID №：1所示。

2.一种植物表达载体，其特征是含有权利要求1所述的植物叶片维管束特异性启动子Op。

3.根据权利要求2所述的植物表达载体，所述植物表达载体是pCAM-Op。

4.一种转化子，其特征是包含权利要求1所述的植物叶片维管束特异性启动子Op或者权利要求3所述的的植物表达载体pCAM-Op及宿主。

5、根据权利要求4所述的转化子，所述转化子为细胞系，愈伤组织或转基因植株。

6.根据权利要求4所述的转化子，所述宿主为根癌农杆菌。

7.权利要求1所述植物叶片维管束特异性启动子在培育转基因植物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述转基因植物为水稻。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征是将植物叶片维管束特异性启动子Op插入靶标基因前转化植物，使靶标基因在植物叶片维管束中特异性表达。

10.根据权利要求7所述的应用，是指抗病育种或逆性育种。

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