CN105671049B - 一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3及其应用 - Google Patents

一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、重组表达载体以及利用其获得相应宿主菌和转化子的方法。经染色实验验证，本发明的水稻花药特异表达启动子OsAnth3能够驱动目标基因在水稻花药中强表达，而其他部位几乎没有任何表达，证明本发明的启动子具有很强的组织特异性。将其应用于转基因品种的培育，能够以最小代谢负担而改变花药部分的生长特性，具有显著的潜在社会和经济价值。本发明将其应用于植物基因工程中，驱动目标基因在作物花药中特异表达，利用本发明的启动子与具有抑制或干扰花药生长功能的基因配合使用，干扰作物花药的生长发育，用于杂交育种研究；阻断基因飘移，防控转基因作物可能引起的生态风险。

Description

一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3及其应用，该启动子能够在水稻转基因工程中驱动目标基因在水稻花药中特异表达。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是良好的单子叶植物模式生物。在当今人口数量日益增长，而耕地面积不断减少的情况下，提高粮食单产，已成为确保我国粮食安全的重要途径之一。提高水稻产量在保障我国粮食安全中始终担当着重要角色。杂种优势的利用是提高水稻产量和改良作物品种的重要途径。然而，杂交水稻的常规育种方式，种质资源有限，转育周期长，受环境温度和光周期等条件的影响，使得杂种优势的潜力得不到更大的发挥。近年来，利用分子育种手段开展杂交育种，广泛的研究应用转基因水稻，解决了常规育种方法资源利用率低、育种周期长等瓶颈问题，提高杂交制种纯度，降低杂交制种成本。但是，转基因作物的基因漂移及其可能引起的环境后果，是转基因生态安全的潜在风险。
利用植物基因工程创建雄性不育则既为杂交制种提供可利用种质资源，又可阻断基因漂移，有效规避转基因生物生态安全等问题，具有广阔的应用前景。杂交制种创建雄性不育，造成植物花器官败育是必然途径，需要花粉或花药特异表达启动子引导。
因此在水稻这种单子叶模式生物中发掘和研究花药特异启动子具有重要的理论和实际价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动目标基因在水稻花药特异性表达的启动子，获得含有该启动子序列的宿主菌、转化子的方法以及该启动子的应用。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻花药特异表达启动子，所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3包含下列序列之一或者下列序列的互补序列之一：
与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有90％以上的同源性并且具有启动子功能的DNA序列；
在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的具有启动子功能的突变体或等位基因或衍生物；
与具有SEQ ID No:1所示DNA序列的植物杂交所得产物的DNA序列，该DNA序列具有启动子功能。
优选地，所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3由序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列或其互补序列构成。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为OsAnth3或启动子OsAnth3。
具体而言，本申请的发明人发现并且分离克隆了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中的1812bp的DNA序列，并鉴定了该DNA序列的功能，具有驱动目标基因在水稻花药中特异性表达的功能。
另一方面，本发明还提供一组扩增权利要求1或2所述的水稻花药特异表达启动子的全部或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
另一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻花药特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花药特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游。优选地，所述待表达的基因为Gus基因。该重组表达载体为将SEQ IDNo:1所示的序列即OsAnth3或启动子OsAnth3构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsAnth3。或者待表达基因可以为任何对水稻花药具有改善功能的基因。
另一方面，本发明还提供一种获得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将所述的启动子、所述的表达盒或者所述的重组表达载体，利用冻融法转入根癌农杆菌。
另一方面，本发明提供一种获得转化子的方法，其特征在于，所述方法包括将所获得的宿主菌通过农杆菌介导方法对目标细胞、愈伤组织或植株进行转化，获得相应转化子。
再一方面，本发明提供上述水稻花药特异表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花药特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
所述应用具体包括：
利用序列表SEQ ID No.2和3中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth3，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增的目的片段，将其连接到特定载体，按照冷激法转化大肠杆菌感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的水稻花药特异表达启动子OsAnth3；
从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切，回收所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth3；
将所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3和另一个特定载体连接，得到所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3与该载体上的待表达基因融合的植物表达载体，利用冻融法将该植物表达载体转入根癌农杆菌；
利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了植物表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。
并且所述应用可以用于改良植物生长特性。所述植物为禾本科植物，例如水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦、玉米等。优选为水稻。
本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：
Figure BDA0000943979000000031
Figure BDA0000943979000000041
需要说明的是，本发明所提供的启动子序列中，序列开头的“acctatcaacaaaacaactc aa”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾的序列“cagacgacac atagaaggtt tt”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为来自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中的一段具有转录调控活性的1812bp的DNA序列，并将其命名为启动子OsAnth3。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行GUS组织化学染色检测发现，GUS仅着色与花粉和花药壁中，并不着色与根、茎、叶、颖壳和花丝等其他位置，从而证明该1812bp的序列具有驱动基因在花药部位特异性表达的活性。
本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的花药部位特异性的驱动靶标基因的表达，有效改良水稻的育性。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子OsAnth3能够调控基因在作物花药中特异性集中表达，利用本发明的启动子与具有抑制或干扰花药生长功能的基因配合使用，可以干扰作物雄性生殖器官的生长发育，得到花粉败育作物，用于杂交育种研究；阻断基因漂移，降低转基因作物的生态风险。经染色实验验证，将其应用于转基因品种的培育，能够以最小代谢负担而改变花药部分的生长特性，具有显著的潜在社会和经济价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将OsAnth3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-OsAnth3示意图，其中示出了利用OsAnth3启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
图3为10周龄OsAnth3-GUS转基因植物各组织GUS染色图。(A)根；(B)茎；(C)成熟叶片；(D)小花；(E)雄蕊；(F)花药。标尺为1mm。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
含有酶切位点的OsAnth3启动子的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsAnth3基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：
正向引物：AAGCTTACCTATCAACAAAACAACTCAA HindIII
反向引物：GGATCCAAAACCTTCTATGTGTCGTCTG BamHI
由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子OsAnth3的获得
以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsAnth3，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1812bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送至Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsAnth3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
植物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面“启动子OsAnth3的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和BamHI酶切，回收启动子OsAnth3片段。同时利用HindIII和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsAnth3片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsAnth3与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-OsAnth3，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
利用启动子OsAnth3驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗3-6遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养10-12天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。
采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsAnth3::gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，etal.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phosphomannose isomerase positive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
步骤2、GUS组织化学染色
参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，直至将组织中的叶绿素脱掉。结果如图3所示，各组织与GUS染液中染色24h后，仅有花药上有代表GUS活性的蓝色出现，组织放大后表明GUS仅着色与花粉和花药壁中，并不着色与根、茎、叶、颖壳和花丝等其他位置。这表明，本发明的启动子OsAnth3启动子具有花药特异表达活性。
虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Figure IDA0000943979100000011
Figure IDA0000943979100000021

Claims (2)

1.一种水稻花药特异表达启动子OsAnth3在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，
所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3由序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列构成，其中，
序列表中SEQ ID No:1所述序列包括：
Figure FDA0001921903970000011
Figure FDA0001921903970000021
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
利用序列表SEQ ID No.2和3中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth3，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增的目的片段，将其连接到特定载体，按照冷激法转化大肠杆菌感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的水稻花药特异表达启动子OsAnth3；
从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切，回收所述的水稻花药特异表达启动子OsAnth3；
将所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3和另一个特定载体连接，得到所述水稻花药特异表达启动子OsAnth3与该载体上的待表达基因融合的植物表达载体，利用冻融法将所述植物表达载体转入根癌农杆菌；
利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用所获得的转入了植物表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。
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