CN107435044B - 水稻雄蕊特异表达的启动子及其应用 - Google Patents

水稻雄蕊特异表达的启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻雄蕊特异表达的启动子及其应用。本发明提供了两种SSP1启动子：SSP1‑1启动子和SSP1‑2启动子。其中，SSP1‑1启动子为pWDH1‑1，其核苷酸序列为序列2；SSP1‑2启动子不仅包括pWDH1‑1，还包括多克隆位点区和pWDH1‑2，pWDH1‑2的核苷酸序列为序列4。通过实验证明：本发明的SSP1‑1启动子和SSP1‑2启动子均可以有效启动外源基因的表达，对于培育转基因植物具有重大的应用价值。

Description

水稻雄蕊特异表达的启动子及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻雄蕊特异表达的启动子及其应用。
背景技术
对于中国这样的人口大国而言，粮食安全是社会稳定和可持续发展不可或缺的保障。随着中国经济的高速发展，城镇化过程不可避免地不断蚕食耕地面积。土地是农业之本，在土地面积不断减少、人口不断增加、人们对粮食的需求水平不断提高的压力下，保障粮食安全的唯一出路，只能是通过对植物生命活动的持续深入的研究，进行更加有效的作物改良，提高单位面积产量。经验表明，利用杂种优势进行育种是一个行之有效的作物改良方法，不仅能有效地利用杂种优势提高产量，还能通过各种不同的组合筛选，实现综合性状(包括品质和抗性)的快速组合，是大规模种业生产上行之有效的策略。
在生产上大规模利用杂种优势的前提是雄性不育系。在传统的杂种优势利用中，人们利用自然变异筛选所获得的雄性不育系曾经成功地实现了大规模提高水稻产量的目标。可是，当杂种优势利用面对综合性状组合和种业的产业化运作时，缺乏具有自主知识产权的多元化雄性不育系就成为杂种优势利用的一个现实的、无法回避的严重技术制约。近年，通过对水稻的大规模突变体研究，人们发现了一批新的、可以造成雄性不育的基因，为创制多元化雄性不育系提供了新的选择。目前所报道的影响雄蕊发育的基因大多在减数分裂之后发挥作用，从植物器官形成和营养物质分配的角度而言，在雄蕊发育早期调控入手创制雄性不育系，将不仅能实现更加稳定的不育效果(彻底抑制雄蕊的形成)，而且还可以减少雄蕊早期发育过程(包括减数分裂)的消耗，让同样的光合产物进行更有效的利用。
在1990年代初，植物花器官特征决定基因(ABC基因)的发现，证明器官特征决定可以由少数基因控制。本发明的发明人在前期工作中也曾成功地利用ABC基因中的B类基因AP3的启动子特异性地改变雄蕊中乙烯信号组分的表达，实现抑制雄蕊早期发育、在拟南芥中实现雌花单性花的目的。迄今为止，尚未见在水稻雄蕊发育早期特异性表达的启动子的报道。显然，要有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权，当务之急就是要找到一批有效的、拥有自主知识产权的水稻雄蕊早期发育过程基因特异表达的调控元件，如启动子。
基因表达的器官/组织/细胞特异启动子或调控元件(因为很多特异性调控元件并不在编码区上游，而在内含子中)的研究是分子生物学发展到1980年代时的一个研究热点。在植物中，欧洲科学家曾热衷于研究在根的各种组织中特异性表达启动子。随着对基因表达调控机制了解的不断深入和基因序列解析手段的发展，目前有关基因表达调控元件的分析也有了更加有效的方法。但由于分子生物学的发展的热点在启动子之后迅速转移到转录因子、染色质修饰、小RNA、大规模测序等新的热点，而植物分子生物学的研究在1990年代之后也将重点转移到突变体的筛选和相关基因分离上，有关器官/组织/细胞特异启动子或调控元件的研究在近年并没有成为大家关注的焦点。虽然这种局面的形成有其合理性，因为没有有功能的基因，也无从了解其表达的调控元件。随着模式植物和重要作物基因组测序的完成，特别是人类ENCODE计划的完成，基因表达的时空特异性精细调控必将成为人们关注的下一个焦点。而且从应用的角度出发，要利用生物技术改变基因表达，实现特定的产业化需求，必然要通过调控元件来控制基因表达的时空特异性。因此器官/组织/细胞特异性基因表达的调控元件的分离克隆和应用，必然成为分子生物学和生物技术研究的下一个无法回避的技术挑战。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
本发明提供的DNA片段为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：
1)DNA片段甲；
2)自5’至3’端依次包括DNA片段甲和DNA片段乙；
3)在严格条件下与1)或2)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；
4)与1)或2)中所述DNA分子具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；
所述DNA片段甲的核苷酸序列为序列表的序列2；
所述DNA片段乙的核苷酸序列为序列表的序列4。
上述DNA片段中，
2)中，所述DNA片段自5’至3’端依次由DNA片段甲、多克隆位点区和DNA片段乙组成；
所述多克隆位点区具体由BamHI、KpnI、SalI、SmaI和XbaI酶切识别位点组成。
上述DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列为序列表的序列6，其中，DNA片段甲的核苷酸序列为序列6的第7-1085位，多克隆位点区的核苷酸序列为序列6的1086-1112位，DNA片段乙的核苷酸序列为序列6的1113-2872位。
本发明的另一个目的提供与上述DNA片段相关的生物材料。
本发明提供的与上述DNA片段相关的生物材料为下述A1)至A11)中的任一种：
A1)含有上述DNA片段的表达盒；
A2)含有上述DNA片段的重组载体；
A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A4)含有上述DNA片段的重组微生物；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有上述DNA片段的转基因植物细胞系；
A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
本发明还有一个目的是提供上述DNA片段或上述生物材料的新用途。
本发明提供了上述DNA片段或上述生物材料在启动外源基因在植物组织或植物器官中表达中的应用。
上述应用中，所述植物器官为植物生殖器官。
上述应用中，所述植物生殖器官为雄蕊。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
本发明还提供了上述DNA片段或上述生物材料在植物的遗传育种中的应用。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为水稻。
本发明提供了两种SSP1启动子：SSP1-1启动子和SSP1-2启动子。其中，SSP1-1启动子为pWDH1-1(SSP1基因起始密码子atg上游的序列)；SSP1-2启动子不仅包括pWDH1-1，还包括多克隆位点区和pWDH1-2(SSP1基因组序列除了第一个外显子外的全部基因组序列，基因内部的一些序列也是启动基因表达的必须组分)。通过实验证明：SSP1-1启动子和SSP1-2启动子均可以有效启动外源基因的表达，对于培育转基因植物具有重大的应用价值。
附图说明
图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为PCR鉴定pWDH1-1载体。
图3为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为PCR鉴定转SSP1-1植株。
图5为转SSP1-1植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片。
图6为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图7为PCR鉴定pWDH1-2：GUS载体。
图8为PCR鉴定转SSP1-2植株。
图9为转SSP1-2植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片。
图10为pWDH1-1：GUS载体示意图。
图11为pWDH1-2：GUS载体示意图。
图12为pCAMBIA1305.1载体示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pCambia2300载体是CAMBIA公司的产品。
下述实施例中的农杆菌GV3101是北京天为时代科技有限公司的产品。
下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)：溶剂为200mM PBS缓冲液，溶质及其在染色液中的浓度分别为：100mM亚铁氰化钾、100mM铁氰化钾、0.5mM EDTA(pH8.0)、10mg/ml X-Gluc、0.1％(体积比)吐温20。
下述实施例中的水稻品种中花11号：购自于中国农业科学院作物研究所；由中国农科院作物所1979年用京风五号/特特普/福锦进行花培。记载于文献“倪丕冲.水稻花培新品种—中花11号.作物品种资源，1989年04期”中。
下述实施例中的农杆菌EHA105是北京全式金生物工程有限公司的产品。
实施例1、SSP1-1启动子的获得及其功能验证
一、SSP1-1启动子的获得
1、以水稻品种中花11号的基因组DNA为模板，采用pWDH1-1-SacI-F和pWDH1-1-KpnI-R引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
pWDH1-1-SacI-F:AAAGAGCTCAGCCACTCTGGTGCCCCAAA；
pWDH1-1-KpnI-R:ATAGGTACCGCCACCGACGTACGGACGAA。
2、对步骤1获得的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化PCR扩增产物。并对其进行测序。
PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp；泳道1-4为PCR扩增产物，约为1.1kb)。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为1079bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的核苷酸序列命名为pWDH1-1，即为SSP1-1启动子。
二、SSP1-1启动子的功能验证
1、转SSP1-1水稻的获得
(1)重组质粒pWDH1-2:GUS的构建
1)用限制性内切酶SacI和KpnI双酶切步骤一的PCR扩增产物，回收酶切产物。
2)用限制性内切酶SacI和KpnI双酶切pCAMBIA2300载体，回收大小约为8.74kb的载体骨架。
3)将步骤1)的酶切产物和步骤2)的载体骨架连接，得到驱动GUS报告基因的pWDH1-1载体。
pWDH1-1载体为在pCAMBIA2300载体的SacI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体。
用下述引物鉴定pWDH1-1载体是否连入目的DNA片段。经测序鉴定得到的1#,4#,12#为正确连接的pWDH1-1载体。部分PCR鉴定电泳图见图2。引物序列如下：
pWDH1-1-SacI-F:AAAGAGCTCAGCCACTCTGGTGCCCCAAA；
pWDH1-1-KpnI-R:ATAGGTACCGCCACCGACGTACGGACGAA。
4)以pCambia1305.1载体(购买自pCAMBIA公司)为模板，采用gus-s和gus-a组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
gus-s：5’-CCGGGTACC ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3’；
gus-a：5’-accgGGTACC TCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3’。
PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图3(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp；泳道1-5为PCR扩增产物，约为1.8kb)。
5)用限制性内切酶KpnI酶切步骤4)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
6)用限制性内切酶KpnI酶切步骤3)的pWDH1-1载体，回收大小约为9.81kb的载体骨架。
7)将步骤5)的酶切产物和步骤6)的载体骨架连接，得到重组质粒pWDH1-1:GUS并对其进行测序。
根据测序结果，对重组质粒pWDH1-1:GUS进行结构描述如下：在pWDH1-1载体的KpnI酶切位点正向插入了序列表的序列1所示的GUS基因，且保持pWDH1-1载体的其他序列不变得到的载体。
重组质粒pWDH1-1:GUS也为将序列3所示的DNA分子替换了pCAMBIA2300载体的SacI和KpnI酶切位点间的DNA片段，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体(图10)。
(2)重组农杆菌的构建
将步骤(1)获得的重组质粒pWDH1-1:GUS导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pWDH1-1:GUS/EHA105。
将pCAMBIA1305.1载体导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105。对照载体为pCAMBIA1305.1(购买自pCAMBIA公司)，其结构如图12所示。其中，pCAMBIA1305.1载体为将35S启动子驱动的GUS报告基因序列插入pCAMBIA2300载体的多克隆位点中，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体。
(3)转化
用步骤(2)获得的重组农杆菌pWDH1-1:GUS/EHA105和重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105分别转化水稻，分别得到转基因水稻和对照植株。水稻转化委托未名凯拓公司进行商业化生产(具体方法为常规的水稻幼胚愈伤组织的诱导后侵染农杆菌)，6个月后拿到转化后抗性筛选过的水稻苗。
(4)转基因植株鉴定
提取经过抗性筛选后的T2代转基因水稻植株的叶片的基因组DNA，用gus-F和gus-R组成的引物对T2代转基因水稻植株的基因组DNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转SSP1-1水稻植株。部分T2代转SSP1-1水稻植株的PCR鉴定电泳图见图4。图4中：M为DL2000PLUS DNA marker；1-10为PCR鉴定为转基因植株；11-12为阴性对照(野生型)。经过鉴定表明：T2代转基因水稻植株中1#，3#，6#，10#为T2代转SSP1-1水稻植株(PCR扩增产物大小约为1.8kb的植株为T2代转SSP1-1水稻植株)。
gus-F：5’-ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3’；
gus-R：5’-TCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3’。
2、转SSP1-1水稻的GUS染色
取经过PCR鉴定为阳性的T2代转SSP1-1水稻植株、对照植株和野生型水稻植株的成熟花器官、叶片和根进行GUS染色分析。GUS染色分析的具体步骤如下：将植株的花、叶片和根在GUS染色液中37℃浸泡12小时，然后用70％乙醇水溶液脱色2-3次，然后在显微镜下观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。
T2代转SSP1-1水稻植株的花器官、叶片和根的GUS染色照片见图5，其中，1-7分别为4-10期水稻小花的GUS染色结果，8为解剖的8期雄蕊的GUS染色结果，9为叶片的GUS染色结果，10为根的染色结果。从图中可以看出，T2代转SSP1-1水稻植株的花器官的4-10期观察到蓝色，说明GUS基因只在水稻雄蕊中特异的表达，而野生型水稻植株的花器官、叶片和根均没有蓝色，对照植株的花器官、叶片和根中均观察到蓝色。说明本发明提供的启动子SSP1-1可以启动GUS基因在水稻雄蕊中特异的表达。
实施例2、SSP1-2启动子的获得及其功能验证
一、SSP1-2启动子和转SSP1-2水稻的获得
1、重组质粒pWDH1-2:GUS的构建
1)以水稻ZH11的基因组DNA为模板，采用pWDH1-2-SalI-F和pWDH1-2-HindIII-R引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(SSP1基因组序列除了第一个外显子外的全部基因组序列)。引物序列如下：
pWDH1-2-SalI-F:CAAGTCGACGTTTCTCTTCCTTTCCCCTT；
pWDH1-2-HindIII-R:CCCAAGCTTAACAGCAGCAACTTGGTCAT。
2)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图6(泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp；泳道1-7为PCR扩增产物，约为1.76kb)。
对PCR扩增产物进行测序，测序结果表明：PCR扩增得到了大小为1760bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，将序列4所示的核苷酸序列命名为pWDH1-2。
3)用限制性内切酶SalI和HindIII酶切步骤1)的PCR扩增产物，回收酶切的PCR产物。
4)用限制性内切酶SalI和HindIII酶切实施例1中的pWDH1-1载体，回收酶切的载体骨架产物。
5)将步骤3)的酶切的PCR产物和步骤4)的酶切的载体骨架产物连接，得到重组质粒pWDH1-2:GUS，并对其进行测序。
根据测序结果，重组质粒pWDH1-2:GUS为在重组质粒pWDH1-1:GUS的SalI和HindIII酶切位点正向插入了序列表的序列4所示的pWDH1-2，且保持重组质粒pWDH1-1:GUS其他序列不变得到的载体。
重组质粒pWDH1-2:GUS也为将序列5所示的DNA分子替换了pCAMBIA2300载体的SacI和HindIII酶切位点间的DNA片段，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体(图11)。序列5自5’端依次包括pWDH1-1、GUS基因和pWDH1-2。
从另一方面，重组质粒pWDH1-2:GUS也为将pCAMBIA2300载体的SacI和HindIII酶切位点间的小片段替换为序列6示的DNA分子(序列6自5’端依次包括pWDH1-1、多克隆位点区和pWDH1-2，即为SSP1-2启动子，其中，pWDH1-1的核苷酸序列为序列6的第7-1085位，多克隆位点区为序列6的1086-1112位，pWDH1-2的核苷酸序列为序列6的1113-2872位)，且将序列1所示的GUS基因插入多克隆位点区的KpnI酶切位点间，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体(图11)。
6)PCR鉴定重组质粒pWDH1-2:GUS是否连接上外源片段(PCR鉴定的引物：pWDH1-2-SalI-F:CAAGTCGACGTTTCTCTTCCTTTCCCCTT和pWDH1-2-HindIII-R:CCCAAGCTTAACAGCAGCAACTTGGTCAT)，PCR扩增产物大小为1.8kb的克隆为阳性克隆。PCR鉴定结果如图7所示，从图中可以看出，1#,2#,3#,5#,7#,8#,10#为阳性克隆。
2、重组农杆菌的构建
将步骤(1)获得的重组质粒pWDH1-2:GUS导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pWDH1-2:GUS/EHA105。
将pCAMBIA1305.1载体导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105。其中，对照载体为pCAMBIA1305.1(购买自pCAMBIA公司)，其结构如图12所示。pCAMBIA1305.1载体为将35S启动子驱动的GUS报告基因序列插入pCAMBIA2300载体的多克隆位点中，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体。
3、转化
用步骤2获得的重组农杆菌pWDH1-2:GUS/EHA105和重组农杆菌pCAMBIA1305.1/EHA105分别转化水稻，水稻转化委托未名凯拓公司进行商业化生产(具体方法为常规的水稻幼胚愈伤组织的诱导后侵染农杆菌)，6个月后拿到转化后抗性筛选过的水稻苗。
4、转基因植株鉴定
提取经过抗性筛选后的T0代转基因水稻植株的叶片的基因组DNA，用gus-F和gus-R组成的引物对基因组DNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转SSP1-2水稻植株。部分T0代转SSP1-2水稻植株的PCR鉴定电泳图见图8。图8中：M为DL2000PLUS DNA marker；1-6为PCR鉴定的转基因植株，7为阴性对照(野生型)。经过鉴定表明：T0代转基因水稻植株中1#，2#，4#，6#为T0代转SSP1-2水稻植株(PCR扩增产物大小约为1.8kb的植株为T0代转SSP1-2水稻植株)。
gus-F：5’-ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3’；
gus-R：5’-TCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3’。
二、转SSP1-2水稻的染色
取经过PCR鉴定为阳性的T0代转SSP1-1水稻植株、对照植株和野生型水稻植株的成熟花器官、叶片和根进行GUS染色分析。GUS染色分析的具体步骤如下：将植株的花、叶片和根在GUS染色液中37℃浸泡12小时，然后用70％乙醇水溶液脱色2-3次，然后在显微镜下观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。
T0代转SSP1-2水稻植株的花器官、叶片和根的GUS染色照片见图9。其中，1-8分别为2-9期水稻小花的GUS染色结果，9为解剖的8期雄蕊的GUS染色结果，10为根的GUS染色结果，11-12为叶片的染色结果。从图中可以看出，阳性的T0代转SSP1-2水稻植株的花器官的4-8期观察到蓝色，说明GUS基因只在水稻雄蕊中特异的表达，而野生型水稻植株的花器官、叶片和根均没有蓝色，对照植株的花器官、叶片和根中均观察到蓝色。说明本发明提供的启动子SSP1-2可以启动GUS基因在水稻雄蕊中特异的表达。
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Claims (7)

1.一种DNA片段，为如下1)或2)所述的DNA分子：
1)DNA片段甲；
2)自5’至3’端依次包括DNA片段甲和DNA片段乙；
所述DNA片段甲的核苷酸序列为序列表的序列2；
所述DNA片段乙的核苷酸序列为序列表的序列4。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：2)中，所述DNA片段自5’至3’端依次由DNA片段甲、多克隆位点区和DNA片段乙组成。
3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于：所述多克隆位点区由BamHI、KpnI、SalI、SmaI和XbaI酶切识别位点组成。
4.根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段的核苷酸序列为序列表的序列6。
5.与权利要求1-4中任一所述的DNA片段相关的生物材料，为下述A1)至A7)中的任一种：
A1)含有权利要求1-3中任一所述的DNA片段的表达盒；
A2)含有权利要求1-3中任一所述的DNA片段的重组载体；
A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A4)含有权利要求1-3中任一所述的DNA片段的重组微生物；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物。
6.权利要求1-4中任一所述的DNA片段或权利要求5所述的生物材料在启动外源基因在植物器官中表达中的应用；
所述植物器官为雄蕊；
所述植物为单子叶植物。
7.权利要求1-4中任一所述的DNA片段或权利要求5所述的生物材料在植物的遗传育种中的应用；所述植物为单子叶植物。
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