CN108795943B - 一种植物特异表达启动子POssalt2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物特异表达启动子POssalt2及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。本发明将POssalt2启动子应用在植物基因工程中。本发明提供的POssalt2启动子可以在盐胁迫条件下，启动下游基因在植物中高表达。因此该启动子可以用于提高和改善植物在盐胁迫下的生长状况及环境适应性，从而有效提高植物的抗逆性。

Description

一种植物特异表达启动子POssalt2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉 及一种水稻特异表达启动子，尤其是盐诱导表达启动子及其应用。

背景技术

土壤盐渍化是限制农作物生长、造成粮食减产的主要非生物胁迫因 子之一。水稻(OryzasativaL)是禾本科植物的模式物种，是一种对盐中度 敏感的作物，盐胁迫已成为中国盐碱稻区水稻稳产的主要制约因素。盐 胁迫会造成水稻发育迟缓，抑制水稻组织和器官的生长和分化。在NaCl 胁迫下，随着浓度升高，水稻叶片的生长发育受到明显抑制，叶片逐渐 变短、变小，绿色也随之变浅；植株高度与干重都受到明显的抑制。因 此，深入开展水稻的耐盐性机制研究，不仅对发挥水稻品种在盐碱区的 产量潜力有着现实意义，对探索植物耐盐性的分子机理也有着重要学术 意义。

在逆境下，植物不能像动物那样迅速逃离，只能调节自身的条件来适 应环境。为应对盐胁迫逆境，植物体发展出了复杂的信号系统和调控网 络。转录因子和基因启动子在这些调控网络中起着十分关键的作用，它 们通过相互作用，调控相关基因的表达水平，来调节植物生长发育和逆 境胁迫反应。启动子是基因上游的一段DNA序列，因此它又被称之为基 因表达的“分子开关”。

转基因技术在农作物中的发展应用是现代农业的一个发展趋势，实 现外源基因在转基因植株中的精确调控表达是必要的。为了达到这个目 的，组织特异性启动子和诱导性启动子常常用来替换组成型启动子如35S， 来驱动下游基因在合适部位、合适条件下表达，这样能大大减少外源基 因的过量表达对植株生长发育造成的伤害，且能提高转基因植物的安全 性。

为了提高植物在盐逆境下的生存能力，利用盐诱导启动子驱动相关 基因在植物体内表达，是一个合理的优化策略。但目前大多数的研究是 关于盐相关基因的功能分析，对于盐诱导启动子的研究甚少。而且目前 的研究多数停留在启动子功能分析及表达调控上，真正能在生产实践上 大规模使用的更是屈指可数。另外，很多诱导型启动子都存在有背景表 达，即在没有诱导处理时出现较高的背景表达，影响了诱导调控的准确 性。因此，有必要去挖掘一些没有背景表达，且诱导活性高的盐诱导启 动子，一方面可以应用于植物转基因工程上，提高植物的耐盐性，培育 理想的转基因植物品种；另一方面，可以充实启动子的储备，为以后的 应用提供基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在盐条件下特异性表达的启动 子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中 所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱 或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物诱导表达启动子， 其特征在于，所述植物诱导表达启动子提取自日本晴水稻。

优选地，其为水稻盐诱导表达启动子POssalt2，所述水稻盐诱导表达 启动子的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性；

或者，所述水稻盐诱导表达启动子POssalt2为在SEQ ID No:1所示的 DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体 或等位基因或衍生物；

或者，所述水稻盐诱导表达启动子POssalt2具有与SEQ ID No:1所示 的DNA序列杂交的产物。

优选地，所述启动子的序列包含SEQ ID No:2所示序列。

另一方面本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含所述 的水稻盐诱导表达启动子POssalt2。

另一方面，本发明提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表 达载体包含所述的水稻盐诱导表达启动子POssalt2，在所述重组表达载体 中，所述水稻盐诱导表达启动子POssalt2连接于载体中待表达的基因序列 的上游；

另一方面，本发明提供一种所述的水稻盐诱导表达启动子POssalt2在 培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据所述的水 稻盐诱导表达启动子POssalt2连接于载体中待表达的基因序列上游，从而 构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中 进行培育。

优选地，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物： 水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。

另一方面，本发明提供一种增强植物耐盐能力的方法，其特征在于， 所述方法包括：将权利要求1中所述的水稻盐诱导表达启动子POssalt2连 接目标基因，构成重组载体，将所述重组载体导入到目标植株中，当所述 目标植株所处环境中盐分增多时，所述水稻盐诱导表达启动子POssalt2诱 导目标基因的表达，提高植株的在盐环境下的生存能力。

另一方面，本发明提供一种所述的水稻诱导表达启动子在培育转基因 植物中的应用，所述应用包括：将权利要求3所述的水稻特异表达启动子 POsRo5连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将 所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所 述待表达基因为具有改善水稻根性状的基因。该启动子可以在水稻根中驱 动目标基因特异性表达，将其与耐盐基因结合使用，可以有效提高水稻耐盐性。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare) 中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的2072bp的DNA序列，并将 其命名为POssalt2(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到 植物双元表达载体pCAMBIA1381上，获得相应的重组质粒(即重组表达 载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导 的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。用200mM NaCl溶液模拟盐逆境，对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在盐诱 导处理前，各组织没有蓝色，而在盐诱导处理后，整体上的GUS基因表达 水平相对较高，各个组织显现蓝色，从而证明该2072bp的序列具有盐诱导 表达活性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POssalt2是一个盐诱导表达启动子。该启 动子可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。该启动子序列 可以用于驱动靶标基因如一些逆境响应基因，构建重组植物表达载体，经 转化后，在盐诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高 外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果，而在没有盐诱导条 件下，不影响植株的生长和发育，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为pCAMBIA1381-POssalt2表达载体示意图，利用POssalt2启动 子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2对本发明构建pCAMBIA1381-POssalt2表达载体进行酶切验证的 结果示意图。

图3为GUS染色分析POssalt2的活性。其中，A、B和C分别代表 200mM NaCl溶液处理前的10天转基因植株的根、茎和叶的染色结果；D、 E和F代表200mM NaCl溶液处理后的根、茎和叶的染色结果。

图4为实时荧光定量PCR分析POssalt2启动子受盐诱导后的活性变化。 10天的转基因植株在用200mM NaCl溶液处理后，分别在4h、8h、12h和 24h下POssalt2启动子驱动的GUS基因表达量。

图5是本发明实施例2中的启动子驱动Gus基因的表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下面所涉及的实验材料均为市售。

1、含有酶切位点的POssalt2启动子的获得

(1)、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare) 全基因组序列。根据序列表SEQ ID No.1的启动子序列设计扩增引物，并 根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。本实施例中以 水稻双元表达载体pCAMBIA1381(图1，来自于pCAMBIA，公开使用载 体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻 组保存)为例，靶标基因为GUS基因，具体设计的引物序列如下，斜体碱 基为酶切位点：

正向引物：GAATTCAATCTCTACTACTTAAATTCCAEcoRI

反向引物：GGATCCCCAAATCAGCTAACCCGCGCCTBamHI

(2)、启动子的克隆和表达载体构建

以水稻基因组DNA为模板，采用KOD高保真聚合酶进行PCR扩增。 扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。回收PCR产物，为其加上polyA尾 并连接T载体，获得克隆载体。将克隆载体送北京六合华大基因科技股份 有限公司进行测序分析，最终获得长度为2072bp的启动子POssalt2。

分别用相应的酶切启动子POssalt2和线性化处理pCAMBIA1381质粒。 并用T4连接酶进行连接获得相应的pCAMBIA1381-POssalt2表达载体。

(3)、表达载体转化根癌农杆菌EHA105

①取10μL表达载体质粒DNA加入从超低温冰箱取出的农杆菌感受态细胞， 混匀后冰浴30min；

②用液氮速冻1min；

③加入1mL LB培养基，28℃ 120r/min培养4h；

④4000r/min离心1min，弃上清；加150μL LB培养基重悬，将菌液涂布 与含50μg/mL Kan和10μg/mL Rif的LB固体平板；

⑤28℃培养2～3d至单菌落长出，进行菌落PCR鉴定。

⑥挑取阳性克隆，用50％甘油(1：1)保存。

2、转基因植株的获得

(1)水稻遗传转化

①愈伤组织诱导：消毒后的水稻种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜， 用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性 塑料培养皿，内含50mL诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条 件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

②预培养：从诱导培养基上挑选颗粒状的愈伤组织置于新的诱导培养基上， 于30℃黑暗条件下培养3～5d。

③侵染及共培养：将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入农杆 菌菌液(OD600＝0.2)浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将愈伤上的残 余菌液吸干。将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗下培养2～3d。

④恢复：将共培养的愈伤转移至恢复培养基上，30℃黑暗培养3～5d。

⑤筛选：从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的胚性愈 伤组织，接种于筛选培养基上，每皿30粒。30℃黑暗培养2～3周，至长 出新的抗性颗粒状愈伤。

⑥分化：每一转化事件挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域， 30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

⑦生根：每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养 室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。

(2)转基因植株鉴定

共获得33株pCAMBIA1381-POssalt2植株(POssalt2：：GUS转基因 水稻植株)。采用常规方法提取转基因植株的DNA，用PCR扩增潮霉素基 因对转化植株进行检测，获得阳性植株30株。

3、启动子活性鉴定

(1)GUS组织化学染色

参照Jefferson等的方法，对PCR检测呈阳性的植株进行200mM NaCl 溶液处理前后的GUS染色分析。将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温 箱中放置24h。然后用100％乙醇浸泡直至完全脱色，进行拍照。

染色结果如图3所示。在200mM NaCl溶液未处理的转基因植株的根 (A)、茎(B)和叶(C)组织中，没有明显的着色；而当用200mM NaCl溶液处 理后，转基因植株的根(D)、茎(E)和叶(F)组织中有很深的蓝色，这说明当用 盐处理后，盐启动子能够驱动GUS基因的表达，证明该启动子是一个盐 诱导表达启动子，且没有背景表达。

(2)定量PCR分析启动子活性

GUS染色结果定性说明，POssalt2是一个盐诱导表达启动子。为验证 POssalt2受盐的诱导活性强弱，我们提取200mM NaCl溶液诱导前后的10 天的转基因幼苗的RNA，然后反转录成cDNA，实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测200mM NaCl溶液诱导前后POssalt2驱动GUS基因的表 达变化。

采用天根公司(北京)植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，离心柱 型，DP432)。所获RNA按如下程序进行cDNA反转录：在RNase-free离 心管中加入5μL RNase-Free ddH₂O，2μL5×gDNA buffer，3μL RNA，置于 42℃孵育3min，然后置于冰上放置；在上述反应液中，依次加入5μL RNase-Free ddH₂O，2μL FQ-RT Primer Mix，2μL 10×Fast RT Buffer，1μL RTEnzyme Mix充分混匀，置于42℃孵育15min；95℃孵育3min，之后放 于冰上，即为cDNA。

RT-qPCR采用天根公司(北京)的SuperReal荧光定量预混液试剂盒 (TIANGEN，SYBR Green，FP205)。以水稻ACTIN基因作为内参基因对 所用RNA模板量进行定量。采用2^–ΔΔCT(ΔCT＝CT目标基因–CT内参基因； ΔΔCT＝ΔCT处理后–ΔCT对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因 做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：Actin-FP 5’-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’；和 Actin-RP，5’-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’用于ACTIN的扩增；Gus-FP， 5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’ 和Gus-RP，5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’用于GUS的扩增。

定量PCR结果如图4所示，以200mM NaCl溶液未处理的10天转基 因幼苗中的GUS基因表达量作为1，分别检测了200mM NaCl溶液处理4h、 8h、12h和24h的转基因植株中的GUS基因表达量变化。当处理时间由4 h延长至12h时，相比于未处理时，启动子驱动的GUS基因表达量由4.7 倍提高至33.5倍，随后，当处理时间达到24小时时，活性降低至7.8倍。 由此说明，POssalt2启动子是一个盐诱导表达启动子，诱导后的活性是诱 导前的几十倍，且诱导活性在12h时达到最高。由此说明，POssalt2是一 个没有背景表达，且诱导活性强的盐诱导表达启动子。

实施例2

根特异性表达启动子的获得及表达载体构建

(1)、启动子POsRo5的克隆

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全 基因组序列，利用primer5引物设计软件依据序列表SEQ ID No.2的序列设 计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点， 引物序列如下：

FP：GGATCCACCCCCTTAATCAAAAACAACA

RP:GTCGACTTGATGCAAAGGAGCAACGAGC

其中GGATCC碱基为限制性内切酶BamHI的识别位点及保护碱基； GTCGAC碱基为限制性内切酶SalI的识别位点及保护碱基。

以水稻基因组DNA为模板，采用KOD高保真聚合酶进行PCR扩增。 反应体系(50μL)如下。扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。

KOD反应体系(总体积50μL)KOD反应体系的PCR扩增程序

(2)、加ployA及连接T载体

回收PCR产物，为其加上polyA尾并连接T载体，获得克隆载体。

加A体系：3.175μL回收产物和1.825μL的加A混合物(5×Taq buffer 2μL，25mMMgCl2 0.5μL，100mM dATP 0.5μL，Taq polymerase 0.25μL) 置于72℃，反应30min。

连接T载体：4μL的加A产物和1μL的T载体，置于25℃反应30min， 即得到目的产物，后将产物转入大肠杆菌感受态。

(3)、转化大肠杆菌感受态细胞

①将加A连接T载体的连接液转入含100μL感受态细胞的1.5mL Eppendorf管中，冰上放置30min；

②42℃热激90s后，立即冰浴2min；

③加入LB液体培养基500μL，置于37℃摇床振荡培养1h(120r/min)， 使细菌恢复正常生长状态；

④取上述菌液100μL涂布于含氨苄青霉素的LB筛选平板上，待菌液完全 被培养基吸收后倒置培养皿进行培养，37℃培养16～24h。

⑤挑选菌落PCR及酶切验证正确的克隆送北京六合华大基因科技股份有 限公司进行测序分析，获得候选基因的启动子。

(4)、启动子表达载体的构建

分别用相应的双酶切后回收启动子片段和线性化处理的 pCAMBIA1381质粒。用T4连接酶连接回收的目的片段及线性化载体(1μL 10×T4ligase buffer，1μL T4ligase，2μL线性化载体，6μL目的片段)，PCR 和双酶切验证菌落，获得相应启动子的表达载体。

(5)、表达载体转化根癌农杆菌EHA105

①取10μL表达载体质粒DNA加入从超低温冰箱取出的农杆菌感受态细 胞，混匀后冰浴30min；

②用液氮速冻1min；

③加入1mL LB培养基，28℃ 120r/min培养4h；

④4000r/min离心1min，弃上清；加150μL LB培养基重悬，将菌液涂布 与含50μg/mL Kan和10μg/mL Rif的LB固体平板；

⑤28℃培养2～3d至单菌落长出，进行菌落PCR鉴定。

⑥挑取阳性克隆，用50％甘油(1：1)保存。

农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤组织诱导消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜， 用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性 塑料培养皿，内含50ml诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件 下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的 诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50ml无菌管中，加入表达 载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。 后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。

(4)恢复将共培养的愈伤转移至恢复培养基上(愈伤之间尽量避免重叠)。 23℃黑暗培养3～5d。

(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性 胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至 长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组 织)挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16 h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培 养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。 转基因水稻苗中启动子的表达特性鉴定

GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染 色定性的研究GUS的表达水平和表达模式。

GUS染色所用试剂及流程参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion： β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，具体如下：

①染色：将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温箱中放置24h-36h。

②脱色：加入100％乙醇浸泡直至完全脱色。可用含有30％甘油和70％ 乙醇的溶液保存。

③在显微镜下拍照记录。

按上述方法进行GUS染色，结果如图5所示(标尺＝0.2cm)，在含有 POsRo5：：GUS转基因水稻植株中，在幼苗时期，该启动子只在根部(A)表 达，在叶(B)、茎(C)中没有着色。这表明POsRo5启动子驱动GUS基因只 在根部表达，由此说明，POsRo5启动子是根部特异表达启动子。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员 可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求的范围。

Claims (5)

1.一种植物特异表达启动子，其特征在于，

其为水稻盐诱导表达启动子POssalt2，所述水稻盐诱导表达启动子的DNA序列由SEQID No:1所示的DNA序列构成。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的水稻盐诱导表达启动子POssalt2。

3.一种根据权利要求1中所述的水稻盐诱导表达启动子POssalt2在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1所述的水稻盐诱导表达启动子POssalt2连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。

5.一种增强植物耐盐能力的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1中所述的水稻盐诱导表达启动子POssalt2连接目标基因，构成重组载体，将所述重组载体导入到目标植株中，当所述目标植株所处环境中盐分增多时，所述水稻盐诱导表达启动子POssalt2诱导目标基因的表达，提高植株的在盐环境下的生存能力。

Images