CN116536286B - 水稻OsCTK1蛋白及其编码基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻OsCTK1蛋白及其编码基因在提高植物抗非生物胁迫及产量中的用途。本发明分别采用超表达和CRISPR敲除技术将水稻OsCTK1基因在水稻中进行超表达或进行敲除突变，根据转基因水稻植株的表型变化发现，在水稻中超表达OsCTK1基因能够显著改善水稻抵御低温胁迫的能力，因此，水稻OsCTK1蛋白及其编码基因能够应用于提高植物对于非生物胁迫抗性。同时，将水稻OsCTK1基因在植物中进行过表达得到转基因植物，所得到的转基因植物对于低温胁迫的抗性明显增强，并且对于产量有显著增加。本发明在改良、增强水稻抗逆性以及加速抗逆分子育种进程等方面具有应用前景。
Description
技术领域
本发明属于水稻抗性基因领域，具体涉及水稻OsCTK1蛋白及其编码基因在提高植物抗非生物胁迫及产量中的用途。
背景技术
水稻起源于热带、亚热带地区，属于喜温作物，对低温敏感。低温冷害不仅限制水稻的地理分布，同时严重影响水稻的生长发育从而导致水稻产量和品质下降。近年来，因直播稻大面积推广以及水稻种植区域不断由热带、亚热带向高海拔、高纬度地区扩张，水稻遭受低温冷害(低于15℃)的频率有增加趋势。因此，挖掘并利用调控水稻耐冷性的关键基因，培育耐低温水稻品种具有重要意义。
挖掘并利用调控水稻产量的关键基因，培育高产优质的品种具有重要意义。
水稻耐寒性及高产都是由多基因控制的复杂数量性状，近年来，只鉴定出少数与水稻耐寒性及产量相关的基因，并且既能够提高水稻耐寒性又可提高水稻产量的基因更鲜有报道，因此利用现代分子育种已成为改良水稻耐冷性及提高产量的一种快速有效途径之一。
本发明人课题组前期利用全基因组关联分析鉴定到的一个苗期耐冷调控基因酪蛋白激酶CTK1(Cold tolerance kinase 1)。利用磷酸化组学，蛋白互作分析等实验，证明CTK1可以磷酸化不同类型的蛋白家族成员。酪蛋白激酶I(Casein kinase 1,CKI)是一类在生物体中最早被发现，且在真核生物中高度保守的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白激酶。植物中已有研究表明，CKI的功能主要包括激素合成与信号传导、开花时间和逆境响应调控等方面。水稻CKI1能够通过生长素信号通路调控细胞的伸长，从而影响根部形态建成。迄今为止，未见水稻中OsCTK1蛋白或其编码基因在提高植物耐冷胁迫作用的任何报道。
发明内容
本发明的主要目的在于提供水稻OsCTK1蛋白或其编码基因，以及其在提高植物抗非生物胁迫及产量中的用途。本发明提供了一种新的水稻抗逆相关OsCTK1基因，是从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它具有植物特有高度保守的Ser/Thr激酶结构域，可通过磷酸化下游底物来响应逆境胁迫。
为了实现上述之发明目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种提高植物抗非生物胁迫性及产量的水稻OsCTK1蛋白的编码基因OsCTK1，所述编码基因OsCTK1的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供了一种提高植物抗非生物胁迫性及产量的水稻OsCTK1蛋白的编码基因OsCTK1，所述编码基因OsCTK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面，本发明提供了一种提高植物抗非生物胁迫性及产量的水稻OsCTK1蛋白，所述水稻OsCTK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第四方面，本发明还提供了一种含有所述的编码基因OsCTK1的重组表达载体。将所述水稻OsCTK1蛋白的编码基因与表达调控元件相连接得到重组表达载体；该重组植物表达载体可以由水稻OsCTK1编码区组成；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、增强型启动子、组织或器官特异性启动子。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及潮霉素，除草剂基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如绿色荧光蛋白等。
在某些实施例中，所述重组表达载体构建包括：在植物表达载体p1300s的GFP之前插入水稻OsCTK1蛋白的编码基因。
第五方面，本发明还提供了一种含有所述的编码基因OsCTK1的重组表达载体的宿主细胞。
第五方面，本发明还提供了一种提高植物抗非生物胁迫性及产量的方法，包括以下步骤：
1)构建含有水稻OsCTK1编码基因的CDS的重组表达载体，其中，所述水稻OsCTK1编码基因的CDS的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；可选地，将水稻OsCTK1蛋白的编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该编码基因的重组表达载体；
2)将所构建的重组表达载体转化到植物组织或植物细胞中，使水稻酪蛋白编码基因CTK1在植物中进行过表达；
3)培育筛选得到对非生物胁迫抗性及产量提高的植物新品种。
在某些实施例中，所述植物选自水稻、棉花、玉米、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、甘蔗或拟南芥中的任意一种。
在某些实施例中，所述非生物胁迫包括低温胁迫。
在某些实施例中，所述产量的筛选指标包括结实率和有效分蘖数。
第六方面，本发明还提供了所述的编码基因OsCTK1、所述的水稻OsCTK1蛋白在提高植物抗非生物胁迫性及产量中的应用。
在某些实施例中，所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱中的任意一种；所述非生物胁迫包括低温胁迫；所述产量的筛选指标包括结实率和有效分蘖数。
本发明人前期通过蛋白互作以及体内与体外磷酸化实验发现OsCTK1可以与核糖体蛋白、SNF1相关激酶、钙离子通道蛋白等相互作用并磷酸化。本发明进一步通过6℃极端低温以及15℃相对低温条件下，超表达和CRISPR敲除水稻植株的表型变化，进行其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻苗期与孕穗期非生物胁迫应答的关系，结果表明在水稻中超表达OsCTK1基因能够显著改善水稻抵御低温胁迫的能力，并且超表达OsCTK1植株结实率以及分蘖数增加。本发明为改良、增强水稻抗逆性，培育高产耐逆品种，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
本发明中所述术语“转化”指将水稻OsCTK1蛋白的编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。
本发明中所述术语“有效分蘖数”指指水稻的分蘖中能够最终结实的分蘖叫有效分蘖。“结实率”指饱满谷粒占总粒数的比例。
附图说明
图1为过表达材料和敲除材料转基因植株潮霉素筛选阳性鉴定，
图2为过表达材料和敲除材料转基因植株PCR阳性鉴定，利用扩潮霉素的引物，引物为Hyg+-F:GAGCATATACGCCCGGAGTC,Hyg+-R:CAAGACCTGCCTGAAACCGA,其中，1-4号泳道分别过表达材料鉴定，5号泳道为敲除突变体引物鉴定，6号泳道为载体质粒阳性对照，7号泳道道为添加的的双蒸水的阴性对照。
图3为水稻OsCTK1基因的各个株系的敲除情况。突变类型1在位于第3个外显子处的Target 1序列中缺失40bp,导致40aa处氨基酸出现错义突变直至57aa处提前终止翻译；突变类型2在位于倒数第2个外显子处的Target 2序列中缺失1bp碱基，导致氨基酸序列在第334aa处出现错义突变直至350aa处提前终止翻译。
图4为水稻OsCTK1基因过表达材料的各个株系的表达量情况。过表达各个株系表达水平均比野生型高12-18倍。
图5为超表达OsCTK1、CRISPR敲除转基因植株与野生型植株6℃下苗期耐冷表型以及15℃下产量相关表型。A为6℃处理前以及恢复7天后表型图片，B为6℃处理前后存活率统计结果，C为15℃下低温冷害的产量表型图片，D为15℃下低温冷害的结实率以及分蘖数统计结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1OsCTK1基因在水稻中的遗传转化实验
⒈OsCTK1基因过表达载体构建
首先用两个限制性内切酶Kpn1和Sac1消化p1300S载体(南京农业大学张红生课题组所获得该载体)，使其线性化并回收。
根据日本晴序列全长设计引物，以日本晴cDNA为模板，扩增获得OsCTK1蛋白的基因编码区全长，去掉终止密码子(TGA),同时在5’和3’端加上p1300S载体线性化后的接头(小写部分为接头序列)，扩增引物为：
F：5’-tcgcgagctcggtaccATGGACCGCATCGTCGG-3’(SEQ ID NO.4)；R：5’-gcccttgctcaccatggtaccATTTGCAGGCGAATC-3’(SEQ ID NO.5)；
PCR扩增并回收目的DNA片段(1290bp)。采用ClonExpress Ultra One StepCloning Kit(Vazyme Biotech，Code no：C115-01)进行目的片段与线性化载体的同源重组，阳性克隆质粒进行PCR和测序验证，测序结果表明在载体p1300S的两个酶切位点之间插入了SEQ ID NO.1所示的OsCTK1基因片段,得到重组载体命名为p1300S-OsCTK1。
⒉OsCTK1基因CRISPR敲除载体构建
根据OsCTK1基因cDNA序列设计敲除的靶位点，靶位点1序列：5’-TCGCCTCATAAAACAGCTG-3’(SEQ ID NO.6)，靶位点2序列：5’-GGGAGCAAACAGGGCCAAG-3’(SEQID NO.7)，
根据靶点设计引物CTK1target1-BsF、CTK1target1-F0、CTK1arget2-R0和CTK1target2-BsR，以稀释100倍的pCBC-MT1T2质粒为模板进行四引物PCR扩增。纯化回收PCR产物，利用酶切-连接体系进行最终载体构建，载体命名为CRISPR-Osctk1。本实验方法及载体来自中国农业大学生物学院陈其军实验室。
CTK1target1-BsF引物序列：AATAATGGTCTCAGGCGTCGCCTCATAAAACAGCTG(SEQ IDNO.8)
CTK1target1-F0引物序列：GTCGCCTCATAAAACAGCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQID NO.9)
CTK1arget2-R0引物序列：GGGAGCAAACAGGGCCAAGCGCTTCTTGGTGCC(SEQ ID NO.10)
CTK1target2-BsR引物序列：ATTATTGGTCTCTAAACGGGAGCAAACAGGGCCAAG(SEQ IDNO.11)
3.农杆菌转化
冻融法将表达载体p1300S-OsCTK1和敲除载体CRISPR-Osctk1转入农杆菌EHA105感受态细胞中(感受态在上海生工公司购买)，实验具体方法参照分子克隆实验指南。
4.遗传转化
1)灭菌：将健康饱满的日本晴种子去壳，用70％乙醇浸泡1-2min后，加入50％bleach并放置摇床(200rpm)约1-1.5h，用无菌水冲洗4-6次后，将种子放置在无菌滤纸上吸干水分，后续均匀放置在NBD培养基中，26℃黑暗培养。以上步骤均在超净工作台操作。
2)继代培养：暗培养约10-15天后，将水稻种子芽剥离，转入继代培养基NBD上继续26℃暗培养；10天后，将种子与愈伤剥离，并且将愈伤转移至新的继代培养基NBD中，26℃暗培养约4-5天后即可进行农杆菌转化；
3)期间将含有质粒的农杆菌在相应抗生素培养基上划线，2天后挑取单克隆，再次划线，培养1天；
4)从培养基上收集菌体，涡旋悬浮于含乙酰丁香酮(AS)的NBC1培养基中，调至OD＝0.1-0.2左右；
5)转化：另外挑选健康愈伤组织于无菌三角瓶中，加入上述调好浓度的悬浮液，室温下轻轻摇晃约10min，弃菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上，吸去多余菌液并且放置在超净工作台中吹风直至愈伤组织微微泛白后，将愈伤上转移至铺有一层无菌滤纸的NBC2培养基中，22℃黑暗共培养2天；
6)筛选：将共培养的愈伤转移至含相应抗生素的NBS1培养基中，26℃黑暗培养10-12天后转移至NBS2培养基中，继续26℃黑暗培养10-12天；
7)分化：将愈伤转移至NBR1培养基后，26℃黑暗培养6天，转移至15h光照/9h黑暗的人工气候培养箱中26℃培养15-20天，期间将有出现绿点的愈伤组织转移至NBR2培养基中培养，直至分化成苗；
8)将高约5cm长的转基因幼苗剪根与叶，转至生根培养基中，12h光照/12h黑暗的人工气候培养箱中26℃培养；
9)炼苗：待转基因幼苗根系足够发达，开启培养的瓶盖约2天后，洗去培养基，将幼苗至于水中培养1星期后转移至土壤中种植。
对产生的T0代转基因苗进行PCR验证及种植繁种，收获T1代转基因种子，通过阳性验证及测序，获得相应纯合突变材料，对获得的纯合突变材料继续种植繁种，后代利用潮霉素(50mg/L)筛选种子获得相应Cas9 free的纯合突变材料。
以下OE及KO引物是用于后续材料鉴定是否纯合使用的鉴定引物：
OE引物
CTK1-1300S-F：TCAACTGAGAGAGGTCCCCACCCT(SEQ ID NO.12)
GFP-R：TTCTTCTCCTTTACTCAT(SEQ ID NO.13)
KO引物
CTK1-Target1-F：TCAGATTCCTTCTTTGATGAG(SEQ ID NO.14)
CTK1-Target1-R：ACCATCTGGTCTGCTAACATT(SEQ ID NO.15)
CTK1-Target2-F：GGCCTGTTTGTAGCATGGTTCCGGAGC(SEQ ID NO.16)
CTK1-Target2-R：TGCAAGCACTCTAGTAGTCTAGTGGAC(SEQ ID NO.17)
以下为本实施例中使用的培养基配方：
表1激素及抗生素贮存液的配制
表2遗传转化所用的NBD诱导培养基：pH＝5.8
表3共培养液体培养基(NBC1)：pH＝5.2
表4选择培养基(NBS1/2)：pH＝5.8
表5生根培养基
5.转基因植株分子鉴定和抗逆性鉴定
(1)选用T2代OsCTK1转基因超表达、OsCTK1基因CRISPR和野生型日本晴的种子
(2)水稻土培：新收获的种子破休眠后在28℃培养箱浸种3d至发芽后进行播种。挑选发芽一致的种子均匀的播在按照营养土：蛭石＝3：1的配制的混合土中，表面覆盖一层蛭石后在28℃培养箱正常生长，期间每2-3d浇水1次。
(3)水稻水培：挑选发芽一致的种子播于除去底部的96孔PCR板，置于28℃培养箱生长，期间每2-3d换水，第三叶刚抽出时加入适量营养液，第三叶完全展开后换成清水。
(4)消毒后的水稻种子在常温下发芽后播种，每个实验组至少设置3个重复，按上述条件28℃光照培养2周后在6℃下处理2-4天(根据实际情况决定)，然后转移至28℃下恢复生长1周。
(5)对于存活率，本研究判断标准为是否有新叶生长出，有新叶则认为该植株存活，反之，则判定为死亡。根据图5A，B图的试验结果可见，根据图5A，B图可见，在水稻中超表达水稻OsCTK1基因能够显著改善水稻抵御低温胁迫的能力，将水稻中的OsCTK1基因进行突变或敲除后会明显降低水稻抵御低温胁迫的能力，因此，水稻OsCTK1蛋白及其编码基因和重组载体能够应用于增强作物的抗非生物胁迫能力。
(6)利用荧光定量PCR(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(vazyme))和测序的方法检测转基因水稻在RNA水平的表达量。图4为OsCTK1基因过表达材料的各个株系的表达量。从图4中见，相比于野生型材料，OsCTK1基因过表达材料中OsCTK1基因的表达量都有不同程度的提高。
6.转基因植株产量鉴定
统计超表达与敲除突变体植株在孕穗期经历12-19℃的低温，表型见图5C,D，结果表明在水稻中超表达水稻OsCTK1基因能够显著提高水稻结实率与分蘖数，将水稻中的OsCTK1基因进行突变或敲除后会明显降低水稻结实率与分蘖数，因此，水稻OsCTK1蛋白及其编码基因和重组载体能够应用于增强作物的产量。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (3)
1.一种提高水稻抗低温胁迫性及产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建含有水稻OsCTK1编码基因的CDS的重组表达载体，其中，所述水稻OsCTK1编码基因的CDS的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；
2)将所构建的重组表达载体转化到水稻组织或水稻细胞中；
3)培育筛选得到对抗低温胁迫性及产量提高的水稻新品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产量的筛选指标包括结实率和有效分蘖数。
3.水稻OsCTK1编码基因在提高水稻抗低温胁迫性及产量中的应用，其特征在于，所述水稻OsCTK1编码基因的CDS的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
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