CN102925466A - 一种棉花酪蛋白激酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花酪蛋白激酶基因及应用，涉及一种从棉花花药表达谱中鉴定的控制花药发育的基因GhCKI的分离克隆、功能验证和应用。GhCKI基因编码的蛋白与拟南芥ATCKL2基因编码的蛋白有72%的同源性，GhCKI基因在花药中优势表达，具有控制花药发育的功能，通过遗传转化可应用于各种植物不育系的培育，同时可作为高温胁迫下植物花药育性稳定性的标记基因。

Description

一种棉花酪蛋白激酶基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种新的棉花酪蛋白激酶基因，采用反向遗传学的方法，通过对棉花高温胁迫下花药表达谱的分析，分离克隆的GhCKI基因为控制棉花花药发育的基因。本发明还涉及含有该基因或其同源基因的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植物的花药发育在农业生产中的应用。

背景技术

温度是影响植物分布和生长的重要环境因素，然而随着工业化的快速发展，温室气体的大量排放，全球气候变暖的加剧，高温天气频率的增加，从而使得植物生长面临着高温胁迫的严峻挑战。一般来说，当环境温度短时升高10℃～15℃时，会对农作物产生高温胁迫，胁迫所造成的伤害与胁迫强度、持续时间、农作物种类及基因型有关(Wahid等，Heat tolerance in plants：An overview，Environm ental and Experim ental Botany.2007.61：199-223)，而农作物的生殖生长比营养生长对高温胁迫更为敏感，并且雄蕊对高温的敏感性又明显高于雌蕊(Mascarenhas等，Pollen and the heat shock response，Sexual PlantReproduction.1996，9：370-374)。

由于许多重要农作物如水稻(Oryza sativa)，玉米(Zea mays)，番茄(Lycopersiconesculentum)，辣椒(Capsicum annuum)，棉花(Gossypium)等开花结果期都集中在夏季高温季节，所以这些农作物的生殖生长受到高温胁迫时，经济损失更为严重，因此高温引起的雄性不育受到广泛的重视。随着细胞学、生理学和分子生物学的发展，对于雄性不育的各种细胞水平的变化，生理学指标的变化以及通过分子生物学手段对相关的基因的表达都有了很大的研究进展。从细胞学上研究表明绒毡层是花药中对高温最敏感的组织，极易受高温伤害(Suzuki等，Ultrastructural study on degeneration of tapetum in antherof snap bean(Phaseolus vulgaris L.)under heat stress，Sexual Plant Reproduction.2001，13：293-299)。在生理学上，高温胁迫主要是通过影响糖代谢和内源激素含量从而影响花药的发育，番茄在开花前遇到高温时，热敏品种未成熟花粉中淀粉含量的增加受到抑制甚至减少，而成熟花粉粒中可溶性糖含量相应降低，最终引起番茄花粉生活力的降低，但耐热品种淀粉的积累量和可溶性糖含量均未受到明显影响(Pressman等，The effect ofheat stress on tomato pollen characteristics is associated with changes in carbohydrateconcentration in the developing anthers，Annals of Botany.2002，90：631-636)。内源激素：吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)和赤霉素(gibberellic acids，GAs)能促进花粉发育，脱落酸(abscisic acid，ABA)则抑制花粉发育(Tang等，Possible correlation between hightemperature induced floret sterility and endogenous levels of IAA，GAs and ABA in rice(Oryza sativa L.)，Plant Growth Regulation.2008，54：37-43)。在分子生物学方面，主要是集中于热激蛋白的研究，热激蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物体遇到高温时迅速合成的一类蛋白质，在生物体对抗高温胁迫中起重要作用。但当花粉不能有效的响应高温从而合成不够量的HSPs时，其不能有效的对抗高温胁迫，从而使花粉在高温下丧失生活力(Young等，Developmental and thermal regulation of the maize heat shock protein，HSP101，Plant Physiology.2001，127：777-791)。

棉花是一种重要的经济作物，同时也是生物技术应用范围比较广的农作物。通过对棉花基因改造而得到的抗虫棉给传统的农业生产带来了更多对生物技术的期望。棉花的生物成分和基因组都很复杂，对棉花的基因克隆和功能验证也是比较困难的。目前已有的几个功能基因的研究多数和纤维发育相关，而对于高温胁迫下影响花药发育相关基因的克隆还未见报道。申请人本发明提出之前，在植物中对于I型的酪蛋白激酶的报道主要集中在从不同的植物中分离得到了I型的酪蛋白激酶，但对于其在植物中的作用底物及生理功能等方面的研究很少，在拟南芥中Snf4是糖代谢调控复合体SnRKs的γ亚基，Snf4参入拟南芥对于葡萄糖的感知和逆境信号的传递，酵母snf4突变体能被拟南芥的Snf4，CKI和MYB30等基因恢复，所以CKI可能存在着与Snf4相类似的功能，参入葡萄糖信号(Kleinow等，Functional identification of an Arabidopsis snf4 ortholog by screening forheterologous multicopy suppressors of snf4 deficiency in yeast，Plant J.2002，23：115-122)。在水稻中分离到一个长度为1939bp的OsCKI1，其编码463个氨基酸的可溶性蛋白，此基因为组成型表达，并具有受植物激素油菜素内酯(BR)及脱落酸(ABA)诱导的表达模式，通过参与细胞延伸、细胞分裂及相关信号转导途径的调控过程而对水稻根部发育产生影响，并参与植物对外源激素的应答过程(Liu等，OsCKI1，a rice casein kinase I，playssignificant roles in auxin related root development and functions of plant hormones，Plant J.2003，36：189-202)。拟南芥的AtCKL6通过磷酸化微管多聚物从而影响皮层微管的排列及各向异性细胞生长和细胞形态的形成(Gili等，Arabidopsis casein kinase 1-like 6(CKL6)contains microtubule-binding domain and affects organization of cortical microtubules，PlantPhysiology.2008，148：1897-1907)。最近报道从水稻突变体库里分离到一个早花突变体el1(early flowering1)，也是一个CKI基因，可以通过磷酸化SLR1从而负调控GA信号(Dai等，Rice early flowering 1，a CKI，phosphorylates DELLA protein SLR1 to negativelyregulate gibberellin signaling，EMBO journal.2010，29：1916-1927)。从上我们可以看出CKI参入了多种生物学过程，并且不同的CKI家族成员其生物学功能也不同。在本发明提出之前申请人从棉花高温胁迫下花药发育的表达谱中得到一条CKI基因序列，通过转基因验证表明CKI基因与植物花药的发育有关，对CKI参入植物花药发育代谢路径的研究以及高温胁迫下转基因棉花的育性相关分子标记开发都有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种棉花酪蛋白激酶基因GhCKI，该基因从棉花高温胁迫条件下花药表达谱中鉴定并分离克隆，具有如SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序列，或至少50％同源性的序列，以及上述DNA片段编码的蛋白或经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

本发明的另一个目的是在于提供了一种棉花酪蛋白激酶基因GhCKI在控制棉花花药发育中的应用，通过GhCKI基因，SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.No.2或与其功能等同的同源基因在棉花植株中超量表达或抑制表达，一种分离的蛋白质，其具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列至少50％同源性的序列，来达到控制棉花花药发育的目的，从而应用于各种植物不育系的培育，同时可作为高温胁迫下植物花药育性稳定性的标记基因。

本发明还提供了一种用GhCKI基因进行高效植物遗传转化的方法。具体地说，本发明提供了一种含有SEQ ID NO.1所示序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽或同源类似物。本发明还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。

本发明的GhCKI基因的表达载体转化的宿主是包括棉花在内多种植物，培育各种植物的雄性不育系；可使用包括本发明的GhCKI基因片段为靶标的RNAi载体转化宿主棉花，可用于培育耐高温的棉花品种。

实现本发明的技术如下：

本申请人前期工作是对陆地棉‘84021’和‘H05’高温(白天37-39℃，晚间29-31℃)胁迫下花药进行表达谱分析(见图1a)，通过基因表达聚类分析，分离出一类在两种棉花品种中表达变化趋势相反的基因。从这一类基因中分离出一条与其他植物CKI具有较高同源的序列，并对这条序列进行表达分析(见图1b)。与其他物种CKI基因的进化分析和生物信息学分析表明，该序列与拟南芥的AtCKIL2(AT1G72710)同源性最高，并将其命名为GhCKI(见图2)。从陆地棉品系‘84021’和‘H05’中提取高温(白天37-39℃，晚间29-31℃)处理及正常温度(白天35-37℃，晚间25-28℃)下开花当天开裂之前的花药的总RNA(提取方法根据Zhu等，An improved simple protocol for isolationof high quality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction，ActaAgronomica Sinica.2005，31.1657-1659.)，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)(Frohman等，Rapid production offull-length cDNAs from rare transcripts：amplification using a single gene-specificoligonucleotide primer.PNAS 1988，85，8998-9002.)扩增出cDNA 5’和3’端，利用sequencher软件(公用的分析软件)进行序列拼接后得到GhCKI的cDNA序列(SEQID No.1)，一种分离的基因的cDNA，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。再通过ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定包含一个完整的ORF，后用引物GhCKI-F(5’ATGGAACCTTGTGTTGGTAATAAG’)和GhCKI-R(5’TTAATAGTGAATTCTCTCGTCGCC 3’)扩增出GhCKI基因的ORF(1392bp)。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min20sec，32个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因ORF，一种分离的基因的ORF，其序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定ORF所对应的463个氨基酸的蛋白质序列是与CKI蛋白同源的。一种分离的蛋白质，其序列为与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。根据GhCKI的ORF设计引物，并在引物两端分别加上XbaI和SacI的酶切位点及保护碱基，分别将该引物命名为GhCKIoe-F和GhCKIoe-R，再以GhCKI基因的cDNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过酶切连接的方法连入到以相同酶消化的pCAMBIA2300S(pCAMBIA2300S载体的前体是由澳大利亚CAMBIA实验室Centerfor the Application of Molecular Biology to International Agriculture惠赠的pCAMBIA2300。将pCAMBIA2300载体上的CaMV35S启动子通过酶切连接反向整合到pCAMBIA2300的多克隆位点上，即得到本发明的所用载体pCAMBIA2300S)的载体上，从而获得超表达载体p35s-GhCKI。所述的过量表达载体p35s-GhCKI含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的其中之一核苷酸片段的表达载体，以及植物表达载体pCAMBIA2300S。

根据GhCKI基因与其它植物的CKI的比对结果在特异区设计RNAi引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，分别将该引物命名为引物GhCKIri-F和引物GhCKIri-R，再以实施例1中得到GhCKI基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物通过BP重组反应导入RNAi载体pHellsgate4(重组酶购自Invitrogen公司，美国；RNAi载体见Wesley等，Construct design for efficient，effective andhigh-throughput gene silencing in plants.Plant J.2001.27，581-590.)，构建的RNAi载体pHellsgate4-GhCKIi。

采用农杆菌GV3101(Roger等，A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends inplant science.2000.5，1360-1385.)介导的遗传转化棉花的方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetictransformation of cotton.Biologia Plantarum，2006，50：519-524；An efficient graftingsystem for transgenic plant recovery in cotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell，Tissueand Organ Culture，85：181-185，2006；Factors affecting stable transformation and plantregeneration during transforming embryogenic callus of Upland cotton (Gossypium hirsutumL.)via Agrobacterium tumefaciens，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，81：229-237，2005)，将构建好的p35s-GhCKI或pHellsgate4-GhCKIi载体导入棉花材料‘YZ1’和野生型拟南芥，农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照(Zhang等，Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature Protocols，2006.1：641-646)。

获得转基因植株后，分单株提取叶片的RNA，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，以GhCKI-F(5’ATGGAACCTTGTGTTGGTAATAAG’)和GhCKI-R(5’TTAATAGTGAATTCTCTCGTCGCC 3’)引物进行RT-PCR，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min 20sec，32个循环；72℃延伸10min。

对转基因苗进行表达量分析后，结合表达量对GhCKI的表型进行分析，首先对转基因植株的进行光学拍照观察，其次通过TTC染色，通过光学显微镜观察花粉活力，再者对开花后5个小时的转基因拟南芥的柱头进行苯胺蓝染色，染色后在光学显微镜下观察拍照。通过观察后发现具有GhCKI高表达量的转基因植株花药在开花时不能正常开裂，花药败育，花粉活性降低，转基因植株的柱头上没有花粉粒。

采用Southern blotting对转基因拟南芥6个家系进行拷贝数分析(DNA提取和Southern实验参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，实验结果表明6个家系有着不同的插入位点。

通过以上分析，说明转基因植株花药不开裂表型导致的雄性不育是与GhCKI表达量相关联的，而不是因为插入突变引起的。因此GhCKI基因是一个依赖于表达量的、与花药发育相关的基因，因此，通过提高GhCKI基因的表达水平可以影响植物花药的发育，使开花当天花药不能正常开裂，花药败育。如果将GhCKI基因转入到不同的植物或者不同的棉花品种中，可以用于植物不育性的创制，对培育植物雄性不育系具有重要意义。

本发明的优点：

从棉花花药表达谱中鉴定的控制花药发育的基因GhCKI的分离克隆、功能验证和应用。GhCKI基因编码的蛋白与拟南芥ATCKL2基因编码的蛋白有72％的同源性，GhCKI基因具有控制花药发育的功能，通过遗传转化可应用于各种植物不育系的培育，同时可作为高温胁迫下植物花药育性稳定性的标记基因。

1.通过表达谱分析后，缩小了候选基因的范围，将目标在花药发育上，减少了工作量。

2.虽然在低等生物和拟南芥及水稻中克隆到了I型酪蛋白激酶(casein kinase I，CKI)，但只是对其做酶学特性分析，未有具体的生物学功能的报道。目前在棉花中还没有对GhCKI研究的报道，本发明克隆的GhCKI基因对植物花药的发育有显著的影响，这对阐明I型酪蛋白激酶的生物学功能有重要意义。

3.过量表达GhCKI的棉花和拟南芥其花药不能正常开裂，说明GhCKI基因对花药育性的影响很明显，通过基因工程技术提高或减弱GhCKI基因的表达量能够控制植物花药的发育。

4.花药的发育直接影响育性，通过基因工程技术提高或减弱GhCKI基因的表达量能够达到控制植物育性的目的，GhCKI基因的克隆将有助于各种植株不育系的培育。

5.选育雄性不育系一直为棉花育种家所重视，控制棉花花药育性基因的发现和利用将有助于解决生产上去雄工作量大的难题。

6.全球气候变暖的加剧，使得选育耐高温的品种显得尤其重要，GhCKI基因的克隆将有助于培育更耐高温的品种。

7.花药发育遗传研究对指导育种实践、品种改良及品种推广均具有重要意义，因此发掘和鉴定棉花花药发育基因，并深入探讨棉花花药发育基因的分子作用机理，具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为一种高温胁迫条件下花药的表达谱分析及GhCKI基因的分离示意图。

高温胁迫处理两种不同的陆地棉材料，分别为‘84021’和‘H05’，‘84021’为高温不敏感品种，高温条件下花药能正常开裂并散粉，‘H05’为高温敏感品种，高温条件下花药能不能正常开裂。a1)高温条件下早上八点的花，‘8H’指高温条件下的‘84021’的花，‘HH’指高温条件下的‘H05’的花，以下同此。a2)高温条件下午五点的花。a3)为a1)的特写，a4)为a2)的特写。b1)RT-PCR检测GhCKI在表达谱分析材料中的表达，b2)Northern blot检测GhCKI在表达谱分析材料中的表达。

图2为一种采用ClustalW软件(公开免费软件)对GhCKI蛋白质序列分析示意图。

结果表明GhCKI与单子叶水稻的OsCKI1及双子叶拟南芥AtCKI在5’保守区域的序列同源性很高，但是3’区域同源性很低。后又使用http://greenphyl.cirad.fr/v1/cgi-bin/gost.cgi在线分析软件，对GhCKI基因与水稻，拟南芥进行进化树分析，结果表明GhCKI与拟南芥的AtCKIL2最为接近。

图3为一种用Real-time PCR和Northern blot检测GhCKI基因在陆地棉不同组织中的表达水平示意图。

基因在花药中有高量表达，柱头和花瓣中有少量表达。该基因在柱头，花瓣中的表达可能是开花当天花药开裂，部分花粉散落到柱头、花瓣上。在其它的组织中几乎没有检测到GhCKI基因的表达。图3中棉花组织依次是：1.花瓣；2.0DPA纤维；3.5DPA纤维；4.胚珠；5.花药；6.叶片；7.柱头。用Real-time PCR检测各组织GhCKI基因相对表达量时以5DPA纤维为参照(即设定为1)，GhUB7为内参基因。

图4为一种超量表达载体p35s-GhCKI的构建示意图。

将GhCKI全长ORF经酶切连载接反应插入pCAMBIA2300S后的情况。

图5为一种RNAi载体pHellsgate4-GhCKI的构建示意图。

将GhCKI部分基因片段(883-1392bp)经重组反应插入pHellsgate4载体。

图6为一种GhCKI转基因棉花表型分析示意图。

超表达株系与野生型相比，花器官更小，开花当天的花药不能正常开裂。图中：a)花器官大小比较；b)对应植株的花药及柱头比较；c)对应植株开花当天花粉活性检测，GhOE14、GhOE22分别为超量表达GhCKI的2个株系，WT为未转基因的YZ1植株。GhCKI的RNAi植株与野生型没有差别。

图7为一种GhOE14、GhOE22、WT中GhCKI的基因表达分析示意图。

图中为一种GhOE14、GhOE22分别为超量表达GhCKI的2个株系，WT为未转基因的YZ1植株。

图8为一种GhCKI转基因拟南芥表型分析示意图。

超表达GhCKI的拟南芥植株与野生型相比，开花持续的时间更长，植株的次级分枝更多，角果变短，种子产量降低，花药不开裂。图中：a)开花持续的时间长；b)次级分枝多；c)角果长度变短；d)可见花瓣数目多；e)到g)花药不开裂；h)开花后5h花粉管萌发染色。

图9为一种拟南芥AtOE15、AtOE16、AtOE24、AtOE25、AtOE44及野生型(WT)中GhCKI的基因表达分析示意图。

图中：AtOE15、AtOE16、AtOE24、AtOE25、AtOE44为超量表达GhCKI的株系，WT为未转基因的拟南芥植株。AtActin7为内参基因示意图。

图10为一种拟南芥AtOE15、AtOE16、AtOE24、AtOE25、AtOE44、WT中GhCKI的拷贝数分析示意图。

图11为一种克隆的GhCKI基因的开放读码框序列。

具体实施方式

实施例1：

GhCKI基因分离克隆

1、表达谱分析

本申请人前期工作是对陆地棉‘84021’和‘H05’高温胁迫下花药进行表达谱分析(见图1a)，通过基因表达聚类分析，分离出一类在两种棉花品种中表达变化趋势相反的基因，后从这一类基因中分离出一条与其他植物CKI高度同源的序列，并对这条序列进行表达分析(见图1b)。与其他物种CKI基因的进化分析，生物信息学分析表明，该序列与拟南芥的AtCKIL2(AT1G72710)同源性最高，并将其命名为GhCKI(见图2)。从陆地棉品系‘84021’和‘H05’中提取高温处理及正常温度下开花当天开裂之前的花药的总RNA(提取方法根据Zhu等，An improved simple protocol for isolation of highquality RNA from Gossypium spp.suitable for cDNA library construction，Acta AgronomicaSinica.2005，31.1657-1659.)，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。

2、基因序列获得

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)(Frohman等，Rapid production offull-length cDNAs from rare transcripts：amplification using a single gene-specificoligonucleotide primer.PNAS 1988，85，8998-9002.)扩增出cDNA 5’和3’端，序列拼接后得到GhCKI的cDNA序列(SEQ ID NO.1)，一种分离的基因的cDNA，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。再通过ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定包含一个完整的ORF，后用引物GhCKI-F(5’ATGGAACCTTGTGTTGGTAATAAG’)和GhCKI-R(5’TTAATAGTGAATTCTCTCGTCGCC 3’)扩增出GhCKI基因的ORF(1392bp)。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min 20sec，32个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因ORF(SEQ ID NO.2)，一种分离的基因的ORF，其序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定ORF所对应的463个氨基酸的蛋白质序列(SEQID NO.3)是与CKI蛋白同源的。一种分离的蛋白质，其序列为与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

实施例2：

GhCKI在棉花不同组织的表达分析

以陆地棉YZ1为材料，提取以下7个不同组织的RNA，用Rea-time PCR和Northernblot检测GhCKI基因的表达水平。选取的7个组织分别是：1.花瓣；2.0DPA纤维；3.5DPA纤维；4.胚珠；5.花药；6.叶片；7.柱头。棉花总RNA提取方法根据上述Zhu等(An improved simple protocol for isolation of high quality RNA from Gossypiumspp.suitable for cDNA library construction.Acta Agronomica Sinica.2005，31.1657-1659.)发表的文献，RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司)处理，RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。核酸浓度的测定在Beckman DU800spectrophotometer上进行。RNA 260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μl 500μg/mloligo-dT(15)引物(购自Promega公司，美国)，1μl 10mM dNTP，DEPC-water混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl 0.1M dithiothreitol，40 units ofRibonuclease Inhibitor(Promega)，和200units ofSuperscriptIII RT(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptIII RT失活。每份cDNA稀释到300μl后-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物GhCKIRt-F(5′TTGATTCTGCCGACCCTAAGC 3′)和GhCKIRt-R(5′ATTCCTTTGAGGGCCGCTTC 3′)对GhCKI基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长83bp)。同时用引物UB7-F(5′GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3′)和UB7-R(5′CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3′)对棉花GhUbi7(GenBank登陆号：DQ116441)基因做特异扩增(扩增产物长198bp)，以作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系(20μl)包括：1μl稀释后的cDNA(等于10ng起始总RNA)，10μl 2×PCRMasterMix，200nM的引物。反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃35sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明：本发明克隆的基因GhCKI在所选取的组织中的表达量在花药中是最高的(见图3)。

实施例3：

超量表达载体及RNAi抑制表达载体的构建和转化

为了验证GhCKI基因的功能，申请人构建了超量表达和RNAi抑制表达载体转化棉花，并且利用超量表达载体还转化了拟南芥。

根据实施例1中得到GhCKI ORF设计超表达引物，在引物两端分别加上XbaI和SacI的酶切位点及保护碱基，分别将该引物命名为引物GhCKIoe-F和GhCKIoe-R，再以GhCKI基因的cDNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物使用限制性内切酶XbaI和SacI(NEB公司)完全消化，将酶切产物使用0.8％琼脂糖凝胶电泳(80V，40分钟)，挖取约1.4kb的DNA片断回收。取回收产物100ng，与经过限制性内切酶XbaI和SacI(NEB公司)消化过的双元载体pCABIA2300S(pCAMBIA2300S载体的前体是由澳大利亚CAMBIA实验室Center for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture惠赠的pCAMBIA2300。将pCAMBIA2300载体上的CaMV35S启动子通过酶切连接反向整合到pCAMBIA2300的多克隆位点上，即得到本发明的所用载体pCAMBIA2300S)50ng使用T4DNA连接酶(NEB公司)于16℃进行连接反应，反应进行16小时后，取连接产物2μl电转化大肠杆菌(E.Coli)感受态细胞Top10(购自美国Invitrogen公司)，转化产物进行兰白斑筛选。挑取白色转化子，使用GhCKI基因特异的引物a和b组合进行PCR阳性克隆的筛选，PCR反应条件：先94℃5分钟变性，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，总共进行25个循环，最后72℃7分钟延伸。获得了用于转化的超量表达质粒p35s-GhCKI见(图4)。根据GhCKI基因与其它植物的CKI的比对结果在特异区设计RNAi引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，分别将该引物命名为引物GhCKIri-F和引物GhCKIri-R，再以实施例1中得到GhCKI基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物通过BP重组反应导入RNAi载体pHellsgate4(重组酶购自Invitrogen公司，美国；RNAi载体见Wesley等，Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants.Plant J.2001.27，581-590.)，构建的RNAi载体pHellsgate4-GhCKIi见(图5)。

引物序列如下：

GhCKIoe-F：5′ACCGAGCTCTTGAAGTTGATTGATGGAACCTTGTGTTGG  3′

GhCKIoe-R：5′AGCTCTAGACCAAGCGTTTAATAGTGAATTCTCTCGTCGC  3′

GhCKIri-F：

5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGTATCAGCAATCACAGTTGACC

AATC 3′；

GhCKIri-R：

5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGATAGTGAATTCTCTCGTCGCCT3′

将构建的载体转化农杆菌菌株GV3101(Roger等，A guide to Agrobacterium binary Tivectors.Trends in plant science.2000.5，1360-1385.)，以下GV3101来源同，再通过农杆菌介导的转化方法转化棉花和拟南芥。

转化棉花所采用的转化受体材料为YZ-1，此材料是本实验室经过大量的筛选发现的一个具有很高胚胎发生能力的材料，农杆菌介导的转化棉花的转化方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identification of a novel elite genotype for in vitro culture andgenetic transformation of cotton.Biologia Plantarum，2006，50：519-524；An efficientgrafting system for transgenic plant recovery in cotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell，Tissue and Organ Culture，85：181-185，2006；Factors affecting stable transformation and plantregeneration during transforming embryogenic callus of Upland cotton(Gossypium hirsutumL.)via Agrobacterium tumefaciens，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，81：229-237，2005)，具体方法和流程如下：

1、无菌苗的培养

将将棉花品系YZ-1(参见：Jin等的文献(Identification ofa novel elite genotype for invitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum，2006，50：519-524)棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌10min，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基上(配方如下：1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+植物胶phytagel(购自sigma公司，美国)2.5g/L)，在28℃暗培养3-6天。

2.农杆菌的活化和保存

2.1准备：

农杆菌GV3101，制备含卡那霉素50mg/L的MGL液体培养基(配方：胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1g/L，KH₂PO₄0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，调pH至7.0)，无菌三角瓶，LB(固、液)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5mL离心管。

2.2操作：

2.2.1活化，悬浮：

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5℃暗培养36-48h，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27℃、200rpm摇2h，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。

2.2.2菌株的保存：

从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm，26℃摇48h，按菌液和甘油体积比为1∶1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。

3.浸染，共培养：

3.1准备：

暗培养5天左右幼嫩健壮的YZ-1幼苗，经活化的农杆菌，无菌培养皿和无菌滤纸等。

3.2操作：

无菌条件下将YZ-1幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-1cm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中，搅匀，静置5-10min，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5min使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基中(配方：MS无机盐+B₅有机物+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH 7.0)，20℃暗培养38-42h。

4.愈伤组织的诱导

将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上(配方如下：MS无机盐+B₅有机物+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH 5.8)。

5、非胚性愈伤组织的增殖

非胚性愈伤组织的增殖培养基如下所示：MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B₅有机物+2，4-D 0.05mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g//L，pH 5.8。

6、愈伤组织的分化

愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上(配方：MS基本培养基+B₅有机物+激动素(KT)0.15mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，调pH至5.8)，进一步分化成胚状体。

7、胚性愈伤组织的继代

胚性愈伤组织的继代培养基如下所示：

MS无机盐(其中硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B₅有机物+KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/L+天冬酰胺(Asn)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel 2.5g/L，pH5.8。

8、成苗生根培养

将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上(配方：1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖15g/L+phytagel 2.5g/L，pH 5.8)。

9、炼苗移栽

将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田。

转化拟南芥采用的受体材料为Col野生型，农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照(Zhang等，Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana using the floral dip method.Nature Protocols，2006.1：641-646)。

附：MS培养基母液配制：

1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解再逐一加到容量瓶中(最后加入CaCl₂否则容易产生沉淀)，定容到一升。

2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温(20-25℃，以下相同)下10h以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。

3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解，然后混合，放置于室温下10h以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。

4.各种生长激素一般可以用1mol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。

5.配制B₅有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染

6.各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。

大量元素(20倍)母液(g/L)

KNO3                               38；

NH3NO3                             33；

MgSO4·7H2O(无水MgSO4)             7.4(3.8)；

KH2PO4                             3.4；

CaCl2·2H2O(无水CaCl2)             8.8(6.6)。

微量元素(100倍)母液(g/L)

CoCl2·6H2O                        0.0025；

CuSO4·5H2O                        0.0025；

H3BO3                              0.62；

KI                                 0.083；

MnSO4·4H2O                        2.23；

NaMO4·2H2O                        0.025；

ZnSO4·7H2O                        0.86。

铁盐(100倍)母液(g/I)

FeSO₄·7H₂O                        2.78；

Na2EDTA                            3.73。

B₅有机物

VB1(硫胺素)                        10mg/L；

VB5(盐酸吡哆醇)                    1mg/L；

VB6(烟酸)                          1mg/L；

肌醇                               100mg/L；

甘氨酸                             2mg/L。

实施例4：

p35s-GhCKI转基因株系相关分析

1、p35s-GhCKI转基因株系表达分析

GhCKI基因超量表达转基因棉花得到12个家系，转基因拟南芥得到16个家系。对转基因株系提取RNA，进行表达分析，方法同于实施例2，结果见(图7和9)。

2、p35s-GhCKI转基因株系表型分析

对表达量分析后，对不同表达水平的转基因株系开花当天的花药进行光学拍照观察，结果发现超量表达的转基因棉花和拟南芥开花当天花药不能正常开裂(见图6和8)。后对不同表达量的转基因拟南芥纯合系的花药进行光学显微观察，结果表明高量表达的家系有花药不开裂的表型，导致植株育性严重下降，而杂合时和中等表达量的家系的花药发育正常，育性正常。

3、p35s-GhCKI转基因株系拷贝数分析

对转基因拟南芥6个家系进行Southern blotting分析(DNA提取和Southern实验参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，实验结果表明6个家系有着不同的插入位点(见图10)。

SEQUENCE LISTING

<110>  华中农业大学

<120>  一种棉花酪蛋白激酶基因及其应用

<130>一种棉花酪蛋白激酶基因及其应用

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  1761

<212>  DNA

<213>  棉花（Gossypium hirsutum）

 

<220>

<221>  gene

<222>  (1)..(1761)

<223> 

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(1761)

<223> 

 

<400>  1

agttacttat ttgaagttga ttgatggaac cttgtgttgg taataagttt cgacttggtc        60

gtaagatcgg cagtggttct tttggagaga tctatctagg tacgaacatt cagaccaacg       120

aagaagttgc cattaagctt gaaaatgtga agacaaagca tccccagttg ttatacgaat       180

cgaagttata caggatcctg cagggaggaa ctgggattcc aaatttgaga tggtttggag       240

ttgagggaga ctataatgtc ctggttatag atctgcttgg acctagtctt gaagatctat       300

ttaatttctg cagtcggaaa ctctcattga agtcagttct aatgcttgca gatcaaatga       360

tcaaccgtgt tgaatttttt cattcaaaag cattcctaca tcgagatatt aagccagata       420

attttcttat gggcttggga aggcgtacga atcaggtata catcatcgac tatggtctag       480

ctaagaaata tagagacagt tcaacccatc agcacattcc atacagggaa aataagaatc       540

tgactggaac tgcaagatat gcaagcatga atacacactt gggcattgag caaagccgta       600

gggatgattt agagtctctt ggatttgtgc ttatgtactt cctaagagga agtcttcctt       660

ggcaaggcct gaaagctggc accaaaaaac agaaatacga gaaaattagt gagaagaaag       720

tttctacttc aattgaggcc ttatgtcgag gttatcctac agagtttgcc tcatacttcc       780

attattgccg ttcactaagg tttgatgata agccagacta tgcttatctt aaaagaatct       840

ttcgtgacct ctttattcgt gaaggcttcc agttcgatta tgtctttgat tggaccattt       900

tgaagtatca gcaatcacag ttgaccaatc ctccagctcg agcccttggc ctcggtgctg       960

gaacaagttc tcccctgcca cctgcaattg cgaatgctga cagacacaca gctgcagagg      1020

acacacgagc agctggtttg tcatccatgg attcttctcg gcggagagca tcaggaccct      1080

tgatgagttc tggaaattat gcaaagcaga agagtccagt tgcaaatgat cattttattg      1140

ggcagtcagg tggatcatct tcaagacaag ttggtgtttc tagcagtcgt gacgcatttg      1200

ctggtagcga tgttgaccca caacgttctc gtacagccta cgctagcccc ggagcactgc      1260

aaaagaattc aagtcgacaa agaagtccca ttgattctgc cgaccctaag cggtcaatat      1320

ctgcaagaaa caccagtcat gtcaagaact atgaagcggc cctcaaagga atcgagggcc      1380

tgcaatttga aggcgacgag agaattcact attaaacgct tggatataca aaatttgttg      1440

taaaaccgta aaaatggttg atgtactaat acattttcca acagagtatt tggggaaggt      1500

ccgagttatc gaaggaattt gcaacttgga gctgttcttg atttggacta gtggggtggg      1560

caagtgcaca cctgaaaagc ataaaatttg tgatccactt ggatgatgga aagctttgtg      1620

aagtaaacaa acattttgag tgcttaaaat ttgaatggtg ttgggctgtc aaagttttta      1680

acagtgtttg tgttatagca ttggcatgta ttatttttgt tgtttttaat taaatggtat      1740

tgctttcctg tttttaaaga t                                                1761

 

<210>  2

<211>  1392

<212>  DNA

<213>  棉花（Gossypium hirsutum）

 

<220>

<221>  gene

<222>  (1)..(1392)

<223> 

 

<220>

<221>  ORF

<222>  (1)..(1392)

<223> 

 

<400>  2

atggaacctt gtgttggtaa taagtttcga cttggtcgta agatcggcag tggttctttt        60

ggagagatct atctaggtac gaacattcag accaacgaag aagttgccat taagcttgaa       120

aatgtgaaga caaagcatcc ccagttgtta tacgaatcga agttatacag gatcctgcag       180

ggaggaactg ggattccaaa tttgagatgg tttggagttg agggagacta taatgtcctg       240

gttatagatc tgcttggacc tagtcttgaa gatctattta atttctgcag tcggaaactc       300

tcattgaagt cagttctaat gcttgcagat caaatgatca accgtgttga attttttcat       360

tcaaaagcat tcctacatcg agatattaag ccagataatt ttcttatggg cttgggaagg       420

cgtacgaatc aggtatacat catcgactat ggtctagcta agaaatatag agacagttca       480

acccatcagc acattccata cagggaaaat aagaatctga ctggaactgc aagatatgca       540

agcatgaata cacacttggg cattgagcaa agccgtaggg atgatttaga gtctcttgga       600

tttgtgctta tgtacttcct aagaggaagt cttccttggc aaggcctgaa agctggcacc       660

aaaaaacaga aatacgagaa aattagtgag aagaaagttt ctacttcaat tgaggcctta       720

tgtcgaggtt atcctacaga gtttgcctca tacttccatt attgccgttc actaaggttt       780

gatgataagc cagactatgc ttatcttaaa agaatctttc gtgacctctt tattcgtgaa       840

ggcttccagt tcgattatgt ctttgattgg accattttga agtatcagca atcacagttg       900

accaatcctc cagctcgagc ccttggcctc ggtgctggaa caagttctcc cctgccacct       960

gcaattgcga atgctgacag acacacagct gcagaggaca cacgagcagc tggtttgtca      1020

tccatggatt cttctcggcg gagagcatca ggacccttga tgagttctgg aaattatgca      1080

aagcagaaga gtccagttgc aaatgatcat tttattgggc agtcaggtgg atcatcttca      1140

agacaagttg gtgtttctag cagtcgtgac gcatttgctg gtagcgatgt tgacccacaa      1200

cgttctcgta cagcctacgc tagccccgga gcactgcaaa agaattcaag tcgacaaaga      1260

agtcccattg attctgccga ccctaagcgg tcaatatctg caagaaacac cagtcatgtc      1320

aagaactatg aagcggccct caaaggaatc gagggcctgc aatttgaagg cgacgagaga      1380

attcactatt aa                                                          1392      

 

<210>  3

<211>  463

<212>  PRT

<213>  棉花（Gossypium hirsutum）

 

<400>  3

MEPCVGNKFR LGRKIGSGSF GEIYLGTNIQ TNEEVAIKLE NVKTKHPQLL YESKLYRILQ        60

GGTGIPNLRW FGVEGDYNVL VIDLLGPSLE DLFNFCSRKL SLKSVLMLAD QMINRVEFFH       120

SKAFLHRDIK PDNFLMGLGR RTNQVYIIDY GLAKKYRDSS THQHIPYREN KNLTGTARYA       180

SMNTHLGIEQ SRRDDLESLG FVLMYFLRGS LPWQGLKAGT KKQKYEKISE KKVSTSIEAL       240

CRGYPTEFAS YFHYCRSLRF DDKPDYAYLK RIFRDLFIRE GFQFDYVFDW TILKYQQSQL       300

TNPPARALGL GAGTSSPLPP AIANADRHTA AEDTRAAGLS SMDSSRRRAS GPLMSSGNYA       360

KQKSPVANDH FIGQSGGSSS RQVGVSSSRD AFAGSDVDPQ RSRTAYASPG ALQKNSSRQR       420

SPIDSADPKR SISARNTSHV KNYEAALKGI EGLQFEGDER IHY                         463

 

Claims (6)

1.一种分离的基因的cDNA，其序列为SEQ ID No．1 所示的核苷酸序列。

2.一种分离的基因的ORF，其序列为SEQ ID No．2 所示的核苷酸序列。

3.一种分离的蛋白质，其序列为与SEQ ID No．3所示的氨基酸序列。

4.一种过量表达载体p35s-GhCKI，其特征在于：含有任选权利要求1或2所述的其中之一核苷酸片段的表达载体。

5.根据权利要求4所述的一种棉花酪蛋白激酶基因，其特征在于：所述的表达载体为植物表达载体pCAMBIA2300S。

6.权利要求1或2所述的一种棉花酪蛋白激酶基因在控制棉花花药发育中的应用。

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