CN101701038A - 植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低温生长相关的由序列1衍生的蛋白质。将该蛋白导入植物后，可以使植物由低温敏感变为低温不敏感，所以可以将其应用于植物遗传改良等工作，提高植物(如水稻)对低温的耐受力。如可将该基因导入不耐低温的品种中以提高其耐低温能力，从而用于长江中下游地区早稻和我国北方地区水稻育种。

Description

植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物是一个非常脆弱的有机体，很容易受到周围环境的影响，其中温度是影响植物生长发育的最重要因素之一。植物遇到低温冷害会影响到其生长发育的方方面面，包括不能正常发芽、生长缓慢、育性低甚至不结实等。其中有关低温影响发芽以及低温影响育性是近年来研究的热点并已有诸多文章报道。然而，对于低温影响植物生长发育进程的研究却报道甚少。

水稻(Oryza sativa L.)是我国最重要的粮食作物，年种植面积占粮食作物的近三分之一，总产占40％左右，对保障我国粮食安全具有极其重要地位。优良水稻品种的选育是确保我国粮食需求的一条重要途径，然而，由于各个地区种植环境的差异，导致了一大批优良的水稻品种不能被广泛的推广，其中低温是影响优良水稻品种向北方推广的最重要限制因素之一。因此克隆控制低温生长的基因具有重要的理论意义与实用价值。水稻控制低温生长的基因大多是数量性状，其分离和克隆非常复杂，而染色体片段置换系(CSSL)或近等基因系(NIL)是研究水稻数量性状的理想材料。目前，利用近等基因系策略，水稻中已报道一个低温影响发芽的基因，但是有关控制低温生长基因的分离和克隆还未见报道。

所有CKI蛋白都具有以下类似的结构，NH₂一端含有短的具有9-76个氨基酸残基的NH₂-末端区，一个高度保守、具催化功能并在底物识别中有重要作用的约300AA的激酶区，和序列高度可变(13-200AA)且同源性很低的COON-端延伸区。CKI蛋白的COON-末端区具有几方面的功能，包括决定底物识别的特异性、调节催化活力和/或决定激酶的亚细胞定位及与不同的效应因子相互作用。liu等从水稻cDNA文库中筛选克隆到OsCKI1，发现该基因在水稻根的发育以及植物激素响应两个方面起作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的植物低温生长相关蛋白(OsCKI1)，来源于稻属水稻(Oryzasativa)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低温生长相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由463个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的OsCKI1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsCKI1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsCKI1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述植物低温生长相关蛋白的基因(OsCKI1)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子。

序列表中的序列2由1392个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为将所述基因插入pGA1611质粒的多克隆位点得到的重组质粒。具体来说，所述重组表达载体可为将pGA1611质粒HindIII和SacI位点间的小片段取代为所述基因(OsCKI1)得到的重组质粒。

含有以上任一所述基因(OsCKI1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsCKI1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育温度不敏感转基因水稻的方法。

本发明提供的培育温度不敏感转基因水稻的方法，是将所述基因导入目的水稻(如细胞或组织)中，得到温度不敏感的转基因水稻。具体来说，可以将所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到温度不敏感的转基因水稻。所述目的水稻具体可为CSSL13水稻；所述温度不敏感具体体现在株高和/或生长速度和/或抽穗期时间性状上。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的植物低温生长相关蛋白是首次通过图位克隆的方法分离得到的，将该蛋白导入植物后，可以使植物由低温敏感变为低温不敏感，所以可以将其应用于植物遗传改良等工作，提高植物(如水稻)对低温的耐受力。如可将该基因导入不耐低温的品种中以提高其耐低温能力，从而用于长江中下游地区早稻和我国北方地区水稻育种。

附图说明

图1为LTG1的初步定位和精细定位；a：LTG1的初步定位；b：LTG1的精细定位；c：交换单株验证。

图2为LTG1在自然环境下的表型(左：Asominori；右：NIL(ltg1))；a：Asominori和NIL(ltg1)在南京自然条件下的生长变化曲线；b：Asominori和NIL(ltg1)在海南自然条件下的生长变化曲线；c：Asominori和NIL(ltg1)在南京自然条件下的抽穗期表型；d：Asominori和NIL(ltg1)在南京自然条件下的成熟时的表型；e：Asominori和NIL(ltg1)在海南自然条件下的抽穗期表型；f：Asominori和NIL(ltg1)在海南自然条件下的成熟时的表型。

图3为LTG1在不同环境下的抽穗期；E1：南京自然环境；E2：南京人工遮光环境；E3：海南温室环境；E4：海南自然环境。

图4为LTG1在人工气候室条件下的表型(左：Asominori；右：NIL(ltg1))；a：Asominori和NIL(ltg1)在高温(28-33度)条件下的苗期表型；b：Asominori和NIL(ltg1)在低温(20-25度)条件下的苗期表型；c：Asominori和NIL(ltg1)在高温和低温条件下的抽穗期。

图5为转OsCKI1基因植株的表型(左：转OsCKI1基因植株；右：转空载体对照植株)；a：播种后40天；b：播种后80天。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

CSSL13水稻：中国农业科学院作物科学研究所；Kubo T等，Development of aseries of indica chromosome segment substitution lines in japonicabackground of rice.Rice Genet Newsl，1999，16：104-106；网络链接为http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/rgn/vol16/v16p104.html。

实施例1、OsCKI1及其编码基因的发现

一、水稻控制低温生长基因的遗传分析和初步定位

从一套以Asominori为遗传背景携带IR24插入片段的染色体片段置换系(该置换系共66个家系)中发现一个家系CSSL13具有低温敏感表型，该家系在第二染色体长臂上携带IR24插入片段。CSSL13与背景亲本Asominori杂交其F1表现为Asominori表型，证实对低温敏感的表型是隐性表型。通过调查144个F2植株的分离比，我们发现有36个植株呈现出和CSSL13一样的表型(3∶1比例；x²≈2.68＜3.84；P＝0.05)，表明一对单隐性基因控制该低温敏感表型，将该基因命名为LTG1。随后利用该36个极端隐性单株进行初步定位，初步将该基因定位在第2染色体上，位于标记RM3762和RM263之间(如图1a所示)。

初步定位的方法如下：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4M NaCl，0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(BechmanInstrument Inc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂ free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O 5.1ul，共10ul。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、表型描述

根据初步定位的结果，进一步构建了近等基因系NIL(ltg1)，该近等基因系仅携带一个初步定位区间的片段。利用该近等基因系，描述LTG1的表型如下：在南京自然高温(25℃-39℃)长日照条件下，在成熟以前，NIL(ltg1)的株高只比Asominori稍矮一点，抽穗期无显著差异，成熟后NIL(ltg1)和Asominori的各种农艺性状无显著差异；在海南旱季自然低温(10-30℃)短日环境下，在成熟以前，NIL(ltg1)的株高比Asominori明显要矮并且到Asominori抽穗时株高差异达到最大，这样导致NIL(ltg1)的抽穗期比Asominori明显延迟，然而，成熟以后NIL(ltg1)和Asominori的各种农艺性状又无显著差异(见图2)。

为了避免日照长短对抽穗期的影响，随后设置了两个人工高温(25-45℃)短日环境，结果NIL(ltg1)和Asominori株高和抽穗期均无显著差异，这些结果暗示正是由于海南的自然低温才导致了NIL(ltg1)比Asominori生长速度迟缓，从而导致成熟以前株高变矮以及抽穗期延迟(见图3)。

为了进一步确定NIL(ltg1)比Asominori对低温更敏感，又设置了一个高温(28-33℃)和一个低温(20-25℃)两个人工气候室环境，结果证实了以上结果，即在高温条件下，NIL(ltg1)和Asominori无明显差异，而在低温条件下，NIL(ltg1)比Asominori生长要慢导致株高变矮，抽穗期延迟(见图4)。

二、水稻控制低温生长基因LTG1的精细定位

根据初步定位的结果，在LTG1基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记。用F_2:3群体中的极端隐性家系验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位LTG1基因。在Asominori与NIL(ltg1)杂交衍生的F_2:3群体中选取2213个极端隐性单株用于LTG1基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据，自行开发SSR、Indel、dCAPS等分子标记，具体方法如下：

1、SSR标记开发

根据McCouch等发表的水稻分子图谱和以及国际水稻基因组测序计划公布的微卫星数据库(International Rice Genome Sequencing Project，2005)，选择覆盖初步定位区间的SSR引物来筛选亲本IR24和Asominori之间的多态性。两亲本之间呈现显著多态的SSR标记用做进一步精细定位分析。

表2设计用于精细定位的分子标记

标记	引物	类型
			RM3762	5’TACCGTAAGGCGCTGGATT 3’；5’ACGAGGTCCCCCCTCTAAA 3’	SSR
RM13603	5’GTACATATACGGACCACTTCTGC 3’；5’GTTACGACCTAAATCTGCAACC 3’	SSR
			RM13606	5’CTTTACTTTGACTCGTCCTGTGG 3’；5’CTCACTGAATGTGAGTGAATGC 3’	SSR
RM13608	5’CAGCACGCAACGCAAATCAGC 3’；5’CAGTCACCTCAACACGCACACG 3’	SSR
			RM13617	5’ACCATATAGCGTGTATGCAACC 3’；5’TGCACACATGTACACAGTACACC 3’	SSR
RM13623	5’AGCGTGTGTCAAGAGCAAGACC 3’；5’GAGATGAAGAAGAATGCCCAAGC 3’	SSR
			RM13637	5’CTCAACTTGCACCACCAAACG 3’；5’GCCACTGTTTCCATCTCCTAG 3’	SSR
RM263	5’CCCAGGCTAGCTCATGAACC 3’；5’GCTACGTTTGAGCTACCACG 3’	SSR
			LG1	5’AGTTGACAATTGAGTATA 3’；5’TTAGTGATAAAACAACTC 3’	SSR
L264	5’ATCTAACGTGAATGAACTCGCAGCT 3’；5’CTTCTTCCTCGTCGTCAAGGTCTT 3’	SSR
			ind14	5’ACCCGTGTTACAGGAGAT 3’；5’TTAAGTGCCAAGTGTCAATA 3’	Indel
ind16	5’AGGCTTGCTGATTGTCCAT 3’；5’CGTTAATACCATCTCGTTT 3’	Indel
			ind18	5’CCACGGCGATCCACCTACCAT 3’；5’GCCGAACCCTAGTTCCTCTTTGC 3’	Indel
dcaps1	5’CGTATTGCCTCGCAAATGGCATCGTC3’；5’TGGTCCTCGTAACAATCATATACGCT3’	dCAPSSalI
			dcaps2	5’GGAGAGCACACAAAGCACAGAGATC 3’；5’AAGAAACATCCGTCTCATTATCC 3’	dCAPSBglII

2、InDel标记的开发

根据LTG1初定位的结果，从IRGSP(http://rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/index.html)下载界定区域已测序克隆的粳稻品种日本晴序列，利用powerblast软件将下载的日本晴序列与已公布的籼稻品种9311相应的序列进行同源比较，寻找重复次数有差异的或插入缺失4bp以上的序列，然后按10kb左右的距离，利用Primer 5.0软件设计扩增长度在200bp左右的引物进行合成。

3、dCAPS标记开发

dCAPS标记的开发与分析：对已确定的SNP位点，利用dCAPS Finder 2.0在线程序(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)，通过错配1到2个碱基设计5’端引物，引物长度约24-30个碱基，然后沿着3’端方向，在大约150-200bp左右的位置设计3’端引物。PCR扩增产物用合适的酶酶切后在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析。总共设计了8对有多态SSR、Indel和dCAPs标记(表2)

dCAPS标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂ free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O₄ 10ul，总体积20ul。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所调整)45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。

PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物酶切消化过夜后，用8％的非变性PAGE胶分离，银染。

根据F_2:3群体中极端隐性家系的分子数据和表型数据，将LTG1定位于标记dCAPS1和ind14之间约25.4kb，结果如图1所示。图1中，a为初步定位的结果，b为精细定位结果，横线下方数字表示各个标记与LTG1基因位点间的交换家系数，c为重组家系的表型和基因型。

三、植物控制低温生长相关蛋白(OsCKI1)及其编码基因的获得

根据定位的位点设计引物primer1和primer2。

primer1：5’-GTggatccATGGAGCATGTGATCGGG-3’(下划线所示的序列为BamHI酶识别位点)；primer2：5’-TTgagctcTTATTTCCTTCTGTCAGCACT-3’(下划线所示的序列为SacI酶识别位点)。

以primer1和primer2为引物，以Asominori(购自中国农业科学院种质资源库；购买得到，原始来源不清)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃7min。将PCR产物回收纯化。用限制性内切酶BamHI和SacI酶切PCR产物，然后连接入pMD18-T(购自大连宝生物有限公司)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自北京Tiangen公司)，挑选阳性克隆后，提质粒进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，编码463个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的序列1)。将序列1所示的蛋白命名为OsCKI1，将序列1所示的蛋白的编码基因命名OsCKI1，将含有OsCKI1的pMD18-T命名为pMD18-OsCKI1。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

将实施例1的步骤三构建的pMD18-OsCKI1用HindIII和SacI双酶切，回收含OsCKI1基因的片段，连接到经HindIII和SacI双酶切处理的pGA1611载体(uniprotNo：245199，网络链接为http://www.uniprot.org/taxonomy/245199；GENBANKACCESSION NO.AY373338.1)上，得到重组表达载体。

将重组表达载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。提取质粒进行酶切和测序检测，检测结果表明，获得了含有OsCKI1基因的重组质粒，将其命名为pGA1611-OsCKI1(骨架载体为pGA1611，在HindIII和SacI位点间插入了序列2所示的OsCKI1基因)。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pGA1611-OsCKI1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国INVITROGEN公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。

PCR鉴定用引物：

primer3：5’-ATGGAGCATGTGATCGGG-3’；

primer4  5’-TTATTTCCTTCTGTCAGCACT3’；

扩增产物为1.4kb左右即为鉴定阳性。

将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pGA1611-OsCKI1。

三、转基因植物的获得

(1)28℃培养EH-pGA1611-OsCKI1 16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L卡那霉素的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的CSSL13水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司)的N6固体筛选培养基上进行第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上进行第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素的分化培养基上分化。

得到分化成苗的T₀代阳性植株。

用电击法将pGA1611转化农杆菌EHA105菌株，得到对照菌株，用对照菌株转化CSSL13水稻，得到转空载体对照植株，方法同上。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR分子鉴定

将步骤三获得的T₀代阳性植株的种子在海南种植。在苗2叶1心期提取总DNA，以primer3和primer4为引物对进行PCR扩增(primer3：5’-ATGGAGCATGTGATCGGG-3’；primer4：5’-TTATTTCCTTCTGTCAGCACT-3’)。

PCR反应体系：模板DNA(20ng/ul)2ul，Primer3(10pmol/ul)2ul，Primer4(10pmol/ul)2ul，10×Buffer(MgCl₂ free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq酶(5u/ul)0.4ul，ddH₂O₄ 10ul，总体积20ul。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1％的琼脂糖胶分离，结果表明获得15个PCR检测阳性的转OsCKI1基因植株株系。

2、低温环境中的表型鉴定

12月5日，将T₀代转OsCKI1基因植株的种子、Asominori种子、CSSL13水稻种子和T₀代转空载体对照植株的种子在海南种植(每个株系50棵)(整个生长期的温度为10-30℃)，整个生长期中观察表型，自播种起，第40天和第85天拍照。

播种后40天和85天的株高及从播种至抽穗所需的时间的统计结果见表3。其中一个转OsCKI1基因植株和转空载体对照植株的的表型见图5。

表3播种后40天和80天的株高及从播种至抽穗所需的时间(50棵的平均值)

	转OsCKI1基因植株	Asominori	CSSL13	转空载体对照
					播种后40天株高	35.12cm	34.23cm	27.12cm	26.81cm
播种后85天株高	82.3cm	81.5cm	64.4cm	63.3cm
					从种植种子至抽穗的时间	82.5天	81.8天	98.7天	99.2天

3、高温环境中的表型鉴定

播种期，将T₀代转OsCKI1基因植株的种子、Asominori种子、CSSL13水稻种子和T₀代转空载体对照植株的种子在南京种植(每个株系50棵)(整个生长期的温度为25-39℃)，整个生长期中观察表型。播种后40天和90天的株高及从播种至抽穗所需的时间的统计结果见表4。

表4播种后40天和90天的株高及从播种至抽穗所需的时间(50棵的平均值)

	转OsCKI1基因植株	Asominori	CSSL13	转空载体对照
					播种后40天株高	36.93cm	36.15cm	36.59cm	37.18cm
播种后95天株高	79.10cm	78.15cm	79.13cm	79.34cm
					从种植种子至抽穗的时间	89.3天	91.2天	89.5天	90.6天

结果表明，所有转OsCKI1基因植株的表型均为低温不敏感，与Asominori的表型相同；CSSL13水稻和T₀代转空载体对照植株的表型均为低温敏感。结果表明，转基因前的对低温敏感性状是由OsCKI1基因控制的，即该OsCKI1基因为控制低温生长相关基因。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARY926930

<160>2

<210>1

<211>463

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa)

<400>1

Met Glu His Val Ile Gly Gly Lys Phe Lys Leu Gly Arg Lys Ile Gly

1               5                   10                  15

Ser Gly Ser Phe Gly Glu Leu Tyr Leu Gly Val Asn Ile Gln Ser Ser

            20                  25                  30

Glu Glu Val Ala Ile Lys Leu Glu Ser Val Lys Ser Arg His Pro Gln

        35                  40                  45

Leu His Tyr Glu Ser Lys Leu Tyr Met Leu Leu Gln Gly Gly Thr Gly

    50                  55                  60

Ile Pro His Leu Lys Trp Phe Gly Val Glu Gly Glu Tyr Asn Val Met

65                  70                  75                  80

Val Ile Asp Leu Leu Gly Pro Ser Leu Glu Asp Leu Phe Asn Tyr Cys

                85                  90                  95

Asn Arg Lys Phe Ser Leu Lys Thr Val Leu Met Leu Ala Asp Gln Met

            100                 105                 110

Ile Asn Arg Val Glu Tyr Met His Thr Arg Gly Phe Leu His Arg Asp

        115                 120                 125

Ile Lys Pro Asp Asn Phe Leu Met Gly Leu Gly Arg Lys Ala Ser Gln

    130                 135                 140

Val Tyr Val Ile Asp Tyr Gly Leu Ala Lys Lys Tyr Arg Asp Leu Gln

145                 150                 155                 160

Thr His Lys His Ile Pro Tyr Arg Glu Asn Lys Asn Leu Thr Gly Thr

                165                 170                 175

Ala Arg Tyr Ala Ser Val Asn Thr His Leu Gly Val Glu Gln Ser Arg

            180                 185                 190

Arg Asp Asp Leu Glu Ser Leu Gly Tyr Val Leu Met Tyr Phe Leu Arg

        195                 200                 205

Gly Ser Leu Pro Trp Gln Gly Leu Lys Ala Gly Thr Lys Lys Gln Lys

    210                 215                 220

Tyr Asp Lys Ile Ser Glu Lys Lys Met Leu Thr Pro Val Glu Val Leu

225                 230                 235                 240

Cys Lys Ser Tyr Pro Thr Glu Phe Ile Ser Tyr Phe His Tyr Cys Arg

                245                 250                 255

Ser Leu Arg Phe Glu Asp Lys Pro Asp Tyr Ser Tyr Leu Lys Arg Leu

            260                 265                 270

Phe Arg Asp Leu Phe Ile Arg Glu Gly Tyr Gln Leu Asp Tyr Ile Phe

        275                 280                 285

Asp Trp Thr Lys Gln Gly Ser Glu Ser Asn Arg Leu Arg Ser Ser Gly

    290                 295                 300

Arg Thr Ser Gly Leu Val Gly Pro Ser Ala Glu Arg Thr Glu Arg Ala

305                 310                 315                 320

Ala Ala Arg Gln Asp Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr Val Asp Pro

                325                 330                 335

Phe Ala Arg Arg Thr Gly Ser Gly Ser Gly His Tyr Gly Glu His Thr

            340                 345                 350

Lys His Arg Asn Ile Leu Asp Ser Leu Leu Ala Pro Lys Thr Ala Val

        355                 360                 365

Asp Leu Asp Lys Arg Arg Pro Thr Ser Ser Ser Arg Asn Gly Ser Thr

    370                 375                 380

Ser Arg Lys Ala Leu Leu Ser Ser Ser Arg Pro Ser Ser Gly Asp Pro

385                 390                 395                 400

Ile Asp Pro Asn Arg Ser Asn Leu Ile Pro Thr Ser Ser Gly Ser Ser

                405                 410                 415

Arg Pro Ser Thr Met Gln Arg Leu His Gln Ser Thr Gly Leu Glu Thr

            420                 425                 430

Arg Ser Ser Leu Thr Lys Thr Ala Arg Asn Val His Asp Asp Pro Thr

        435                 440                 445

Leu Arg Thr Phe Glu Arg Leu Ser Ile Ser Ala Asp Arg Arg Lys

    450                 455                 460

<210>2

<211>1392

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa)

<400>2

atggagcatg tgatcggggg gaagtttaag ctggggagga agattgggag cggatctttt     60

ggggagctat accttggtgt gaatatacag agcagcgagg aggtagccat caagttggaa    120

tctgtaaaat caaggcatcc tcagcttcat tatgagtcaa aactatacat gcttctgcag    180

gggggaactg gaattcctca tctgaagtgg tttggagtgg agggggagta caatgtcatg    240

gttatcgatc ttcttggtcc aagtttagag gacttattca actactgcaa cagaaagttt    300

tctcttaaaa cagtacttat gcttgctgat cagatgatca acagggtaga gtacatgcac    360

actagggggt ttctacatcg tgatatcaag ccagacaact tccttatggg tttaggccgc    420

aaagcaagcc aggtttatgt catcgactat ggtcttgcaa agaaataccg ggacctccaa    480

actcataagc atatacctta cagggagaac aaaaatctca caggaacagc acgctatgct    540

agtgtaaaca cccatcttgg agtagaacaa agcaggagag atgatttaga gtctctgggc     600

tatgtgctta tgtatttctt aagaggaagc cttccttggc aaggtctaaa agctggcaca     660

aaaaaacaga aatatgacaa aattagtgaa aagaaaatgc ttactccagt tgaggttctc     720

tgtaaatctt atcccacaga gttcatttca tacttccatt actgtcgatc tttgcgattt     780

gaagataaac cagactacag ctatttgaag agacttttcc gagatctatt catccgtgaa     840

gggtaccagc ttgattatat atttgattgg acgaagcaag gttcagaaag taacagattg     900

cgatcaagtg gaaggacaag tgggttggtg ggaccatctg cagaacggac tgaacgagct     960

gcagcaagac aggatgttcc tgacagattc tctggtacag tcgatccatt tgctagaaga    1020

actggctctg gttctggcca ttacggagag cacacaaagc acagaaatat attggattca    1080

ttacttgcac ccaagacggc tgttgattta gataaaagaa ggcccacatc atcatctcgt    1140

aatgggagca catcaaggaa ggctctcttg tcaagcagca gaccaagttc tggagatccc    1200

attgatccga accgcagtaa cctaattcca accagcagtg gcagcagtcg cccatcaact    1260

atgcagaggc ttcaccagtc aacaggactt gagaccaggt cctcgcttac caaaactgca    1320

agaaatgtcc atgatgatcc cactttgagg acctttgaac gcctttcaat cagtgctgac    1380

agaaggaaat aa                                                        1392

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低温生长相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将权利要求2或3所述基因插入pGA1611质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。

7.一种培育温度不敏感转基因水稻的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的水稻中，得到与所述目的植物相比温度不敏感的转基因水稻。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的水稻中。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目的水稻为CSSL13水稻；所述温度不敏感体现在株高和/或生长速度和/或抽穗期时间性状上。

10.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或权利要求7至9中任一所述方法在水稻育种中的应用。

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