CN101704881B - 一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的植物雄性育性相关蛋白影响植物的减数分裂过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物雄性育性(花粉育性和小穗育性)降低，并影响其结实率，从而可以培育雄性减数分裂变异的转基因植物和植物雄性不育系转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入雄性不育植物中，可以培育雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物雄性不育基因是利用植物杂种优势的有效工具，具有重要的生产利用价值。20世纪70年代，由于天然野败雄性不育水稻的发现和利用，拉开了水稻杂种优势利用的序幕。中国杂交水稻作为第二次“绿色革命”的象征，一直处于世界领先地位并获得了巨大的经济效益和社会效益。因此，水稻育性问题长期以来受到人们的普遍关注。

水稻雄性不育突变体是研究花粉发育的优良材料，目前已克隆的几个水稻花粉育基因大部分来自于对雄性不育突变体的研究，这些突变体大部分表现为完全不育，

驱动蛋白是真核细胞中以微管为轨道拖动负载做持续运动的分子马达，能够依赖于微管水解ATP，将化学能转化成机械能，从而产生沿微管的定向运动，与此同时结合细胞器、囊泡或其它大分子(如质膜、染色体、RNA、蛋白质复合物、其它骨架纤维等)并将这些“货物”运送到细胞内特定部位。驱动蛋白参与了众多的细胞内生物学过程，包括细胞形态建成、细胞内各种有膜细胞器的运输、有丝分裂和减数分裂的进行、染色体的分离、mRNA的定位以及信号转导等过程。通过生物信息学分析，发现在水稻品种日本晴基因组中有多达45个驱动蛋白，而9311中则有46个，但到目前为止只有极个别驱动蛋白的基因得到分离并对其生物学功能进行了研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的植物雄性育性相关蛋白(OsKinesin1)，来源于日本晴水稻(Oryzasativa L.japonica.cv)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由477个氨基酸残基组成，自氨基末端第1至338位为驱动蛋白马达结构域。

为了使(a)中的OsKinesin1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsKinesin1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsKinesin1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述植物雄性育性相关蛋白的基因(OsKinesin1)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。

序列表中的序列2由1434个核苷酸组成。序列表中的序列3由10354个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pGD625载体的重组位点attB1和attB2之间插入所述基因(OsKinesin1)得到的重组质粒。

所述重组表达载体具体可为pGD625-OsKinesin1；所述pGD625-OsKinesin1是将pENTR207-OsKinesin1中的所述基因(OsKinesin1)通过LR重组克隆入pGD625载体的重组位点attB1和attB2之间得到的；所述pENTR207-OsKinesin1是将所述基因(OsKinesin1)通过BP重组克隆入pDONR-207载体的重组位点attL1和attL2之间得到的。

含有以上任一所述基因(OsKinesin1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsKinesin1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育雄性可育转基因植物的方法。

本发明提供的培育雄性可育转基因植物的方法，是将所述基因导入雄性不育植物中，得到雄性可育的转基因植物；所述雄性不育植物为花粉育性低于50％的植物；所述雄性可育的转基因植物为花粉育性高于90％的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入雄性不育植物中；所述雄性不育植物可为w207-2。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的植物雄性育性相关蛋白影响植物的减数分裂过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物雄性育性(花粉育性和小穗育性)降低，并影响其结实率，从而可以培育雄性减数分裂变异的转基因植物和植物雄性不育系转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入雄性不育植物中，可以培育雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为突变基因在第8染色体上的精细定位。

图2为野生型日本晴和突变体w207-2的花粉育性比较。

图3为野生型日本晴和突变体w207-2的小穗育性比较。

图4为野生型日本晴和突变体w207-2成熟花粉的扫描电镜和透射电镜分析。

图5为野生型日本晴和突变体w207-2花药开裂性的比较。

图6为野生型日本晴和突变体w207-2开花两小时后的柱头花粉数目比较。

图7为野生型日本晴和突变体w207-2雄性减数分裂染色体压片比较。

图8为转基因植株进行PCR分子检测结果。

图9为转pGD625-OsKinesin1的T0代植株的花粉育性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

双元Gateway^TM载体pGD625：中国农业科学院作物科学研究所；Antonio等，ASYMMETRIC LEAVES2-LIKE1 gene，a member of the AS2/LOB family，controlsproximal-distal patterning in Arabidopsis petals；Plant Molecular Biology(2005)57：559-575)。w207-2水稻：中国农业科学院作物科学研究所；Li，W.等，Fine mapping of pss1，a pollen semi-sterile gene in rice，Theoretical andApplied Genetics；2007，114：939-946。

实施例1、植物雄性育性相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻半不育突变体w207-2的育性分析及其遗传分析

在粳稻品种日本晴(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)的大田中发现的一株结实率较低(40％左右)的水稻植株，其自交后代出现了可育与半不育两种类型的分离，通过半不育株的连续自交，从中筛选出了半不育性稳定遗传的株系w207-2(w207-2水稻)。

与日本晴比较，w207-2的主要特征是：营养生长和花器官发育基本正常，自交结实率稳定在30％-40％之间(见图3)，花粉育性稳定在50％左右(见图2)。

用日本晴的花粉给w207-2进行了人工辅助授粉，w207-2小穗的育性能够显著提高，达到85％以上，显著地高于自交株40％左右的结实率，表明w207-2的雌配子是基本正常的，其半不育性主要是由雄配子引起的。

扫描和透射电镜观察见图4。图4中，A为成熟日本晴花粉的扫描电镜图像；B为图A中单个花粉粒的放大；C为日本晴花粉粒超薄切片的透射电镜观察；D为图C中花粉壁的高倍放大；E为成熟w207-2花粉的扫描电镜图像；F为图E中单个正常形状花粉粒的放大；G为w207-2正常形状花粉粒的超薄切片的透射电镜观察；H为图G中花粉壁的高倍放大；I为图E中单个异常形状花粉粒的放大；J为w207-2异常形状花粉粒的超薄切片的透射电镜观察；K为图J中花粉壁的高倍放大。图4的结果表明，突变体w207-2中不育的花粉瘦瘪，极度变形，花粉内含物空缺，无淀粉粒积累，花粉内壁缺失，外壁结构异常，覆盖层和基足层肥厚，基粒棒趋于解体。

另外，观察到w207-2的花药开裂性差(见图5)，造成花粉散出量减少，使散落在柱头上的花粉粒总数减少(见图6)，继而导致小穗育性降低。因此除了花粉半不育外，裂药性差也是造成结实率低的原因之一。

花粉母细胞的减数分裂过程分析见图7。图7中，A、B、C、D、E、F、G、H为日本晴，I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T为w207-2；A、I为偶线期；B、J为粗线期；C、K为双线期；D、L为终变期；E为日本晴中期I正面观，可见12对染色体整齐的排列在赤道板上；F为日本晴中期I极面观，可见12对染色体，完全配对；G为后期I，染色体分向两极；H为日本晴四分体正常形成；M为w207-2中期I正面观，可见11对染色体整齐的排列在赤道板上，但有2条未配对染色单体游离在外，箭头示染色单体；N为w207-2中期I极面观，可见11对染色体，和2条未配对的染色单体，箭头示染色单体；O为w207-2后期I，可见落后的染色体，箭头所示；P为w207-2后期I，可见染色体桥，箭头所示；Q为w207-2末期I；R为w207-2中期II；S为w207-2后期II，可见落后的染色体，箭头所示；T为w207-2四分体时期形成微核，箭头所示。结果表明：w207-2的花药壁发育正常，绒毡层和中层能够正常解体；对w207-2的雄性减数分裂过程的观察则发现其减数分裂中存在大量的异常现象，主要表现为减数分裂中期I形成单价体，后期I有落后染色体和染色体桥的形成，后期II也能观察到落后染色体，四分体时期形成微核。

用突变体w207-2与其野生型日本晴杂交，得到w207-2/日本晴的F₂群体进行遗传分析，对F₂群体中291个单株的遗传分析表明，w207-2的半不育性受1对隐性核基因控制。

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

用突变体w207-2与广亲和品种Dular(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)杂交，在w207-2/Dular的F₂分离群体中随机选取花粉半不育单株20株及可育单株20株，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成1个半不育混合基因组池和1个可育混合基因组池。用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对半不育池和可育池及w207-2和Dular进行多态性分析，将花粉半不育基因pss1(pollensemi-sterility 1)定位在第8染色体上标记RS41和RM6356之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4M NaCl，0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(BechmanInstrument Inc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂ free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O 5.1ul，共10ul。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记。用F₂群体中的半不育单株验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体基因。从w207-2/Dular衍生的9600株F₂分离群体中挑出确认为半不育的单株2100株(F₂群体中的突变株表型的水稻植株)用于突变基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、CAPS、dCAPS分子标记对突变基因进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变基因，具体方法如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5)：808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在w207-2和Dular之间的多态性，表现多态者用作精细定位pss1基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。

表2用于精细定位的分子标记

标记	正向引物	反向引物	所在克隆	类型
					RS15	5’-TAGAACTACCACCGCAAGG-3’	5’-AAGCAGCAACCAAAACACT-3’	P0007D08	SSR
RS22	5’-AGTTCTTCGCCCAGTG-3’	5’-TGCTCCTAGTCGTCCC-3’	P0498H04	SSR
					RS24	5’-AGGACGCTTGAAGAGGAAA-3’	5’-ATGACAGGCTGGGTGAGTG-3’	P0498H04	SSR
RS41	5’-GAGGACCTGAACCTGTCTAAAT-3’	5’-TGCCATGATGATAACGTGAAT-3’	P0470F10	SSR
					RS43	5’-ACCATGTCGGTCTTAT-3’	5’-TACACCAGGAGCAAAT-3’	P0470F10	SSR
RS413	5’-CGCTTATGTGGCAGTA-3’	5’-AAAGGCAAAGAGGAGA-3’	P0470F10	SSR
					RS73	5’-AAAAAGCAGAGGAGGAGAT-3’	5’-CCACACAAGACTGAAATTG-3’	OSJNBa0073J19	SSR
L1(Bcl I)	5’-CTTGATTGATCTCGCAGAGTTCGTTGAT-3’	5’-ACCAGGGTGGCGATCTTCTCAGACT-3’	P0470F10	dCAPS
					L2(Sca I)	AAGCCAATGCAGTAACTATAACC	CTTTAGCAGCGAGATGTCCAA	P0470F10	CAPS
L3(Dra I)	AAGAACTAAGAAAGGAAATCAC	ATATATCAGAATCAACAAGTTTAA	P0470F10	dCAPS

(2)CAPS、dCAPS标记开发

CAPS(dCAPS)引物设计：对Dular在pss1基因所在位置附近的部分区段进行测序，并与日本晴相对应的序列进行比对，发现两者之间存在的SNPs，以这些SNPs为基础用SNP2CAPS软件设计CAPS标记，如没有合适的酶切位点则通过“dCAPSFinder 2.0”软件设计错配的PCR引物创造酶切位点，同时运用Primer Premier 5.0软件设计对应的另一条引物。

CAPS/dCAPS标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所调整)45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。

PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物酶切消化过夜后，用1-4％的琼脂糖凝胶中电泳分离，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。dCAPS用8％的非变性PAGE胶分离，银染。

根据F₂群体中抽穗期单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法计算基因位点与标记位点之间的重组率c，即c＝(N₁+N₂/2)/N，其中N表示被调查半不育个体总数，N₁表示出现显性基因携带亲本纯合带型的单株个体数，N₂表示出现两亲本杂合带型的单株个体数。最终把pss1基因精细定位在标记L2和L3之间，pss1基因距标记L2和L3的遗传距离均为0.02cM；这两个标记位于同一PAC克隆P0470F10上，物理距离约为28kb(图1)。

(3)突变基因的获得

根据定位的位点设计引物，序列如下所述：

primer1(下划线所示的序列为attB1重组位点)：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCTTCCCTGGTCACTACCCGAATCACT-3’；

primer2(下划线所示的序列为attB2重组位点)：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTGCTCCTCCTCCTCATCCTCCTCAT-3’。

以primer1和primer2为引物，以日本晴的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。该对引物位于序列2上游5.2kb和下游1.7kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后经过一次BP重组克隆到载体pDONR-207(购自美国Invitrogen公司)中构建成一个Gateway^TM入门载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中序列3所示的核苷酸序列，编码477个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的序列1)。将序列1所示的蛋白命名为OsKinesin1(即为基因定位中所述的pss1基因)，将序列1所示的蛋白的编码基因命名OsKinesin1。OsKinesin1的编码序列如序列表的序列2所示。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以日本晴(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库；购买途径获得，原始来源不清)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsKinesin1基因，PCR引物序列如下：

primer1(下划线所示的序列为attB1重组位点)：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCTTCCCTGGTCACTACCCGAATCACT-3’；

primer2(下划线所示的序列为attB2重组位点)：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTGCTCCTCCTCCTCATCCTCCTCAT-3’。

上述引物位于OsKinesin1基因的上游5.2kb和下游1.7kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分，将PCR产物回收纯化。采用BP重组试剂盒(美国Invitrogen公司)将PCR产物克隆到载体pDONR-207(购自Invitrogen)中，构建成一个Gateway^TM入门载体。

BP重组反应体系(5.0μL)：PCR产物2.7μL(50-100ng)，pDONR207  1.0μL(30-50ng)，5×BPreaction buffer 1.0μL，BP enzyme mix 0.3μL。短暂离心后将混合体系25℃水浴4h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L庆大霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有序列3所示基因的重组表达载体，将含有OsKinesin1的pDONR-207命名为pENTR207-OsKinesin1，OsKinesin1基因插入在重组位点attL1和attL2之间，转录方向为从attL1至attL2。

采用LR重组试剂盒(美国Invitrogen公司)将pENTR207-OsKinesin1中的OsKinesin1重组到双元Gateway^TM载体pGD625上。LR重组反应体系(2.5μL)：pENTR207-OsKinesin1  1μL(50-100ng)，pGD625  1μL(50-100ng)，LR enzyme mix0.5μL。混匀后短暂离心，将混合体系25℃水浴4h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取阳性克隆，提取质粒用于酶切和测序检测。测序结果表明，得到了含有序列3所示基因的重组表达载体，将含有OsKinesin1的pGD625命名为pGD625-OsKinesin1，OsKinesin1基因插入在重组位点attB1和attB2之间，转录方向为从attB1至attB2。

将pENTR207与双元Gateway^TM载体pGD625进行LR重组，得到对照载体。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pGD625-OsKinesin1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pGD625-OsKinesin1。

用对照载体转化农杆菌EHA105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。

三、转基因植物的获得

分别将EH-pGD625-OsKinesin1和转空载体对照菌株转化水稻花粉半不育突变体w207-2(w207-2水稻)，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pGD625-OsKinesin1(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L卡那霉素的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的w207-2水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(Phyto TechnologyLaboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化。

得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

分别将T₀代转pGD625-OsKinesin1植株、T₀代转空载体对照植株、w207-2和日本晴种植在中国农业科学院试验网室内。

水稻植株即将开花时，取叶片，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用Primer3和Primer4为引物对进行扩增(Primer4：CTACAAATGCCATCATTGCG和Primer4：TAGAGGAAGGGTCTTGCGAA)。PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测。结果表明获得11株PCR检测阳性的植株。见图8，图8中泳道1为未转入OsKinesin1的突变体，泳道2-12为转化获得的11株转pGD625-OsKinesin1植株。

水稻植株即将开花时，每个单株取主茎穗上3朵部位一致的颖花，置于乙醇∶冰乙酸(体积比为3∶1)的溶液中，4℃冰箱保存。镜检时用1％I₂-KI染色，10×10倍显微镜观察，根据花粉染色及形态判断其育性，深染和不完全染色(形状为圆形但染色不完全)的为可育，浅染和形状不规则的为不育。每个颖花观察3个视野，观察花粉粒不少于300个，取其平均值代表该单株的花粉育性。在成熟期，每个单株取3个穗子，调查整穗的结实率，取其平均值代表该单株的小穗育性。

日本晴的花粉育性为98％，小穗育性为95％。11株转pGD625-OsKinesin1植株中，7株的花粉育性达到90％以上(图9)，对应的小穗育性达到85％以上，与日本晴的结实率相当。w207-2的花粉育性为52％，小穗育性为40％，表现为半不育。转空载体对照的花粉育性为50％，小穗育性为40％，仍然表现为半不育。验证了转基因前的雄性半不育性状是由OsKinesin1基因控制的，即该OsKinesin1基因为雄性育性相关基因。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARY92629

<160>3

<210>1

<211>477

<212>PRT

<213>日本晴水稻(Oryza sativa L.japonica.cv)

<400>1

Met Ser Asn Val Thr Val Cys Val Arg Phe Arg Pro Leu Ser His Lys

1               5                   10                  15

Glu Arg Lys Thr Asn Gly Asp Lys Val Cys Phe Lys Arg Leu Asp Ser

            20                  25                  30

Glu Ser Phe Val Phe Lys Asp Glu Arg Glu Glu Asp Val Ile Phe Ser

        35                  40                  45

Phe Asp Arg Val Phe Tyr Glu Asp Ala Glu Gln Ser Asp Val Tyr Asn

    50                  55                  60

Phe Leu Ala Val Pro Ile Val Ala Asp Ala Ile Ser Gly Ile Asn Gly

65                  70                  75                  80

Thr Ile Ile Thr Tyr Gly Gln Thr Gly Ala Gly Lys Thr Tyr Ser Met

                85                  90                  95

Glu Gly Pro Ser Ile Leu His Cys Asn Lys Gln Lys Thr Gly Leu Val

            100                 105                 110

Gln Arg Val Val Asp Glu Leu Phe Gln Ser Leu Gln Ser Ser Glu Ser

        115                 120                 125

Met Ala Met Trp Ser Val Lys Leu Ser Met Val Glu Ile Tyr Leu Glu

    130                 135                 140

Lys Val Arg Asp Leu Leu Asp Leu Ser Lys Asp Asn Leu Gln Ile Lys

145                 150                 155                 160

Glu Ser Lys Thr Gln Gly Ile Tyr Ile Ser Gly Ala Thr Glu Val Ser

                165                 170                 175

Ile Gln Asn Ser Ser Asp Ala Leu Glu Cys Leu Ser Glu Gly Ile Ala

            180                 185                 190

Asn Arg Ala Val Gly Glu Thr Gln Met Asn Leu Ala Ser Ser Arg Ser

        195                 200                 205

His Cys Leu Tyr Ile Phe Ser Val Gln Gln Gly Ser Thr Ser Asp Glu

    210                 215                 220

Arg Val Arg Gly Gly Lys Ile Ile Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu

225                 230                 235                 240

Lys Val Glu Lys Thr Gly Ala Glu Gly Arg Val Leu Asp Glu Ala Lys

                245                 250                 255

Thr Ile Asn Lys Ser Leu Ser Val Leu Gly Asn Val Val Asn Ala Leu

            260                 265                 270

Thr Thr Gly Lys Pro Asn His Val Pro Tyr Arg Asp Ser Lys Leu Thr

        275                 280                 285

Arg Ile Leu Gln Asp Ala Leu Gly Gly Asn Ser Arg Ala Ala Leu Leu

    290                 295                 300

Cys Cys Cys Ser Pro Ser Ala Ser Asn Ala Pro Glu Ser Leu Ser Thr

305                 310                 315                 320

Val Arg Phe Gly Thr Arg Thr Lys Leu Ile Lys Thr Thr Pro Lys Ser

                325                 330                 335

Ile Ser Pro Glu Val Asp Ser Ile Lys Lys Pro Ile Pro Asp Ser His

            340                 345                 350

Gly Gln Asn Asp Leu Arg Asp Arg Ile Leu Asn Lys Leu Arg Leu Ser

        355                 360                 365

Leu Lys Glu Glu Asp Val Asp Leu Leu Glu Glu Leu Phe Val Gln Glu

    370                 375                 380

Gly Ile Ile Phe Asp Pro Asn Tyr Ser Val Ala Asp Ile Asp Ser Ala

385                 390                 395                 400

Cys Gln Asp Ala Ala Ser Gln Glu Val Ser Leu Leu Thr Gln Ala Val

                405                 410                 415

Glu Glu Leu Lys Glu Thr Val Glu Glu Leu Thr Asp Glu Asn Glu Arg

            420                 425                 430

Leu Arg Gly Glu Leu Glu Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala

        435                 440                 445

Ala Ala Arg Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Phe Val Pro Ala Val Ala

    450                 455                 460

Ile Ser Ser Leu Leu Arg Pro Phe Gly Phe Val Pro Asp

465                 470                 475

<210>2

<211>1434

<212>DNA

<213>日本晴水稻(Oryza sativa L.japonica.cv)

<400>2

atgtccaacg tgactgtatg tgtgcgattc agaccactga gccacaaaga gaggaagact     60

aatggtgaca aggtctgctt caagagattg gattcagaat cttttgtttt caaggatgag    120

agggaagaag atgtcatatt cagctttgac agggtgtttt atgaagatgc agaacagtct    180

gatgtctata acttccttgc agtgccaatt gtcgcagatg ccatcagtgg aataaatggg    240

actataatta cttatggtca gactggagca ggaaagacat acagcatgga ggggccgagc    300

atcttgcatt gcaataagca gaaaactgga ctagtccaga gagttgtaga tgagcttttt    360

caatctctac aatcatcaga aagcatggct atgtggagtg tgaaattgtc gatggtggag    420

atatatttgg aaaaagtaag ggatcttctt gacttgtcca aggacaacct acaaatcaaa    480

gagagtaaaa ctcaagggat ctacatttct ggagcaacag aagtatccat ccagaatagt    540

tcagatgcct tggagtgcct ttctgaagga attgccaaca gagctgttgg agaaacacaa    600

atgaacctgg ctagtagtag aagtcactgc ttatacattt tttcagttca acaaggatca    660

acttctgatg agagggtgag aggagggaag attattcttg ttgatttagc tggttcagag    720

aaggttgaga aaactggtgc tgaaggacga gttcttgatg aggcaaagac aatcaacaaa    780

tctctctcag ttctcgggaa tgttgtcaat gctctaacaa ctggtaaacc gaatcatgtg    840

ccttatcgtg actctaagct tacgcgcatt cttcaagatg cactgggtgg caactcaaga    900

gcggcattac tgtgctgttg ttcccccagt gcttcaaatg caccagaaag tttgtctact    960

gttcgtttcg gaacaaggac aaagctcata aagaccacac ccaaatcaat ctctcccgaa   1020

gtggatagca tcaagaagcc catccctgat tctcatggcc aaaatgatct gcgtgaccgg  1080

attctgaaca agttaaggtt gagcctgaag gaggaagatg tggaccttct ggaggaactg  1140

ttcgtgcagg aaggcatcat cttcgacccc aactactccg tggcagacat cgactcagcc  1200

tgccaagacg ccgcgagcca ggaggtctca ctgctcacac aagctgtgga ggaactgaaa  1260

gaaaccgtcg aagagctcac cgatgagaac gagaggttga ggggtgaact cgagctcgcg  1320

caggaggctg ccgccgccgc cgctgctgct cgggctgacg gcgcgctgct tggtttcgtg  1380

ccggcggtcg ccatcagctc cctcctccgc ccctttgggt tcgttccaga ctga        1434

<210>3

<211>10354

<212>DNA

<213>日本晴水稻(Oryza sativa L.japonica.cv)

<400>3

tgcttccctg gtcactaccc gaatcactcg gagataagcc ctggctccta gcttgcatgg   60

ttctagcagc agccaggcgc atctcgattt cagatattgt tctatccaaa gctctgcagc  120

gcaagtagta taagcaaacc taaacatcaa tctaaactaa ttctgactgc ataagcttca  180

gacattacat acatgatgac ttcccgagtt tgtgacactt ggttcattac agcccccgga  240

ttatccgaat tcacctggca aaatccgacc agacgacatt gtaccgcatc cacattaaca  300

cagcaattaa gagaaaaata atggatacaa catgataaat taccttggtt cggcaatcgg  360

gaagctcagg aaccgcccaa tatctgcaaa accaaccaga cgagcaaaaa atcaccattc  420

ccagcctcaa aaccgacgag cattgtctcg attcgtgtgg cgaggagaag agattgccta  480

gacagcaccg aagcgggtgc gggagcatgg agcaagagga gagcagcgga tttggggagc  540

ggacagcgaa ccaacctatt gacgacgcag acgccgagga agaagcaggc ggtgcagagc  600

gcggccacca gccgcgtggg cacccgcgcc agcggcgcct gcttgtgcgg cctcgccgcg  660

gccgccggcg cgaacatcgc cggccgccgc ctcctcctcc tcctctcgga ttcgtcgttc  720

gaatgagtgc gagatagcta tctctctctg tgccttggct tgcttgctgc aacgcactgg  780

ctgcctggct ctctcactgc tccgtggact cggtccatat agcccaccac ctgctgcttc  840

attttttttc ttttttgccc gttttgcaaa gtacaattcc attgtcctat ctgaaatgat  900

ttcaccggtt tttctccatg gttttcgcat tcgggaataa catgtggctc gatttttcag  960

ataaagtatt caatgctatg gttattgctt ttctagtact acaagtatta gataatatag 1020

gcgcacgtat ggtcatgccg ctaatcataa gtccgttaag aaacatataa aacgaatcaa 1080

atgcttaaat atatgaactt cagtgacctt ttcaatatgt ttttttaaag acacatgctt 1140

attatgatat taatattaat cgtgttctta gtatttaaaa aaagacattc ggaaccgtga    1200

caattggaac ataacagtat ctacagcgtg aatataaaat caattttacg gcaaaagaac    1260

cgagccatgc acgttgtagt tgtcgaaacg tagttgtcag agagcaaatt gaaccccaaa    1320

ttggagtcca acaaagggtg tagaaaaatt atttagatgt gcgtgaatgc atagaaggta    1380

gactagtgat tgattgattc ttttctgcga gtcccacaaa atgattttaa tgctactact    1440

attaaactaa aattttgttt agctcttcga ttagattggt cgaataaaac actacaaatg    1500

ccctaaattg agcttaggtt ataagatggc gtatttaaac gaacttaagt agtacaaaat    1560

ttgatttaaa ctcaataaat tcaagatatc acctttgcca ccgagttgag aatcacacat    1620

gttgctactg ctatcaattt tgtcacacaa acattacttc tgtacaacgt actcctacaa    1680

acaagtgacg attcgtcgta gcgtcgtagt tgtactgttt ggcattggca gcatatttag    1740

tttgcttttt ccagcattat tcatccttac aagaaaagaa accaaaaaaa ccacatcagt    1800

tcagtactag tccgtactat attttcctgg tagtaggaaa gagaggtagc tggtggtgga    1860

ccaggtccac caacaatttc acagtacagg ccgtcccaac agacagcggc atttatcatc    1920

ctcaacgcct ggtacgccta gcacaaagcg cgcacgtcct ccggtgctcc tccctggacc    1980

cggcgcagca acgccgcaga gggcaccgac cacctcctcg gtccacgggt ccagggccgc    2040

ggcggtggtg gtggaccggt tcgccgtagc acggagccac gcggtccacc gctcttcttc    2100

ccctgtagtg agtgtagcgt agcctttttg gacagaaatt tctgggccca ctgtcattga    2160

tgtctgtctg ctagtgctgc ctctcatcaa aggctagctg gtctaatagt aacacctaaa    2220

ctggtttttc tagcttctac tcatttttta ttaaaataac taagcttagt ctcgctatac    2280

tttataataa acaaaataac aaattaagct ttcataaaat tagacaaaaa aaatatagta    2340

tatgacatat aggtcagatg gctataggtt acgcaaagta gaattatagc atatgaatca    2400

aaacattgtc tattaaaact atgacttgtc taaggttagt acttagtata gcaaatttag    2460

ttgccaacca aataggtcct aagtttattt tgtggcattc gtgtggtttc tccgcatgca    2520

cgtttcccga attgttaaac aatatgtttt tcaaaaaaaa aagaaaaata tttttttaaa    2580

aaaacatatt aatctatttt taaatttaaa ataattagta cttaattaat catgagctaa    2640

tggcacatct cgttttttat atcttctcac tctgatacgc aaaaacgagg tgagctatta    2700

ggcgccgtag ccccaaatgt gaactgcaat cttgattgtt taggaagtta aaattgtaag    2760

aaggtggagt agtcagaagc tcctaaacag ggctttaagt cctttcttct tctttttttc    2820

aacaatctat gattatttgt gttttaaggc tatgtgatta gtaatctatt catttcatac    2880

catataaaac attttgggtt ttaaataaat tcattcatag atcaatgcat atgcttcata    2940

tatatgtatc tagataaata atgaagatat caaaacgttt tataatgtga aacaaaggga    3000

gtagcatgtt tattttagct aaaataaagg ttacttttct tgtgtaagca caaacgatgg    3060

ttggtgtgca cattagtggt catcatttct tgtttagcag tttgattatt tctgtgctga    3120

gcttatgcgt tgcattgcac atttgcacat ggagcatgtg atggcgtgaa gtactagcat    3180

gattgggggt aatcatcggc aaaccattgt tcaatttaaa gaacgagcca actaagtagg    3240

ttgaaagtaa tgaaatacta aacatttcaa ctgctcggaa tgtggttaac agtacaactg    3300

tacaaggtgt aataatgcca aaagttactc attaaaatca atatctggtt tgctccatcc    3360

tggaccacct atatatttat caataaattt tcttcaaaag ttgatagata caaatatatt    3420

ataatcatag tgtaattata tttgtaactt gcatgtaact gctatataat ttatatgcaa    3480

ttttcacaaa atttattggt aacatgttat ttttatgaaa caaaagtcat ggaactgaat    3540

cccctcacgt gctctttgct ccaagctttt tgggctcatt ttcccacata tcaaaatggg    3600

cctttttagg aagtctaatg ggccttgaaa gcacctccag tgtactaaaa cctctagact    3660

ccatcgatcg gccacggaat aagttcactt gacgtccctc aatggtaata acatttaata    3720

aatgtgtatc ccttaactat ataaaaccgg aaaaaaaaaa tcctgagaaa gtatagatgt    3780

ttcgctaaca tgtcctccta gtcgcaaaac ataaagaaaa aaagtggtgt taacaatcct    3840

aggccttgtt tagttcctaa aacaaaaact tttcattcat cacatcgaat gttttgacac    3900

aagcatgcag tattaaatgt ggatgaaaaa accaattaca cagtttatgt ataaattatg    3960

agacaaatct tttaagcata attgcgccat gatttgacaa tatggtggta caataaacat    4020

ttactaataa cggattaatt agtcttaata aattcgtctc gataaattcg tctcgcagct    4080

tcctgcgcga aatatgtaat ttatttagtt attagactat gcttaatact tcaaatatgt    4140

attcgtatat tcgatgtgac aactaaaccc aaaagttttc cctaactaac gctgtgttta    4200

gttccgaaat atttcttcaa acttctaact tttccatcat atctaaactt ttctacacac    4260

ataaactttc aactttttca tcacatcgtt ccaatttcaa ccaaaccttc aattttggcg    4320

tggaataaac acagccaaca agcccctggt tagtaatctt cttctctcgt ttttcccttt    4380

gccgcagagc gagagcggca gcgggcagcg gcgcgcggcc ggaggcaggc ggagcggcgg    4440

cgtcggcagg ttgcgccgcg agcgcggcgg ccacttcccc attccttccc gtttcgccga    4500

cgagacgctc accggcgcac actcgccgcc tcccgccgcc gctcatcggt ccggtactcc    4560

tcagtcgtcg gaaagtaagt ataatggcgg ctgcatttcg cttcccccta gctgtttcca    4620

tcctgaattc ctgacgcctt tctatctccc ccgatcgatc gctcacttgg aaccctctca    4680

tgatggagct aatccgagct gagggaaatc gaggtttggg taggagcaca tggcggcgga    4740

gagggggaag ggtgatagat agcgttgtcc cccccccccc cccccccccc ccgggtcgct    4800

ggaatcagtt tgcaggattt tatctctttc ctcttaccga tggcgacgac cttggtcagt    4860

caccgtcgaa gtcgccttcg gccatggttg cctcaactca gtgcaggcat atgatcgatt    4920

ttgccaactt agtttggttg caagtcagcg atagttttag tccttttccc aagttaacac    4980

aagttggtga cagagtttta gcctatttgc aagttagcat caggtgtgct tgcatttctg    5040

aatgaaccag tgatatattt gatagaatta tgtaatttgt gttttatttg gttggccttg    5100

gccctatgca gttaacgttt tctcccatgc gaatttgcca cgtatttggt tggctggcag    5160

gatgtccaac gtgactgtat gtgtgcgatt cagaccactg agccacaaag agaggaagac    5220

taatggtgac aaggtctgct tcaagagatt ggattcagaa tcttttgttt tcaaggtttg    5280

gatactcttt ttcttctgcc attattgttt cacagataag gcaggtatac tgaatatgta    5340

aatgaccaga tgccttttct gtgagatgtg caatttggtt ctagaatagg actcttactc    5400

aagattactg gatttgttta atgttctcat atccatgagc cattaacctt cttgagcatg    5460

tcacatagct ggccctgtgt gcaaggatgg aatggatagt taataaagag aggagcattc    5520

ttatgtttat ttagttatag atgcattctc catgctaaat ccctgtgata ttgttggcaa    5580

gccttttgtg tttgctcatg ttttgttgtt tctgcaaata attttgagtt aggatgagag    5640

ggaagaagat gtcatattca gctttgacag ggtgttttat gaagatgcag aacagtctga    5700

tgtctataac ttccttgcag tgccaattgt cgcaggtttc tttctgccta ttcatcaaga    5760

tagtcaaggc atctgcttat tgcaatagtc tctagttttg tcttgactga attctcttat    5820

agtcatgagg tgccatgctt tgtaccaact gtctaaattg cttggacgca gatgccatca    5880

gtggaataaa tgggactata attacttatg gtcaggtatg tattgctgca aagtgcaaac    5940

gccttgttcc ctaactagac agttgtacac aaatgtttga tgcacagctt gcataagtaa    6000

cttgcttatt ttgttgctac tacattacca tcctcaaccc taaaatttac actgaacagt    6060

caccatttgc agtgcaccta atacgctgtt actatgtctg acatgagcta cccatgtcaa    6120

cactgacatt ttatttaact tttcctatgt gaagactgga gcaggaaaga catacagcat    6180

ggaggtaaag tgtacattgc tgggattaat ttaagggatg atgactgact gcatcacttc    6240

agctttgact tgtgtttttg tttaatttgg atgttggcac aggggccgag catcttgcat    6300

tgcaataagc agaaaactgg actagtccag agagttgtag atgagctttt tcaatctcta    6360

caatcatcag aaagcatggc tatgtggagt gtgaaattgt cgatggtaaa aattccagcc    6420

tcatgttctg aatttgaacc cacatcacta aatctttact cacattgata taccacttct    6480

caggtggaga tatatttgga aaaagtaagg tcagtgttgt tgagaatatt ttcttatgct    6540

tccgctgtac agattcatat gttggaaata gagtatcaaa ctttattttg tcatacctca    6600

gggatcttct tgacttgtcc aaggacaacc tacaaatcaa agagagtaaa actcaaggga    6660

tctacatttc tggagcaaca gaagtaagag agaagtgctt aaattgtgtc cttacgtttt    6720

gtttttcatt tgatattctg aaacaagtat ataattccat tttatttttc cttgatggct    6780

tgtgacattt catcatctct gtaggtatcc atccagaata gttcagatgc cttggagtgc    6840

ctttctgtaa gttccttgtg tttttcttgg aatgcctctc tgtgattaga taccaattag    6900

tttttgtttg tttctttaaa ttacaggaag gaattgccaa cagagctgtt ggagaaacac    6960

gtatcctcta tttactattt tactgcttct agaacagctg taaatattaa cactatgcat    7020

tttatcgtcc ttaatgtaca tagaaatgaa cctggctagt agtagaagtc actgcttata    7080

cattttttca gttcaacaag gatcaacttc tgatgagagg tatgcttaat gaatcataaa    7140

catcagcaat cagtagttca gtgcaacatt gcttcccgta tgtggatagg tgttccttat    7200

tccctttttc atattggttg caactaatta tatataacct taaatttggt gatgcccatt    7260

cctttgtgct atagactgat ttagtgattt gatatccaaa tgctggattt cttttggctc    7320

aaattgttaa aatctggtta ttcaaggaaa attgcagtta cctgtatttt aagtaaactg    7380

ccatcctgaa taaatgatgc tagtctgagc aggacgtgtt tctttttctc taaataaaac    7440

tttcagggtg agaggaggga agattattct tgttgattta gctggttcag agaaggttga    7500

gaaaactggt gctgaaggac gagttcttga tgaggcaaag acaatcaaca aatctctctc    7560

agttctcggg aatgttgtca atgctctaac aactggtata gacttttctg gagagaataa    7620

acatcaacag aaggtcaccc tcacgattta tgccttgcta tatttacttg tcttatcttt    7680

tcatcttcag gtaaaccgaa tcatgtgcct tatcgtgact ctaagcttac gcgcattctt    7740

caagatgcac tggttggtga aaagattttc tcaggagttt ctgaatcgtc gggtttgtct    7800

aaatgccact ggtttttgca gggtggcaac tcaagagcgg cattactgtg ctgttgttcc    7860

cccagtgctt caaatgcacc agaaagtttg tctactgttc gtttcggaac aaggcatatc    7920

tcttgaacaa tgcatgctgg agtattacat ttctacctct gcatattgtc ctgattctat    7980

ggcagcatct gtccaggaca aagctcataa agaccacacc caaatcaatc tctcccgaag    8040

tggatagcat caagaagccc atccctgatt ctcatggcca aaatgatctg cgtgaccgga    8100

ttctgaacaa ggtttgtata gcaactaacc agagatggcc aattcaggtc caatttttga    8160

tcacttgata cctcactgaa gatcaatcat ttttcctcag ttaaggttga gcctgaagga    8220

ggaagatgtg gaccttctgg aggaactgtt cgtgcaggaa ggcatcatct tcgaccccaa    8280

ctactccgtg gcagacatcg actcagcctg ccaagacgcc gcgagccagg aggtctcact    8340

gctcacacaa gctgtggagg aactgaaaga aaccgtcgaa gaggtagtag tagcatcaag    8400

cctccatagt ccatatactc cctcccagtt tcattgttca ggcagtaact gtagcaaaca    8460

tgttttgcag ctcaccgatg agaacgagag gttgaggggt gaactcgagc tcgcgcagga    8520

ggctgccgcc gccgccgctg ctgctcgggc tgacggcgcg ctgcttggtt tcgtgccggc    8580

ggtcgccatc agctccctcc tccgcccctt tgggttcgtt ccagactgaa gacgagatac    8640

aaggtcacac ataatacatt ttgctgccat ttctgacgtg agatacagtg acggtaggaa    8700

ctaggaagaa atgctaatgt catcgatcga acttctcact tgcctttatc gctgtgatag    8760

tacacagaag gaacattgac atcgagctgg aagttttgtc atttcgagaa tacgcgtgtt    8820

tgagtggcta atgtcaccga tcgaacttct cacttgcctt catcgttgtt atagtacaca    8880

gaaagaacat tgacatcgat ctaaaagttg tcattacgat aatacgcgtg tttgagtttc    8940

aacttaaaaa ttaccgtatt gaaatgcacc ctaatcgttt gtttgctttg cttatgttgt    9000

gtttccttga agcctcgatt acttcgacat ttccaaaact tgtaacagtg ttgatttttt    9060

tttcaatggc gtttgactat ttatactgtt taaaaatata taattagtat tatttatttt    9120

atcgttactt ctttaattat caaagaaact taaagtatga cttataagca ttgtacacta    9180

aatttttaaa taaaatggat gatcaagtca attgcattat ctattataaa aagtagacaa    9240

tatgttattt ccttggcgaa aaagagaaat aaaacttttc cacaacttgt agtgagcagt    9300

gtagcatgga atcatttaac tcattcacaa gcattaatct gtttcatatt ataaaacgat    9360

ttggtttaga ataaatttct gcattgatcc atgtgtagga gtatgtgtct aaattcactt    9420

gaaaaatttg tgagggatgg agatgctaaa acatgttata attggaacgg atggagtatt    9480

ttgttgagta aatttcacaa aactatatat actttggtca aattatcaca aaactacata    9540

tttaaggtaa tgtatcataa aactatagat ttaacactaa atttatcaca aaactacaaa    9600

tttaaggtat agtattacaa aactatagat ttagtagcaa aataataata aaactacaag    9660

tttagtgtta atttaatcat aaaacttaga tgtttataac tcaaacataa cacactagta    9720

ctaaagattt aaactctaaa atatgtagtt ttgtgataac tttgttacta aatctatagt    9780

tttacgatac ttcaccttaa gtatgtagtt ctatgataaa tttagtgtaa aatgtgtagt    9840

tttgtgaaac gtcaccttaa atctgtagtt ttgtgataat ttaaataaag tatatgtagt    9900

tttatgaaat ttactcaatt ttgtgtggtg aagttgtcga cgtggcacac catcgagccg    9960

ctcatctctc tcccaagcca acacccgaga gtgggtcgag acagggagcg tatcatcctc   10020

ttcctcccgc ccccgacctc tcttccctat ccaccccatc catggctgcc tcctcccact   10080

acgccctcct ccaccaccac ctccccaacc ctctccatcc ccgtcacctc tcctcctcct   10140

cctccccttc tcctccccct cctctccacc tccacctcca cctccaccgc caccgcctcg   10200

ccctctccac cgcccgtttc ttccgcctcg cggagcggcg agccagcgcg gggccactgg   10260

tgttcgaaac ggaggaggag aggagtgggt ggtcgggtgc ggaggcagcg gagtcgaact   10320

acgacgatga ggaggatgag gaggaggagc aagg                               10354

Claims (4)

1.一种培育雄性可育转基因植物的方法，是将与植物雄性育性相关的蛋白的编码基因导入雄性不育植物中，得到雄性可育的转基因植物；所述雄性不育植物为w207-2水稻；所述雄性可育的转基因植物为花粉育性高于90％的转基因植物；所述与植物雄性育性相关的蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述与植物雄性育性相关的蛋白的编码基因是如下1)或2)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述与植物雄性育性相关的蛋白的编码基因通过含有该基因的重组表达载体导入所述雄性不育植物中。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体是在pGD625载体的重组位点attB1和attB2之间插入与植物雄性育性相关的蛋白的编码基因得到的重组质粒。

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