CN107446031B - 一种植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVHA-E1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVHA‑E1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白转运储藏相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的植物谷蛋白转运储藏相关蛋白影响植物胚乳中谷蛋白前体的转运储藏。将所述蛋白的编码基因导入谷蛋白转运储藏异常的植物中，可以培育谷蛋白转运储藏正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVHA-E1及其编码基因与 应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVHA-E1及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。杂交稻的成功应用在很大程度上解决了世界人口剧增带来的吃饭问题，但随着人们生活水平的不断提高，培育高品质、高营养以及各类功能性水稻正在成为迫在眉睫的问题。水稻种子贮藏蛋白作为稻米中的第二大营养物质，在很大程度上决定了稻米的营养价值。因此对其合成转运途径的深入研究，将有助于我们通过基因工程的手段对稻米进行改良。

水稻谷蛋白首先以57kDa前体的形式，在内质网中合成，在分子伴侣的协助下正确折叠，之后输出内质网，进入高尔基体后，经过翻译后修饰，出芽形成囊泡，这些电子致密的囊泡会与水稻胚乳中的蛋白贮藏液泡融合，形成。水稻谷蛋白进入蛋白贮藏液泡之后，经过液泡加工酶的切割形成成熟的酸碱亚基，最终以这种成熟形式贮存其中。蛋白体II中的谷蛋白可以被人体消化吸收，为稻米中主要的蛋白质来源。

上述谷蛋白分选加工的过程是一个极其复杂的生物学过程。水稻谷蛋白57H突变体无疑是研究水稻贮藏蛋白分选的优良材料，目前已报道了几个57H突变体，但其中大多数尚未被克隆，因此，贮藏蛋白分选的确切机理尚不明确。

VHA类蛋白在生物体中发挥重要功能，目前尚无报道关于VHA蛋白参与水稻贮藏蛋白分选的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种谷蛋白转运储藏相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的谷蛋白转运储藏相关蛋白(OsVHA-E1)，来源于稻属水稻(Oryzasativa var.宁粳1号)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷蛋白转运储藏相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.1由230个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的OsVHA-E1便于纯化，可在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK

上述(b)中的OsVHA-E1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述(b)中的OsVHA-E1的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述贮藏蛋白转运储藏相关蛋白的基因(OsVHA-E1)也属于本发明的保护范围。所述基因OsVHA-E1可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码谷蛋白转运储藏相关蛋白的DNA分子。

SEQ ID NO.2由693个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

所述重组表达载体优选为在pCAMBIA1305载体的酶切位点SmaI之间插入所述基因OsVHA-E1得到的重组质粒，命名为pCAMBIA1305-OsVHA-E1。

含有以上任一所述基因(OsVHA-E1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌。

扩增所述基因(OsVHA-E1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法。

本发明提供的培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法，是将所述基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物；所述谷蛋白含量降低植物为籽粒中成熟谷蛋白含量显著低于正常型的植物；所述谷蛋白含量正常的转基因植物为籽粒中成熟谷蛋白的含量与正常型相当的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入成熟谷蛋白含量降低的植物中；所述成熟谷蛋白含量降低的植物可为Y153。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的植物谷蛋白运输储藏相关蛋白的基因OsVHA-E1。本发明的植物谷蛋白转运储藏相关蛋白影响植物的囊泡运输过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物种子中谷蛋白的囊泡运输过程的障碍，并影响其剪切成熟，从而可以培育囊泡运输变异的转基因植物和植物成熟谷蛋白含量降低的转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以培育成熟谷蛋白含量正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为野生型宁粳1号和突变体Y153蛋白质电泳图比较。

图2为野生型宁粳1号和突变体Y153的成熟种子外观比较。

图3为野生型宁粳1号和突变体Y153的发育中胚乳细胞中超细微结构的比较。

图4为野生型宁粳1号和突变体Y153的发育中胚乳细胞中谷蛋白分布的比较(免疫荧光)。

图5为精细定位示意图。

图6为转基因植株进行PCR分子检测结果。

图7为转pCAMBIA1305-OsVHA-E1的植株的成熟种子外观。

图8为转pCAMBIA1305-OsVHA-E1植株的成熟种子的蛋白质电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物种子谷蛋白转运储藏相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻成熟谷蛋白降低突变体Y153的成熟谷蛋白含量分布分析及遗传分析

在粳稻品种宁粳1号突变体库中，利用蛋白质电泳分析，筛选得到了一个种子中成熟谷蛋白含量降低的株系，同时其谷蛋白前体相比正常型显著的增加，命名为用Y153。

与宁粳1号比较，Y153的主要特征是：种子中成熟谷蛋白含量下降(见图1)，伴随谷蛋白前体大量积累，同时具有种子不透明的表型，见图2。

对发育中胚乳进行的透射电镜观察发现Y153中储存成熟谷蛋白的二型蛋白体相对宁粳1号(图3A)的大小显著的变小，并且二型蛋白体的外形也发生了变化，具有高度不规则的外形(图3B)。同时，Y153的胚乳细胞中还出现了很多来源未知的聚集体PMB(图3B)。利用免疫荧光技术，观察到Y153(图4B)中的二型蛋白体的显著的变小，谷蛋白除了存在于二型蛋白体中还沿着细胞壁分布，聚集体中也分布了大量的谷蛋白(图4B)。所以，微观观察数据表明在Y153突变体胚乳细胞中谷蛋白的存储形式发生了大幅度的改变，部分谷蛋白没有被正确的运送到蛋白质储藏型液泡中。谷蛋白的剪切成熟须在蛋白质储藏型液泡/二型蛋白体中完成，因此，推断Y153中因为囊泡运输过程的障碍，谷蛋白不能全部成功运输到二型蛋白体中，而以前体形式存在于细胞壁附近和聚集体中，因此，成熟的谷蛋白的含量大幅的下降。

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

用宁粳1号的花粉给Y153进行了人工辅助授粉，所得种子中成熟谷蛋白含量正常，用Y153的花粉给宁粳1号进行人工辅助授粉，所得种子中成熟谷蛋白含量也表现正常。所得F1自交后，后代中正常型和突变型的种子符合3:1的分离比例，因此，Y153中成熟谷蛋白降低的表型是由单个隐性核基因控制的。

用突变体Y153与籼稻品种日本晴杂交，在Y153/9311的F2种子中利用蛋白质电泳分析挑选出10个具有成熟谷蛋白含量下降的单株，提取各株的叶片中的基因组DNA，利用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对10单株进行连锁分析，将谷蛋白运输储藏蛋白相关基因OsVHA-E1定位在第1染色体上标记Indel1-11和D12之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman InstrumentInc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/μl)1μl，上游引物(2pmol/μl)1μl，下游引物(2pmol/μl)1μl，10xBuffer(MgCl₂free)1μl，dNTP(10mM)0.2μl，MgCl₂(25mM)0.6μl，rTaq(5μ/μl)0.1μl，ddH₂O 5.1μl，共10μl。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记。用F2群体中的成熟谷蛋白含量下降的单株验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体基因。从Y153/9311衍生的F2分离群体中挑出确认为成熟谷蛋白含量下降的单株358株(用于突变基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR分子标记对突变基因进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变基因，具体方法如下：

SSR标记开发：

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5):808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在Y153和9311之间的多态性，表现多态者用作精细定位Y153基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。

表2用于精细定位的分子标记

引物	前引物	后引物	所属BAC
				D28	ATGGAACTGCAGATTTGATGGA	ACTTCATATTCCACTGGGCGTC	OSJNBb0006H05
D31	CCCTTATCCTTATCCCCTCCCA	ACAACCTGCCCGTGCATCGCCGCCTC	OSJNBa0049H05
				D13	AGCCTGGATAAGATGGTTCGTC	GCTGTAGTTGCTGTTTGCCTGT	P0684E06
D12	TAGCCTCATGGCTCGGTCACTC	GTGCTGCCTAACTTGGCGGAAT	P0684E06
				D38	ATGTCAGTAAGCCACATCAGCACC	GTGCCACCTCCTGTGCAAGAGC	P0694A04

最终把Y153基因精细定位在标记D38和D13之间，物理距离约为72kb(图7)。

(3)突变基因的获得

经过对72kb区间内的测序，在第5个内含子开头缺失GT两个碱基，造成内含子不能剪切，移码并提前终止(图5)。

根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述：

primer1：5'ATGAACGACGCCGATGTCGCC 3'(SEQ ID NO.4)；

primer2：5'TTATGCCGTCACCTGACCAAA 3'(SEQ ID NO.5)。

以primer1和primer2为引物，以宁粳1号的发育中胚乳cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后连接到pMD18-T(日本Takara公司上)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码535个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为OsVHA-E1，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsVHA-E1。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以日本晴(来自南京农业大学水稻所种质资源库)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsVHA-E1基因，PCR引物序列如下：

primer3：

5'AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGAAACTACTCTAAAAACCAACCAC 3'(SEQ ID NO.6)；

primer4：

5'CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTTTGCCCAACCAAGGACAACGAG 3'(SEQ ID NO.7)。

上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的上游2.3kb和下游1.1kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分，将PCR产物回收纯化。采用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1305中。

INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物1.0μL，pCAMBIA1305 6.0μL，5×infusionbuffer 2.0μL，infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴15分钟，而后50℃水浴15分钟，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.3所示基因的重组表达载体，将含有OsVHA-E1的pCAMBIA1305命名为pCAMBIA1305-OsVHA-E1,OsVHA-E1基因片段利用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)插入到该载体的SamI酶切位点之间。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pCAMBIA1305-OsVHA-E1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1305-OsVHA-E1。

用pCAMBIA1305作为对照载体转化农杆菌EHA105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。

三、转基因植物的获得

分别将EH-pCAMBIA1305-OsVHA-E1和转空载体对照菌株转化水稻成熟谷蛋白含量降低突变体Y153，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1305-OsVHA-E1(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的T5390水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T0代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR分子鉴定

将步骤三获得的T0代植株提取基因组DNA,以基因组DNA为模板，利用Primer5和Primer6为引物对进行扩增(Primer5：GTCGCCAAGCAGATCCAGCAGA(SEQ ID NO.8)和Primer6：TCTCCGGTAATTTCTTGCGGA(SEQ ID NO.9))。PCR反应体系：DNA(20ng/μl)2μl，Primer1(10pmol/μl)2μl，Primer2(10pmol/μl)2μl，10xBuffer(MgCl₂free)2μl，dNTP(10mM)0.4μl，MgCl₂(25mM)1.2μl，rTaq(5μ/μl)0.4μl，ddH₂O 10μl，总体积20μl。扩增反应在PTC-200(MJResearch Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测,图6中泳道2为Y153突变体基因组DNA，作为阴性对照；泳道1为pCAMBIA1305.1-OsVHA-E1质粒，作为阳性对照；泳道3-5为转基因阳性株系。

2、表型鉴定

分别将T₀代转pCAMBIA1305.1-OsVHA-E1植株，宁粳1号和Y153种植在南京农业大学牌楼试验网室内。种子成熟后，收取各材料种子，观察到pCAMBIA1305-OsVHA-E1植株的种子中出现了透明的种子(图7，其中L1、L2、L3是三个不同的转基因株系)，进一步的蛋白质电泳分析显示，转入pCAMBIA1305-OsVHA-E1的Y153种子的成熟谷蛋白的含量上升至正常水平(图8，其中L1、L2、L3是三个不同的转基因株系)。因此证明Y153中的突变表型是由OsVHA-E1的突变造成的。pCAMBIA1305-OsVHA-E1可以使Y153株系的成熟谷蛋白增加至正常水平。

<110> 南京农业大学

<120> 一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白 OsVHA-E1 及其编码基因与应用

<160> 9

<210> 1

<211> 230

<212> PRT

<213> 水稻（宁粳1号）

<220>

<223> 谷蛋白转运储藏相关蛋白 OsVHA-E1 氨基酸序列

<400> 1

Met Asn Asp Ala Asp Val Ala Lys Gln Ile Gln Gln Met Val Arg Phe

1 5 10 15

Ile Arg Gln Glu Ala Glu Glu Lys Ala Ser Glu Ile Ser Val Ser Ala

20 25 30

Glu Glu Glu Phe Asn Ile Glu Lys Leu Gln Leu Val Glu Ala Glu Lys

35 40 45

Lys Lys Ile Arg Gln Glu Tyr Glu Arg Lys Glu Lys Gln Val Glu Val

50 55 60

Arg Lys Lys Ile Glu Tyr Ser Met Gln Leu Asn Ala Ser Arg Ile Lys

65 70 75 80

Val Leu Gln Ala Gln Asp Asp Leu Val Asn Ser Met Lys Glu Asp Ala

85 90 95

Thr Lys Gln Leu Leu Arg Val Ser His Asn His His Glu Tyr Lys Asn

100 105 110

Leu Leu Lys Glu Leu Val Val Gln Gly Leu Leu Arg Leu Lys Glu Pro

115 120 125

Ala Val Leu Leu Arg Cys Arg Lys Glu Asp His His His Val Glu Ser

130 135 140

Val Leu His Ser Ala Lys Asn Glu Tyr Ala Ser Lys Ala Glu Val His

145 150 155 160

His Pro Glu Ile Leu Val Asp His Asp Val Tyr Leu Pro Pro Ser Pro

165 170 175

Ser Ser His Asp Ser His Glu Arg Phe Cys Ser Gly Gly Val Val Leu

180 185 190

Ala Ser Arg Asp Gly Lys Ile Val Cys Glu Asn Thr Leu Asp Ala Arg

195 200 205

Leu Glu Val Val Phe Arg Lys Lys Leu Pro Glu Ile Arg Lys Leu Leu

210 215 220

Phe Gly Gln Val Thr Ala

225 230

<210> 2

<211> 693

<212> DNA

<213> 水稻（宁粳1号）

<220>

<223> OsVHA-E1 基因 CDS

<400> 2

atgaacgacg ccgatgtcgc caagcagatc cagcagatgg tgcggttcat ccgccaggag 60

gccgaggaga aggccagcga gatctccgtc tccgccgagg aggagttcaa tattgagaag 120

cttcaacttg ttgaagctga gaaaaagaag atcaggcaag aatatgaacg gaaagagaag 180

caagtcgaag ttagaaagaa aattgagtac tctatgcagc tgaatgcttc tcgcatcaaa 240

gtgcttcaag ctcaggatga tttggttaat tccatgaaag aggatgctac aaagcaactc 300

ctgcgtgtca gccacaacca ccatgaatac aagaaccttt tgaaagaact cgtcgttcag 360

ggtttgcttc ggttgaaaga gccagcggta cttctccgtt gccgcaaaga agaccatcat 420

catgtggaat ctgtactgca ttcagcaaag aatgaatatg cgtcaaaagc agaagttcat 480

cacccagaga tacttgttga ccacgatgtg tacctaccgc cttctccaag ctctcatgat 540

tcccatgaga ggttttgctc tggaggtgtt gtgctggctt ctcgagatgg aaagattgtg 600

tgtgagaaca cacttgatgc caggctggaa gttgtcttcc gcaagaaatt accggagatc 660

cggaagcttc tttttggtca ggtgacggca taa 693

<210> 3

<211> 7579

<212> DNA

<213> 稻属水稻（宁粳1号）

<220>

<223> 谷蛋白分选相关蛋白 OsNHX5 的基因序列

<400> 3

gaaactactc taaaaaccaa ccaccataca tgcattaggc tgtgttcgca tgagctggat 60

aggaacttat tccctccgca cggaaaacgg agcggtccat tagcgtgtga ttaatgagag 120

cagtccatta gcgtgtgatt aatactatta actcattaat cacatgctaa tagaccgctc 180

tatttttcgt gcgggaagga ttagttccca tccgttgaat ccgaacacag ccttagtttg 240

gatgcctgaa gacctccatg ccgccctctt ctcatagaac acctccagtt tagtgatgaa 300

gtttagtgat gttcatagag atagggtgtg cgtctataca ttcacaggcg cgctatgagc 360

acctacgtgt attctgtgat tttttagaaa aatggttatg atagttgatg ataataagtg 420

aaattgggtt tatgataatt attcaatagt ataaacgaga tatataaata ttataaagtt 480

gataagttga ttttaaaagg ttttgtagta aataccgatg aagagtcctt tctttcaaag 540

taattcacat catttagaag tttataaaat atatccacga taatttataa tctataaaga 600

aattgaacaa gcccattatc atggttggta ggttgtggaa gctctgggta aaagccttgc 660

tcaacctcta gctattgctt gcatcgccga tgcctgcatg cgccagatcc ctatttggag 720

gtgtcgttta gaagataata ctctatattt tggtgctcac tgacttgtgg tggtgcatgt 780

ttcgtttctt gtgggtttta tgacttttgt cggttccctt ataaataatc atgatgtcgt 840

aaggttttta cccggtttaa aaataaaaac catgctaact cccttggtct gaatttttta 900

aaaaagaact catgccttgc ctaaaagtaa aaagaagagg atgcccaatt aatcaacgat 960

ttcaacaaaa aaattatatt taattgaccg agaggatctt gcattttggt atagtacgaa 1020

gctaacatct gtagtatcat ttcttgtttt aacatatagt aaaggccgta tttctttaaa 1080

aaatacttat catccattcc cacacacagc actaaagatg tatactagag tcaaaatggt 1140

taaatctagt aagaaatgat tgtccggttt tatgtactct agtcaagtca aggggaaaaa 1200

aaaaggggag tgtttatttt gccttgccta ataagcaatt gcaacaataa gacaaccgag 1260

aaaataggta cacgactcat ccattttgca tggtgaatgc gagctacaaa tagatagaca 1320

ctatgaccta gttcatttct tgtaaagata aagattttac cttagttttt attatcacgc 1380

tttttaaact attaaacgac ttgttttgag tgaaaacttt ttatattaaa gttgcttcaa 1440

aatattaaat gtatccattt ttcaagtttg taataattaa aacttaatta atcatatgct 1500

aatagctttt tttttgcatg cccatattta atctgaatct ttataagatt cgaacacaat 1560

ctatgtttac aatgaatatg gaaaggtacc tgttcaaatt cgtttggact aaactccata 1620

ttatataaca tccccaacta tgctgttttt ttaaaaagag ggaatacctt tttaccaata 1680

ttttttcttt ttattattta aataatcatg tccagattcg ttaaactatt gtgtctcatt 1740

tttaactagg ttgagttttt tcttttacaa aaggagtacc cttttacgaa ccatatatat 1800

attttttctg tctcccttaa tagagccttt tattatctaa aggttatatc catgtacaac 1860

ccatctcatt atgaataaac ataaatatgt atacaccctt ttgcagctca gtataacctg 1920

ctattaatac caaagttgcc aaacggaaat acttattctg cgaaattctt tactaaacca 1980

cacctatcaa agatgttgta acagtggcgc tcaacttaac gaaaaaacag ctgtcgacaa 2040

agccacagcg ccacagacag cgaccgaaaa cgagagagaa aagatcacgg acccatggac 2100

cgcgtccacg gaatgatcga cagggcagcg gcaaccaagg gcggcacgtt gccccgcgcg 2160

gctagaccgc tagtagacta gtcccacgac tccccatccc tcctccctct ctcgaccact 2220

cccgtggact cctctctcct ccccttccct cccctccccc gcgcgcggtg gtggttcgcc 2280

ggagcgcagc agcagcagca gcaaaaggcc gcgagggccg ccgtcgggat ccccgccgcc 2340

gccaagatga acgacgccga tgtcgccaag cagatccagc agatggtgcg gttcatccgc 2400

caggaggccg aggagaaggc cagcgagatc tccgtctccg ccgaggaggt cagtacttac 2460

ccctcccctc gcctcgcctc tcccccgcgc gtcgaagctt cgggaagcct ctcgatccgc 2520

gcctccgaag cttttcaccc gcccgatctg cctggtgccc ccccgtgatc tcgaagcgtc 2580

gagagctaga agttgatact tgatcctacc ttgtttccga ggatccgagc ggtttgactg 2640

ttaggtttcg gtttctggga cgagaatttt gtagtcgaag cgtctaggca ataggctccc 2700

tggttccgag gtagatcgag aggaatcggg atccggggtg tgtcgcttga gcagatctcg 2760

gtgcgtggat ctagaagctt ccagatcacg agtttctagt ccaataaagc tcgttttctt 2820

actttggact aggaagtact gccacactgg atggtcaatt gttccgtttc cgcccttctc 2880

tgctactggt tagtccgtac ctgaatccag ttgtggcttg aattgcgata agagaggcta 2940

gtctaatcca aaggtctcta gatcattcta gaagcgagat ttgggcttaa gatgaactga 3000

aacttgaata gggtatgctt gatctgttca ctctcccatt tcgcttctag attgtgctag 3060

aagcacaatt ggaggataag gttaacaatg agaagacgga aagaggtact aatacatggt 3120

taaaggaaat ccttgcaaca actggtcacc accctccatc acctgccaac ttatgagctg 3180

tagttatcca ttaccattaa ccagccataa acttttttat tccttttttt tatgtcaatg 3240

caatcataat ggagatagga tgcatgaaca cctctattgc ttgttggcat gatgggttgg 3300

ccatgatgaa tgtcaagcaa catacttgct gagtgggctg ctactgttat gatcattttt 3360

acttgctcta gcttgtcatt tcagctgaat acaactgatc cacctgcatg gtttgatcga 3420

tcaccccttg gtgtgcatga ttggcaatca tgtttgctac caacaagcat catcaattgt 3480

gcaatcatgt atcacgcctt ttactatcat aaggtccagc ggacatgaac atgtttaata 3540

tgctttctga ctacaactgt gctggaagta tgatttattc ttgaagcaac aggggcatcc 3600

tcatgtttgt aataaaagaa agtttcatta caatgagtta ttaatcttct ggaaatacat 3660

gcttgttttg tttgcgtgtc cattcttttc aaccccacct tttatcaata ccaatgactg 3720

acaacaggta cttgtttgac gagtcagttg ttcagatttt agtaggctgt ttggctttag 3780

aaaccaaacc atccagtatg tcttgataaa tcatgggatg atcccatgaa ttttcgtggg 3840

atgatccttt cctcacttct ccactaagtg tgtttttgag ggataggtga tgatggtcaa 3900

acccattccg ttcctcaaag taaacaagtc atataggact gagttgtcaa ttagctcctt 3960

agttggctgt gtgcatcctt atttgatgca aggcagagtt atacttccat catccgaaaa 4020

aaaaggctca attaaccatc tcattcctca aaccagataa accactatgc ctttatcatt 4080

gctgacagtt ggttaaccat tctgatttcc ttccatatgt taacttattt gtataatgtg 4140

tttgcaggag ttcaatattg agaagcttca acttgttgaa gctgagaaaa agaagatcag 4200

gcaagaatat gaacggaaag agaagcaagt cgaagttaga aagaaaatgt gagacttcga 4260

ttcctcaaat tatttatgtt ttcctgtgtt ctccgtatgg tcccattaac agcatttcat 4320

gttgaggatt tctgcagcat acagtacatt acatcaatgc ctcaatacat tttagataca 4380

gctggaatgc tggattctca tttgtgtgca acattagtag taaaagctag ctacaaacta 4440

cttcagccac atggttaaat tggcagtaat cgtaatttga ctgcactggt tgttgagaca 4500

cttaaaaatc aaattcggat gtgtagttca gtgcagtaaa cttcactgat gagtcgactg 4560

tattttattt tttagacaaa attgtgtgaa ctgctgcttg cagttcaatg tctgttgaag 4620

tgagagtatg tatcaatcat gatctggatg taataaaagt tgtacattaa caatcttacg 4680

atggaaaaag ttagagaact atttgacaaa atggtaatac aaagtacaaa ctgacataac 4740

atgcatactc aaacattgtt taccttcctt gcgtattaca tttaatatgg tactgattgc 4800

ttgttagcat aggtttcata gaatccacct gtatcactat ttctgggttt atccatttgt 4860

taactgatga ggccttgttt tctcctttat cagtgagtac tctatgcagc tgaatgcttc 4920

tcgcatcaaa gtgcttcaag ctcaggatga tttggttaat tccatgaaag aggatgctac 4980

aaagcaactc ctgcgtgtca gccacaacca ccatgaatac aagaaccttt tgaaagaact 5040

cgtcgttcag gtttgtatga aatgttgaat acatcatctg ctagattctt atccattaag 5100

cctttttgag cgatccttct gataattgtg gaccccaaga gggtttcacc tatatagtta 5160

agttcgatac gcagaactga attattggat attgaagtgt taaatcacat tgtagttttg 5220

caactctaac tgcatgcaca aaagagctag tgctaaaaga acatctgttt atgattcacc 5280

tttaaacttc tcttatggac gtgtcaattt aattgatgga attaagtttg aaatgccatc 5340

tccttgtttg ttcactactg ttattaacaa aataatcatt catcatattg actggaaata 5400

cagggtttgc ttcggttgaa agagccagcg gtacttctcc gttgccgcaa agaagaccat 5460

catcatgtgg aatctgtact gcattcagca aagaatgaat atgcgtcaaa agcagaagtt 5520

catcacccag agatacttgt tgaccacgat gtgtacctac cgccttctcc aagctctcat 5580

gattcccatg agaggttttg gtaataaata gtttcttacc cttgcagcct gccaatttgc 5640

tactgtatat ctgtactact agtaacagtc tagcaaatat actaaaagaa agaaagctat 5700

cttttggact aacagataat ctgctcagta actctacaaa catgtataat ttggaaaata 5760

acatcaatat gagtatacag gtcggtcttg ggcctgttaa tcagaagttt agtgctgaag 5820

actttaactc taccctgacc tggacaatca gctcttatct ggctattgct ttggcataca 5880

ttatgacatt tattgaacag ttgatatgct gaatagtgta atactgcact aggttaagcc 5940

acaaatacat ccgtctacct taaaactgat tgaatatggg aagagagcac tacagctcct 6000

gatatagcat aatgaagtga tcattggcct gttgcagctc tctctctctc tctctctctc 6060

tctctctctc tctctgcatg ttctagtata ggacagcagt tgggatttga aatccatagc 6120

ttcgtttcaa tttcaatact tttactgtag ttcttaatcc tgatatggat cctgctgttt 6180

atgctaatat aatgtgttta tgcagctctg gaggtgttgt gctggcttct cgagatggaa 6240

agattgtgtg tgagaacaca cttgatgcca ggctggaagt tgtcttccgc aagaaattac 6300

cggaggtgcc ttcgtttagc tcgattttaa tattcatttt gttccaccaa ttccaaagtt 6360

tcaaccatgt atacaagtag ttcagtacca ctagaacatt taaacatgat ttgcatgttc 6420

ttatttgtca atttaacaat gaccctgata ggctacagca catgcagagc aaatggttat 6480

accttcatat tttcattctt cttcccgttt ccttgcagat ccggaagctt ctttttggtc 6540

aggtgacggc ataatctgtg catgtaattt cagctgcggt atagctgctt ccatgtaatt 6600

agctgcaggt tcgaacctgc agctgcaagg aatttcacct gtttgtgcca aattgattgt 6660

ttaaagtatt catccgctat gtaaaacact acctatttgt tcattattat cgccgagcac 6720

caactattcg cacgcttgtt tgctcagagg tataataata ataataaagg acggtcaaac 6780

gttccattgc tgtgtaaacc tatttgcctg ttgtccctgg cctgttggtc tgtaattccg 6840

tatagtttgt gtaactctgg tgtgggccta tttgattctc taccctacct atttattggt 6900

agtgctaaaa tctaggcata ttgtggcact accaattttt tggtagggta aagttaatta 6960

gcctactttt agtttgatac caatatggag ccaaatttta gtactatgat gaagaatatg 7020

gccaaattga gtatcggcct tatcaattgt ttggcttcaa accaaactaa catatttact 7080

atttaaatta ccaaaatttt ggtagggcac cgttttagct ttaatccaaa acggcctata 7140

gttcttaact gtactatccg ccgccgccag ttatacattg ctgctgctgt tcagctgcaa 7200

atactcacca gccccagaag ttctacagaa ctcttgaggc ttcagatttc agaagagtcc 7260

agtaactatg ggtggttatt gttttctaca ccccaacact agcgcttagt actactcaag 7320

ggctgaagtc ctggaagtgc attgagcaaa tacactagca gtccacctgc gacatgactg 7380

gcggaagcca cggtcctcgc cgctcagcac gaaacaagcc ggcgggtcgg gccggatgac 7440

ggtaaggcca ctctggcgac cagcgatgcg aaagggcggc cggcggcaga cgagacgagt 7500

gaatcgagcg gcgcaatgct atcgatctaa agaaaggaaa acgaaccatg tggtctctcg 7560

ttgtccttgg ttgggcaaa 7579

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer1

<400> 4

atgaacgacg ccgatgtcgc c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer2

<400> 5

ttatgccgtc acctgaccaa a 21

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer3

<400> 6

aattcgagct cggtacccgg ggaaactact ctaaaaacca accac 45

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer4

<400> 7

cgactctaga ggatccccgg gtttgcccaa ccaaggacaa cgag 44

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer5

<400> 8

gtcgccaagc agatccagca ga 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer6

<400> 9

tctccggtaa tttcttgcgg a 21

Claims (3)

1.SEQ ID NO.1所示的蛋白质、 SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的基因、包含SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示的基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育成熟谷蛋白含量正常或含量降低的水稻育种中的应用。

2.一种培育成熟谷蛋白含量正常转基因水稻的方法，其特征是将SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示的基因导入成熟谷蛋白含量降低的水稻中，得到成熟谷蛋白含量正常转基因水稻；所述成熟谷蛋白含量降低的水稻是种子中成熟谷蛋白含量降低，并伴随谷蛋白前体增加的水稻；所述成熟谷蛋白含量正常的转基因水稻为成熟谷蛋白和谷蛋白前体含量均正常的转基因水稻。

3.一种培育成熟谷蛋白含量降低的转基因水稻的方法，其特征在于抑制目的水稻中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的基因的表达，得到成熟谷蛋白含量降低的转基因水稻；所述目的水稻为携带SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的基因的水稻；所述成熟谷蛋白含量降低的水稻是种子中成熟谷蛋白含量降低。