CN102603878A - 一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVps9a 及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVps9a及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白转运储藏相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以培育成熟谷蛋白含量正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVps9a 及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVps9a及其编码基因与应用。 

背景技术

高等植物在生殖时期向种子中积累大量的储藏性物质，植物种子因而成为了人类主要的食物来源。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球超过50％人口以稻米为主要口粮。稻米中含有大量的储藏蛋白，它是稻米中仅次于淀粉的第二大物质。因此，深入研究储藏蛋白，对于改良稻米的食味品质和营养品质都具有重要意义。 

水稻种子中的储藏蛋白约占籽粒干重的8-10％，其中谷蛋白占60-80％，醇溶蛋白占18-20％。其中谷蛋白可以被人体吸收，醇溶蛋白因储存在致密的蛋白包涵体中而不能被消化。谷蛋白在稻米胚乳的内质网合成后，需经过一系列复杂调控的囊泡运输过程，最终运送并沉积到蛋白质储藏型液泡中，形成二型蛋白体。谷蛋白运输过程中如出现错误，谷蛋白就无法被位于蛋白质储藏型液泡中的液泡加工酶酶切为成熟的谷蛋白，因此，谷蛋白运输相关基因的缺失会导致谷蛋白前体的大量积累以及二型蛋白体体积的缩小，进而影响稻米中可被吸收的成熟谷蛋白的积累和分布。 

Rab蛋白家族在真核生物中对囊泡运输起着重要的调节作用。拟南芥中的Rab5GTPase定位于前液泡膜上，调控了从高尔基体到液泡的囊泡运输过程。为了正确地实现其多样的功能，必须对Rab GTPases进行严格的时空调控。Rab蛋白被鸟核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)所激活，所有的Rab5的GEF均具有一个高度保守的VPS9催化结构域。在拟南芥中，AtVPS9a能够激活结构上差异较大的两种类型的Rab5蛋白，在植物的生长发育中具有重要的功能。但水稻中，含有VPS9结构域的蛋白的功能还没有被研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白及其编码基因与应用。 

本发明提供的谷蛋白转运储藏相关蛋白(OsVps9a)，来源于稻属水稻(Oryza sativa var.日本晴)，是如下(a)或(b)的蛋白质： 

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白转运储藏相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。 

SEQ ID NO.1由480个氨基酸残基组成，自氨基末端第144至264位为VPS9结构域。 

为了使(a)中的OsVPS9a便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 

表1标签的序列 

标签	残基	序列
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK

上述(b)中的OsVps9a可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsVps9a的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。 

编码上述植物谷蛋白运输储藏相关蛋白的基因OsVps9a也属于本发明的保护范围。 

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子： 

1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子； 

2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子； 

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物谷蛋白转运储藏相关蛋白的DNA分子。 

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。 

SEQ ID NO.2由1443个核苷酸组成，为基因OsVps9a的CDS。 

含有以上任一所述基因的重组表达载体。 

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆 菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。 

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、绿色荧光蛋白基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。 

所述重组表达载体优选为在pCAMBIA1305载体的酶切位点SmaI之间插入所述基因OsVps9a得到的重组质粒，命名为pCAMBIA1305-OsVps9a。 

含有以上任一所述基因(OsVps9a)的表达盒、转基因细胞系及重组菌。 

扩增所述基因(OsVps9a)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 

一种培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法。 

本发明提供的培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法，是将所述基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物；所述谷蛋白含量降低植物为籽粒中成熟谷蛋白含量显著低于正常型的植物；所述谷蛋白含量正常的转基因植物为籽粒中成熟谷蛋白的含量与正常型相当的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入成熟谷蛋白含量降低的植物中；所述成熟谷蛋白含量降低的植物可为T5390。 

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。 

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可 以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。 

有益效果： 

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的植物谷蛋白运输储藏相关蛋白的基因OsVps9a。本发明的植物谷蛋白转运储藏相关蛋白影响植物的囊泡运输过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物种子中谷蛋白的囊泡运输过程的障碍，并影响其剪切成熟，从而可以培育囊泡运输变异的转基因植物和植物成熟谷蛋白含量降低的转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以培育成熟谷蛋白含量正常的植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。 

附图说明

图1为野生型日本晴和突变体T5390蛋白质电泳图比较。 

图2为野生型日本晴和突变体T5390的成熟种子外观比较。 

A显示日本晴具有半透明的胚乳，B显示T5390胚乳是不透明的。 

图3为野生型日本晴和突变体T5390的发育中胚乳细胞中超细微结构的比较。 

图4为野生型日本晴和突变体T5390的发育中胚乳细胞中谷蛋白分布的比较(免疫胶体金)。 

图5为野生型日本晴和突变体T5390的发育中胚乳细胞中谷蛋白分布的比较(免疫荧光)。 

图6为野生型日本晴和突变体T5390的蛋白质储藏液泡大小比较(免疫荧光)。 

图7为精细定位示意图。 

图8为OsVps9a基因示意图，显示T5390中突变形式。 

图9为转基因植株进行PCR分子检测结果。 

泳道1为T5390的突变体，泳道2为日本晴，泳道3-5为转化获得的3株转pCAMBIA1305-OsVps9a植株。 

图10为转pCAMBIA1305-OsVps9a的植株发育中种子的超细微结构观察。 

图11为转pCAMBIA1305-OsVps9a的植株的成熟种子外观。 

图12为转pCAMBIA1305-OsVps9a的植株的蛋白质电泳图。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 

实施例1、植物种子谷蛋白转运储藏相关蛋白及其编码基因的发现 

一、水稻成熟谷蛋白降低突变体T5390的成熟谷蛋白含量分布分析及遗传分析 

在粳稻品种日本晴突变体库中(来自中国农业科学院)，利用蛋白质电泳分析，筛选得到了一个种子中成熟谷蛋白含量降低的株系，同时其谷蛋白前体相比正常型显著的增加，命名为T5390。 

与日本晴比较，T5390的主要特征是：种子中成熟谷蛋白含量下降(见图1)，伴随谷蛋白前体大量积累，同时具有种子不透明的表型，见图2。A图显示日本晴具有半透明的胚乳，B图显示T5390胚乳是不透明的。 

对发育中胚乳进行的透射电镜观察发现T5390中储存成熟谷蛋白的二型蛋白体相对日本晴(图3A)的大小显著的变小，并且二型蛋白体的外形也发生了变化，具有高度不规则的外形(图3B)。同时，T5390的胚乳细胞中还出现了很多来源未知的聚集体(图3C)。利用免疫胶体金对谷蛋白进行标记，结果显示，T5390中的谷蛋白除了分布在变小的二型蛋白体中(图4B)，还存在于细胞壁附近和新出现的大的聚集体中(图4C)。利用免疫荧光技术，同样观察到T5390(图5B)中的二型蛋白体的显著的变小(平均面积只有日本晴<图5A>的53.4％)，谷蛋白除了存在于二型蛋白体中还沿着细胞壁分布，聚集体中也分布了大量的谷蛋白(图5B)。水稻胚乳细胞中，谷蛋白须被最终运送到蛋白质储藏型液泡中形成二型蛋白体。我们利用α-TIP蛋白的抗体标记了水稻蛋白质储藏型液泡，发现T5390(图6B)中的蛋白质储藏液泡的大小亦显著的小于日本晴(图6A)。所以，微观观察数据表明在T5390突变体胚乳细胞中谷蛋白的存储形式发生了大幅度的改变，部分谷蛋白没有被正确的运送到蛋白质储藏型液泡中。谷蛋白的剪切成熟须在蛋白质储藏型液泡/二型蛋白体中完成，因此，推断T5390中因为囊泡运输过程的障碍，谷蛋白不能全部成功运输到二型蛋白体中，而以前体形式存在于细胞壁附近和聚集体中，因此，成熟的谷蛋白的含量大幅的下降。 

二、突变基因定位 

1、突变基因初步定位 

用日本晴的花粉给T5390进行了人工辅助授粉，所得种子中成熟谷蛋白含量正常，用T5390的花粉给日本晴进行人工辅助授粉，所得种子中成熟谷蛋白含量也表现正常。所得F1自交后，后代中正常型和突变型的种子符合3∶1的分离比例，因此，T5390中成熟谷蛋白降低的表型是 由单个隐性核基因控制的。 

用突变体T5390与籼稻品种9311(来自南京农业大学水稻所种质资源库)杂交，在T5390/9311的F₂种子中利用蛋白质电泳分析挑选出10个具有成熟谷蛋白含量下降的单株，提取各株的叶片中的基因组DNA，利用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对10单株进行连锁分析，将谷蛋白运输储藏蛋白相关基因gpa2(glutelin precursor accumulation 2)定位在第4染色体上标记RM3467和RM RM14764之间。 

上述SSR标记分析的方法如下所述： 

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下： 

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。 

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4M NaCl，0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。 

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。 

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。 

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。 

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。 

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。 

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。 

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。 

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman Instrument Inc.U.S.A)。 

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增； 

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O 5.1ul，共10ul。 

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。 

(3)SSR标记的PCR产物检测 

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。 

2、突变基因精细定位 

根据初步定位的结果，在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记。用F₂群体中的成熟谷蛋白含量下降的单株验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体基因。从T5390/9311衍生的F₂分离群体中挑出确认为成熟谷蛋白含量下降的单株650株(用于突变基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR分子标记对突变基因进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变基因，具体方法如下： 

SSR标记开发： 

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5)：808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在T5390和9311之间的多态性，表现多态者用作精细定位gpa2基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。 

表2用于精细定位的分子标记 

引物	前引物	后引物	所属BAC
				L-1	GCGATCTTGCTTCTACTTTGTC	TTAGTTGCTCTGCGGCTCT	OSJNBb0096L14
L-2	GTGATTAAACAAACCCTACTACGGGAACT	GCGACCATCCAGAGCGTGAA	OSJNBa0030J04
				L-3	AATGTCCGTGCGTTGTAA	ATCCCCGTGTATGAGGTG	OSJNBa0032019
L-4	TTGGGTAAAGTTTCAGGG	AGACGCATAGACCGAACA	OSJNBb0014A21
				L-6	TAAACCAAAGGGAACCAAAT	GAAGTCCAGAGGCAACACC	OSJNBa0045E22
L-7	GTTGCCTGAAGCCAGAAGA	GCGAACCAGCACTCATAGC	OSJNBa0019J12
				L-8	ATCAACAGAACAGCCACCG	TCGCTACTAGATGCACGACAA	OSJNBa0085M22
L-10	TTTTCCTCGTGTCTCCTTTGG	TCGGTTCGTGCTGCATGTTT	OJ1012B02
				L-12	GTTCGCCTGCTCGTCAAGT	ATGATGCGGGCTTTCGTG	OJA1364E02
L-16	GCGATTTCCTCCATAACTG	AACAAGAACTACCAAGCCATA	OJ1041F02

[0083] 

L-17

TTTCTTTGTTTGCCTCCC

TCTCGGATTCCTATAAGTTTGT

OJ1041F02

最终把gpa2基因精细定位在标记L17和L18之间，这两个标记位于同一BAC克隆OJ1041F02上，物理距离约为42kb(图7)。 

(3)突变基因的获得 

经过对42kb区间内的测序，发现了gpa2基因存在一个单碱基的突变(图8)， 

根据网上公布的序列设计引物，序列如下所述： 

primer1：5’CGACCCTTGACTTCCTCCC 3’(SEQ ID NO.4)； 

primer2：5’GAGAATGACCCGCCGTTG  3’(SEQ ID NO.5)。 

以primer1和primer2为引物，以日本晴的发育中胚乳cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后连接到pMD18-T(日本Takara公司上)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。 

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码480个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为OsVps9a，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsVps9a。 

实施例2、转基因植物的获得和鉴定 

一、重组表达载体构建 

以日本晴(来自南京农业大学水稻所种质资源库)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsVps9a基因，PCR引物序列如下： 

primer3： 

5’AATTCGAGCTCGGTACCCGGGCGTAGTGGCTTATTGCTCCCTGAT 3’ 

(SEQ ID NO.6)； 

primer4： 

5’CGACTCTAGAGGATCCCCGGGCACTGTACGGGTTGTTGAATGAGAC 3’ 

(SEQ ID NO.7)。 

上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的上游2kb和下游1.5kb，扩增产物包含了该基因的 启动子部分，将PCR产物回收纯化。采用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1305中。 

INFUSION重组反应体系(10μL)：PCR产物1.0μL，pCAMBIA13056.0μL，5×infusion buffer 2.0μL，infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴15分钟，而后50℃水浴15分钟，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.3所示基因的重组表达载体，将含有OsVps9a的pCAMBIA1305命名为pCAMBIA1305-OsVps9a，OsVps9a基因片段利用INFUSION重组试剂盒(日本Takara公司)插入到该载体的SamI酶切位点之间。。 

二、重组农杆菌的获得 

用电击法将pCAMBIA1305-OsVps9a转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1305-OsVps9a。 

用pCAMBIA1305作为对照载体转化农杆菌EHA105菌株，方法同上，得到转空载体对照菌株。 

三、转基因植物的获得 

分别将EH-pCAMBIA1305-OsVps9a和转空载体对照菌株转化水稻成熟谷蛋白含量降低 

突变体T5390，具体方法为： 

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1305-OsVps9a(或转空载体对照菌株)16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液； 

(2)将培养至一个月的T5390水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天； 

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)； 

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次； 

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天 继代一次； 

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化； 

得到分化成苗的T₀代阳性植株。 

四、转基因植株的鉴定 

1、PCR分子鉴定 

本研究中利用dCAPS标记鉴定转基因植株。引物设计：根据T5390和日本晴在SEQ ID NO.1中的差异通过“dCAPS Finder 2.0”软件设计错配的PCR引物创造酶切位点，同时运用Primer Premier 5.0软件设计对应的另一条引物。引物序列如下： 

Primer5： 

5’CTGAAAACTTGGATATCAATCTA 3’(SEQ ID NO.8)； 

Primer6： 

5’TGAAAGGTTCTGCACTGTAA 3’(SEQ ID NO.9)。 

dCAPS标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer3(10pmol/ul)2ul，Primer4(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。 

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所调整)45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。 

PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物经XbaI(日本takara公司)酶切消化过夜后，用8％的非变性PAGE胶分离，银染。 

结果表明获得6株PCR检测阳性的植株。见图9，图9中泳道1为T5390的突变体，泳道2为日本晴，泳道3-5为转化获得的3株转pCAMBIA1305-OsVps9a植株。T5390的条带为120bp，日本晴由于引入了酶切位点，经酶切处理后，得到100bp的片段。四个转基因株系因为含有T5390背景片段和转入的日本晴片段，显示为杂合带型，同时具有100bp和120bp两条电泳条带。 

2、表型鉴定 

分别将T₀代转pCAMBIA1305-OsVps9a植株、T₀代转空载体对照植株、T5390和日本晴种植在南京农业大学牌楼种植基地网室内，分别取四份水稻材料花后10天的种子(T₀代转pCAMBIA1305-OsVps9a植株的自交种会出现分离，故取样时须经过蛋白质电泳分析选取谷蛋白含量正常的种子)，在含有4％戊二醛的磷酸盐缓冲液中固定，经过透射电镜观察，发现转 pCAMBIA1305-OsVps9a植株种子中二型蛋白体的大小恢复到日本晴中二型蛋白的大小，并且由于突变产生的聚集体消失，细胞壁附近亦没有颗粒状的谷蛋白分布(图10)。而转入空载体对照的植株，突变表型没有得到恢复。 

种子成熟后，收取各材料种子，观察到pCAMBIA1305-OsVps9a植株的种子中出现了透明的种子(图11，其中L1、L2、L3是三个不同的转基因株系)，进一步的蛋白质电泳分析显示，转入pCAMBIA1305-OsVps9a的T5390种子的成熟谷蛋白的含量上升至正常水平(图12，其中L1、L2、L3是三个不同的转基因株系)。因此证明T5390中的突变表型是由OsVps9a的突变造成的。pCAMBIA1305-OsVps9a可以使T5390株系的成熟谷蛋白增加至正常水平。 

Claims (10)

1.一种谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVps9a，是如下(a)或(b)所述的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物谷蛋白转运储藏相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因OsVps9a。

3.根据权利要求2所述的基因OsVps9a，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)所述的DNA分子：

1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白OsVps9a的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物植物谷蛋白转运储藏相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1305载体的酶切位点SmaI之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.一种培育成熟谷蛋白含量正常转基因植物的方法，其特征是将权利要求2或3所述基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，得到成熟谷蛋白含量正常转基因植物；所述成熟谷蛋白含量降低的植物是种子中成熟谷蛋白含量降低，并伴随谷蛋白前体增加的植物；所述成熟谷蛋白含量正常的转基因植物为成熟谷蛋白和谷蛋白前体含量均正常的转基因植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入成熟谷蛋白含量降低的植物中。

10.一种培育成熟谷蛋白含量降低的转基因植物的方法，是抑制目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，得到成熟谷蛋白含量降低的转基因植物；所述目的植物为携带权利要求2或3所述基因的植物。

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