CN102618510B - 一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的植物雄性育性相关蛋白影响植物的花药开裂过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物雄性育性降低，并影响其结实率，从而可以培育雄性花药不开裂变异的转基因植物和植物雄性不育系转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入雄性不育植物中，可以培育雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻花药的开裂特性是通过控制柱头上萌发的花粉量来影响植株的花粉育性，是影响水稻结实率的一个重要因素。在水稻籼粳杂种F1植株普遍存在较严重的花药不开裂障碍，主要表现为部分花药的一个或两个药室在开花时不开裂，其花药表皮细胞形状不规则，膨大也不够充分。从解剖学方面分析，花药不能正常开裂的原因有几方面，一是亚种间组合部分花药的“药室间组织间隙”未充分发育，药隔维管束细胞结合紧密牢固，开颖时药室开裂困难造成部分花药的传粉障碍。二是发现花药的“药室间组织间隙”发育不够完善，致使该杂种的成熟花药不能很好地开裂。此外，还发现杂种花药中的核糖体状颗粒会引起成熟花粉粒相互聚集，使其不利散粉。三是植株的裂药性受花粉不育基因互作控制，不同杂合座位内等位花粉不育基因互作导致杂种F1花药不开裂的程度不同，不同杂合座位间非等位花粉不育基因互作明显降低杂种F1的裂药程度，杂种F1中含杂合花粉不育基因座位数越多，其裂药指数越小，裂药程度越低。杂种F1花药不开裂的原因随其所含的杂合花粉不育基因座位种类和数目不同而异，总起来看主要包括：药室退化、花药缺乏裂腔或形成的裂腔小、药室严重畸形以及形成的“弹簧”弱等；此外，大量败育花粉的产生也可能是引起杂种F1花药不开裂的原因之一。

对于水稻这种自花授粉植物而言，在花药发育后期必须经历一下三个时期才能顺利完成开花授粉：一是花药能够正常裂药，使成熟的花粉粒释放在柱头上；二是成熟的花粉粒能和柱头亲和以及花粉粒在柱头上萌发；最后是萌发的花粉管能伸长至胚囊中释放2个精细胞，完成双受精的过程。花药的正常开裂是开花植物受精的第一步，在这个发育过程中，有许多的因素影响着花药的开裂。其中植物激素就涉及到花药的裂药、花粉的萌发和双受精等过程。如植物激素生长素就是植物生长发育调控的核心激素，生长素含量过高或过低都会对植物的生长发育产生不利影响，特别在花药的开裂以及花粉的萌发和生长。因此在水稻花药合成的生长素的浓度必然要求有相应的机制严格控制它的含量。否则将导致植株的雄性不育出现。目前，水稻花药开裂的机制并不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物雄性育性相关蛋白。

本发明的另一目的是提供该蛋白的编码基因与应用。

本发明提供的植物雄性育性相关蛋白(OsRad1)，来源于稻属水稻(Oryza sativa var.日本晴)，具有如(a)或(b)所示的氨基酸残基序列：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加衍生得到的与植物雄性育性相关的蛋白质。

序列表中的序列1由300个氨基酸残基组成，自第149至251位为2酮戊二酸-Fe²⁺加氧酶(2OG-FeII Oxy)结构域。

为了使(a)中的OsRad1便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的OsRad1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsRad1的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述植物育性相关蛋白的基因(OsRad1)也属于本发明的保护范围。

所述基因优选为如下1)或2)或3)所述的DNA分子：

1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305.1载体的EcoRI重组位点插入所述基因(OsRad1)得到的重组质粒。将含有OsRad1的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsRad1。

含有以上任一所述基因(OsRad1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsRad1)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述的引物对优选Primer1/Primer2、Primer3/Primer4或Primer5/Primer6。

有益效果：

本发明的植物雄性育性相关蛋白影响植物的花药开裂过程。抑制该蛋白编码基因的表达可导致植物雄性育性(花粉育性和小穗育性)降低，并影响其结实率，从而可以培育雄性花药不开裂变异的转基因植物和植物雄性不育系转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入雄性不育植物中，可以培育雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。。

附图说明

图1为野生型日本晴和突变体Rad1的开花期颖壳开裂比较。

图2为野生型日本晴和突变体Rad1的开花期花药开裂比较。

A、C为野生型日本晴的花药；B、D为Rad1为突变体的花药。

图3为野生型日本晴和突变体Rad1的成熟花粉育性和花粉萌发比较。

图4为野生型日本晴和突变体Rad1花粉管在柱头上的萌发和胚囊中的生长比较。

a、c为野生型；b、d为突变体Rad1。

图5为野生型日本晴和突变体Rad1胚囊发育比较。

a-d，i-l为野生型的胚囊，e-h，m-p为突变体的胚囊发育。

图6为野生型日本晴和突变体Rad1种子发育过程和含糖量比较。

图7为突变基因在第4染色体上的精细定位。

图8为转基因植株进行PCR分子检测结果。

泳道18为以pCAMBIA1305.1-OsRad1质粒为模板扩增作为正对照，泳道19为未转入OsRad1的突变体DNA为模板扩增作为负对照，除了10、11、12外，其余为转化获得的14株转pCAMBIA1305.1-OsRad1植株。

图9为转pCAMBIA1305.1-OsRad1的T0代植株颖壳和花药的开裂。

A为颖壳，B为花药。

图10载体pCAMBIA1305.1质粒图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物雄性育性相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻不育突变体Rad1的育性分析及其遗传分析

在粳稻品种日本晴(水稻全基因组测序材料)的辐射诱变的大田中发现的一株颖壳和花药不开裂的的水稻植株Rad1，该突变体表型能够稳定遗传，其与野生型杂交在分离后代出现了可育与不育两种类型的分离，通过遗传分析为单隐性基因所控制。此外，利用外源激素生长素处理日本晴能获得突变体的表型。

与日本晴比较，突变体的主要特征是：营养生长和花器官发育基本正常，具有6个雄蕊和1个雌蕊。但在抽穗后，突变体的小花不能张开，不能使突变体的花丝伸张出来，柱头也不能外露出来(见图1)，在体视镜下观察到突变体的花药不能正常开裂，使花粉粒从药室中散落出来，用扫描电镜观察也得到一致的结果(见图2)。

用1％的碘-碘化钾和DAPI染料对野生型和突变体的花粉进行染色，结果表明野生型和突变体的花粉粒的淀粉能够正常形成，花粉粒后期的3核细胞也能够正常形成，初步表明野生型和突变体的花粉育性没有差异；但在固体培养基上，野生型的花粉能够正常萌发和生长，但突变体的花粉粒不能正常萌发和生长(见图3)，该结果表明突变体的花粉不能萌发是导致其败育的主要原因之一。用激光共聚焦显微镜对野生型和突变体的花粉在柱头上的萌发和生长进行观察，野生型的花粉能在自身柱头上萌发和生长，花粉管能生长到胚珠，分别与卵细胞和极核完成双受精的过程；突变体的花粉不能在自身的柱头上萌发和生长，也就不能完成双受精(见图4)。

另外，利用激光扫描共聚焦显微技术对野生型和突变体的胚囊发育进行详细的观察，结果发现在胚囊成熟时期以前，野生型和突变体的胚囊发育没有差异，突变体的成熟的胚囊具有7个细胞8个核的结构，该结果表明突变体的胚囊是正常的。由于突变体的花药不能正常开裂，花粉不具备萌发能力，导致突变体的胚囊不能正常授粉受精，但突变体子房能够发育膨大导致突变体的胚囊在后期单性结实(见图5)。随后，对野生型和突变体籽粒的蔗糖和淀粉含量进行了测定，结果表明由于突变体的胚乳细胞器不能正常形成，光合作用的产物蔗糖不能转化成淀粉，在突变体的籽粒中也就没有淀粉的积累和形成(见图6)。

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

用突变体Rad1与广亲和品种Dular(来自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)杂交，在Rad1/Dular的F₂分离群体中随机选取花粉半不育单株20株及可育单株20株，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成1个半不育混合基因组池和1个可育混合基因组池。用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对不育池和可育池及Rad1和Dular进行多态性分析，将花粉不育基因Rad1(rice anther dehiscence 1)定位在第4染色体上标记Z425和Z429之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2.0ml Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4M NaCl，0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Beckman Instrument Inc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂ free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O 5.1ul，共10ul。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记。用F₂群体中的不育单株验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体基因。从Rad1/Dular衍生的18000株F₂分离群体中挑出确认为隐性的单株2100株(F₂群体中的突变株表型的水稻植株)用于突变基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变基因进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变基因，具体方法如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5)：808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物，并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在Rad1和Dular之间的多态性，表现多态者用作精细定位pss1基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。

表2用于精细定位的分子标记

(2)InDel标记开发

InDel引物设计：对Dular在Rad1基因所在位置附近的部分区段进行测序，并与日本晴相对应的序列进行比对，发现两者之间存在的SNPs，以这些SNPs为基础用软件设计InDel标记，同时运用Primer Premier 5.0软件设计对应的另一条引物，见表2。

InDel标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂ free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所调整)45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。

PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物酶切消化过夜后，用1-4％的琼脂糖凝胶中电泳分离，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。dCAPS用8％的非变性PAGE胶分离，银染。

根据F₂群体中抽穗期单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法计算基因位点与标记位点之间的重组率c，即c＝(N₁+N₂/2)/N，其中N表示被调查不育个体总数，N₁表示出现显性基因携带亲本纯合带型的单株个体数，N₂表示出现两亲本杂合带型的单株个体数。最终把Rad1基因精细定位在标记Z425和Z429之间，Rad1基因距标记Z425和Z429的物理距离约为52kb(图7)。

(3)突变基因的获得

根据定位的位点设计引物，序列如下所述：

primer1(下划线所示的序列为EcoRI重组位点)：

5’-CCATGATTACGAATTCCCTTTTCATAATCAGACAGAGA-3’(SEQ ID NO.4)

primer2(下划线所示的序列为EcoRI重组位点)：

5’-TACCGAGCTCGAATTCCGTAGAGTAGCATAGTGGCATC-3’(SEQ ID NO.5)

以primer1和primer2为引物，以日本晴的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。该对引物位于SEQ ID NO.2上游3.2kb和下游1.6kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分。

扩增反应用KOD酶扩增(购自TOYOBO公司)，在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃2min；98℃10sec，60℃30sec，68℃10min，35个循环；68℃20min。将PCR产物回收纯化后重组(In-

HD Cloning Kit重组试剂盒，Takara公司)克隆到载体pCAMBIA1305.1载体上(CAMBIA是一个独立的、非营利的国际研究组织))，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金公司Trans10)，挑选阳性克隆后，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码300个氨基酸残基组成的蛋白质(见SEQ ID NO.1)。将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为OsRad1，将编码SEQ ID NO.1所示的蛋白的基因命名为OsRad1。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以日本晴(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsRad1基因，PCR引物序列如下：

primer1(下划线所示的序列为EcoRI重组位点)：

5’-CCATGATTACGAATTCCCTTTTCATAATCAGACAGAGA-3’(SEQ ID NO.4)

primer2(下划线所示的序列为EcoRI重组位点)：

5’-TACCGAGCTCGAATTCCGTAGAGTAGCATAGTGGCATC-3’(SEQ ID NO.5)

上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的上游3.2kb和下游1.6kb，扩增产物包含了该基因的启动子部分，将PCR产物回收纯化。采用In-

HD Cloning Kit重组试剂盒(Takara公司)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1305.1(图10)中。

采用In-

HD Cloning Kit重组试剂盒(Takara公司)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1305.1中。

In-Fusion重组反应体系(10μL)：PCR产物10-200ng，经EcoRI酶切回收pCAMBIA1305.1载体50-200ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，Deionized water to 10μL。枪头吹打混匀后将混合体系50℃反应15min后置于冰上，取2μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金公司；Trans10)。将全部转化细胞均匀涂布在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养12-16h，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.3所示OsRad1基因的重组表达载体，将含有OsRad1的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsRad1。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pCAMBIA1305.1-OsRad1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1305.1-OsRad1。

三、转基因植物的获得

将EH-pGD625-OsRad1转化水稻育性突变体Rad1，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pGD625-OsRad1 16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的Rad1水稻(利用外源激素生长素IAA(10^-2mol)处理日本晴，也能得到突变体的表型)成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(Phyto Technology Laboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；

得到分化成苗的T₀代阳性植株。以转pCAMBIA1305.1空载体的突变体Rad1为阴性对照。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR分子鉴定

将步骤三获得的T₀代阳性植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用pCAMBIA1305.1上SEQ ID NO.3插入位点左边界附近的引物Primer3和SEQ ID NO.3上的引物Primer4作为引物对进行扩增(Primer3：5’-TTAGGCACCCCAGGCTTTAC-3’(SEQ ID NO.6)和Primer4：5’-ACAAATAGGGATAACTTAGCACA-3’(SEQ ID NO.7))，扩增长度882bp。同时利用序列3上的引物Primer5和pCAMBIA1305.1上序列3插入位点右边界附近的引物Primer6作为引物对进行扩增(Primer5：5’GAGAAGAGCAGCGGACTACAGA 3’(SEQ ID NO.8)和Primer6：5’-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’(SEQ ID NO.9))，扩增长度1077bp。PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测。结果表明获得14株PCR检测阳性的植株。见图8，图8中泳道18为以pCAMBIA1305.1-OsRad1质粒为模板扩增作为正对照，泳道19为未转入OsRad1的突变体DNA为模板扩增作为负对照，除了10、11、12外，其余为转化获得的14株转pCAMBIA1305.1-OsRad1植株。

2、表型鉴定

分别将T₀代转pCAMBIA1305.1-OsRad1植株、Rad1突变体和日本晴种植在南京农业大学水稻试验站，水稻植株在开花时，观察野生型和突变体和转基因植株的颖壳开裂以及花药的开裂情况，见图9。

日本晴的花药开裂为98％，小穗育性为95％。14株转pGD625-Rad1植株中，7株的花粉开裂正常，对应的小穗育性达到85％以上，与日本晴的结实率相当。转空载体对照的突变体Rad1花粉不开裂，小穗育性为0，仍然表现为不育。验证了转基因前的雄性不育性状是由Rad1基因控制的，即该Rad1基因为雄性育性相关基因。

Claims (4)

1.SEQ ID NO.1所示的蛋白在培育雄性可育转基因水稻中的应用。

2.SEQ ID NO.2所示的基因在培育雄性可育转基因水稻中的应用。

3.含有SEQ ID NO.2所示的基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系中的至少一种在培育雄性可育转基因水稻中的应用。

4.一种培育雄性不育系转基因水稻的方法，是抑制目的水稻中SEQ ID NO.2所示的基因的表达，得到雄性不育系转基因水稻；所述目的水稻为携带SEQ ID NO.2所示的基因的水稻。

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