CN105441456B - 一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b及制备方法和应用，其步骤：A、利用该基因的CDS核苷酸序列，或启动子核苷酸序列，或者编码的氨基酸序列设计开发出能扩增出该基因的引物，合成。B、利用合成的引物，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因或任何感兴趣的一段核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。方法易行，操作简便，利用引物扩增该基因，将其克隆到各种载体中，转化到甘蓝型油菜可导致稳定彻底的雄性不育并进行育种利用，利用该基因本身的序列设计特异引物，用于分子标记辅助选择，具有快速，经济，有效和准确的特点。

Description

一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用

技术领域

本发明属于油菜分子育种技术领域。更具体涉及一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b，同时还涉及一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b的制备方法，还涉及一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b的应用。本发明涉及的一个和雄性不育相关的复等位位点：Bnms4^a为恢复基因， Bnms4^b为不育基因，Bnms4^c为空等位基因，其显隐性关系为：Bnms4^a>Bnms4^b>Bnms4^c。不育基因Bnms4^b的克隆、验证和应用不仅可以加快甘蓝型油菜的隐性细胞核雄性不育系和临保系的选育，而且以此为基础可以创建其他十字花科植物的核不育系统，例如，将不育基因Bnms4^b转化到拟南芥中可以获得稳定的不育材料，并且这种不育材料可以被BnMs3稳定的恢复。

背景技术

油菜杂种优势利用关键在于优良的授粉控制系统和双亲之间是否可以获得具有一定生产潜力的杂交种。优良的授粉控制系统主要有雄性不育，自交不亲和，化学杀雄等。在甘蓝型油菜中以雄性不育应用得最为广泛。油菜雄性不育主要有细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。目前，世界上用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、kos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统(傅廷栋，杂交油菜的育种与利用，湖北科学技术出版社，2000)，虽然波里马在目前的油菜育种应用中占有重要的地位，但是细胞质雄性不育的自身缺点并没有被完全克服，主要表型为育性受温度影响较大，不稳定，恢复系来源较为狭窄，容易产生不良的胞质负效应，制种风险较大，其应用受到了一定程度的限制。

相对于油菜细胞质雄性不育系统，隐性细胞核雄性不育系统有诸多天生的优点，主要表现为败育彻底，育性稳定，恢复源广，无不良胞质负效应，且有的核不育类型能获得全不育制种群体而具有良好的应用前景。S45A(潘涛等，1988)和117A(侯国佐等，1990)是两对隐性基因控制的核不育系的典型代表，由其选育而来的杂交种中已审定的有“蜀杂6号”、“蜀杂7号”、“油研7号”、“油研8号”和“油研9号”等，该系统主要缺点是不育系中存在50％的可育株，在制种时需要在初花期拔掉50％的可育株，由此不仅增加了制种的成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。本课题组克隆了S45AB 系统的恢复基因BnCYP704B1，并将该基因及其育种应用申请了专利保护(涂金星等，2009)，提出了利用花粉发育特异时期的启动子与致死基因Bax相连，再连恢复基因BnCYP704B1 的智能核不育系统的创建思路：花药发育的时期，致死基因表达，将含有恢复基因 BnCYP704B1的花粉粒杀死，存活的只有隐性不育的花粉粒，用来大面积繁殖不育系，获得 100％的不育群体，为隐性核不育的育种应用提供了新的思路。另外，美国和加拿大利用烟草的TA29基因的启动子和核糖核酸水解酶(barnase)基因构建成融合基因转化甘蓝型油菜，人工创造了新的核不育材料，并通过向该材料中导入抗除草剂基因后达到了机械化作业。但是该系统的不足之处是必须对不育系和恢复系都进行转基因，该系统目前也受到专利的保护。这些创新性的育种系统的构建，说明了隐性核不育在油菜育种中具有广阔的前景，也说明了隐性核不育是未来油菜育种的主导系统。

另一种类型的隐性核不育系统主要有9012A(陈凤祥等，1998)和7365A(Huang etal., 2007)，它们均属于隐性上位互作核不育类型，Zu等(2010)通过定性的遗传分析和基因定位将它们的遗传模式修正为两个位点控制的复等位遗传模式，一个位点是BnMs3/Bnms3，另一个位点是复等位位点Bnms4^a>Bnms4^b>Bnms4^c Xia et al.,2012)。本课题组克隆了BnMs3 基因(Dun et al.,2011),根据其拟南芥的同源基因将其命名为BnaC.Tic40，并申请了该基因以及其育种应用专利保护(涂金星等，2011)。由于该系统特殊的遗传模式，育种家可以直接将临保系与不育系杂交获得100％的全不育系群体，而不需要拔出50％可育株，大大节省了制种成本。用该系统选育的品种中，已审定的杂交种有“皖油14号”、“皖油18号”(陈凤祥等，2002；2003)和“沪油杂1号”(孙超才等，2004)等等，临保系的成功选育是油菜隐性核不育系统在育种研究领域取得的重大进展。但是这个系统遗传基础复杂、临保系选育困难，不利于选育强优势组合。克服这些缺点的可行性策略是建立不育恢复基因和上位基因的分子标记体系，进一步克隆Bnms4^a>Bnms4^b>Bnms4^c这三个复等位基因，利用分子标记实现不育系和临保系的定向选择。同时，对这三个复等位基因的克隆，有助于更清楚地了解隐性核不育的机理，为更好地应用这一极具潜力的育种系统提供帮助。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b，该基因来自于甘蓝型油菜，为一个细胞雄性核不育基因，可以使多种植物产生雄性不育的表型，该雄性不育具有败育彻底，无不良胞质负效应的特定，可以用于植物的杂种优势利用，利用Bnms4^b基因使临保系(基因型为Bnms3ms3ms4^cms4^c)变为不育，或作为核不育系，恢复系和临保系选育的分子标记，以加快甘蓝型油菜核不育系和临保系的选育，或使用这两个基因构建其他十字花科植物的核不育系统，用于杂交育种。

本发明的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b的制备方法，方法易行，操作简便，利用本发明保护的基因的序列可以直接设计克隆该基因的引物，实现快速制备克隆该基因的目的，具有经济，有效的特点。

本发明再一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b在甘蓝型油菜的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，将该基因克隆到各种载体中，并加以利用，同时还可以利用该基因本身的序列设计特异引物，用于分子标记辅助选择，具有快速，经济，有效和准确的特点。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b的制备方法，其步骤是：

A、利用该基因的CDS核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.3设计开发出能扩增出该基因的引物，并送引物合成公司合成，或者合成探针。

B、利用合成的引物，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。也可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。

通过以上技术克隆了该基因，将该基因克隆到表达载体中，转化甘蓝型油菜7365C以及野生型Col-0型中均可以导致稳定彻底的雄性不育(图7，图8)，这种雄性不育可以被BnMs3恢复。这样的一个育性转换系统可以用于植物的杂种优势利用中。

申请人通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到一种分离甘蓝型油菜核不育基因 Bnms4^b，其CDS序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该基因的启动子序列为SEQID NO.2所示的核苷酸序列。该基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA 和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。通过上述技术方案获得了二个核苷酸序列和一个氨基酸序列，将基因克隆到载体中获得含有该基因的遗传转化载体，利用农杆菌介导的遗传转化将其转化到野生型Col-0型拟南芥和油菜7365C中，都可以获得雄性不育的表型(图7和图8)。该基因编码的蛋白质可能是通过引起绒毡层质体的功能异常，导致的雄性不育(图9)。

一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b在甘蓝型油菜以及其他十字花科植物的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，其步骤是：

A、本发明为甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良提供了新用途，利用该基因的CDS 核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.3设计开发出能扩增出该基因的特异引物；

B、进行分子标记辅助选择，其中包括作为恢复甘蓝型油菜核不育系的育性；

C、导致临保系的不育，或作为新核不育系，恢复系与临保系选育的分子标记，或者设计引物扩增出该基因，将该基因克隆到表达载体中，进行不同植物的遗传转化，得到雄性不育的植株，构建核不育系统，用于杂交育种。其他作物包括利用Bnms4^b可以导致雄性不育的其他十字花科植物：白菜，甘蓝，拟南芥，利用方式和甘蓝型油菜相同，都是利用其可以导致雄性不育的特点。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

根据本发明中报道的序列开发的引物，具有非常特异，以及准确的特点，由于不育基因即为Bnms4^b，再利用该基因的序列进行的所有分子标记辅助选择，或者克隆该基因进行不育系统的创建都具有经济，快速，有效的特点。利用该发明保护的基因可以快速地使植物导致雄性不育，并且可以应用到杂交育种中去，免去了再杂交育种中要大面积大范围地寻找稳定彻底的雄性不育系的困难，可以随意创建植物的雄性不育系，对于那些还没有在自然界发现天然的雄性不育的植物来说，无疑是一项革命性的成果。由于其为细胞核雄性不育基因，且已经在拟南芥和油菜中可以导致完全彻底的雄性不育，因此利用它在其他十字花科植物的不育系统的创建将可以推动其他十字花科植物的杂交育种技术发展，为培育具有杂种优势的农作物产品提供很好的前提条件。

附图说明

图1为一种覆盖甘蓝型油菜核不育基因Bnms4区段的物理图谱。

图示Bnms4^b定位于7365A的N07染色体上，利用5050个单株将Bnms4^b定位于左右最近的分子标记CL14和DD42锁定的82kb的范围内，括号里的数字代表着该标记的交换单株，数字越大，说明标记离基因越远，0表示没有交换，标记为共分离标记。下面一排为不同标记之间的物理距离。

图2为一种用标记筛选BAC池中的单克隆菌落。

模板为阳性克隆BAC池稀释一定倍数后长出的单克隆菌落，引物为共分离引物KZJ301。

图3为一种将测序出来的B107和已知的同源BAC序列B80进行序列共线性比对。

横纵坐标分别为B107和B80的98kb序列和93kb序列。

图4为一种利用RACE技术得到候选基因CC2的基因结构图。

图5为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4^b的构建图。

图6为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4^b转化拟南芥后，阳性苗的筛选。

红色圆圈里面为含有整合基因的阳性苗。

图7为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4^b转化Col野生型拟南芥的雄性不育表型。

a图为野生型拟南芥的开放的花；b图为转Bnms4^b基因的拟南芥的开放的花；c图左边为可育的花蕾，右边为转Bnms4^b的不育的花蕾；d图为去掉花被后的花蕾，左边为可育，右边为转Bnms4^b的不育花蕾；e图为野生型拟南芥的成熟角果；f图为转Bnms4^b的不育的角果；g为醋酸洋红染野生型花粉粒，h图为醋酸洋红染转Bnms4^b的不育花粉粒。

图8为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4^b转化甘蓝型油菜7365C的表型图。

a为7365C可育植株的花序；b图为同一生长条件下的转基因油菜植株不育花序；c图左为正常的7365C的单株，叶片浓绿，c图右为转基因的油菜单株，叶片有不同程度的白化发生；d和e也说明了这一结果；f图左为正常的7365C植株，f图右为转基因植株的花蕾，表面有白色斑块；g图和h图为绿色叶片和白化叶片体视显微镜照相的结果；i图和j图为剥掉花被的7365C和转基因植株的花蕾。

图9为一种利用拟南芥原生质体的Bnms4^b编码蛋白质定位在质体中的示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。

实施例1：不育基因Bnms4的精细定位和染色体着陆

一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b的制备方法，其步骤是：

1.实验材料：

用于Bnms4^b基因图位克隆的近等基因系群体为7365AC，由7365A(Huang et al.,Theor Appl Genet.,2007,115:113-118)与7365C(Xiao et al.,2008，Euphytica,164(2):377-384)，然后与 7365C回交，其后代出现了不育与可育的分离，高世代回交后兄妹交保存，该群体的可育和不育分离比为1：1，其中不育单株含有Bnms4^b基因。2009年春天在武汉提取的近等基因系 7365AC中的5050个可育与不育单株的DNA(提取DNA的方法参见：Stewart and Via,1993, 14(5):748-749)，用于基因的精细定位。

2.不育基因Bnms4的精细定位：

根据前面定位的结果，Bnms4^b位于油菜N7连锁群的SCAR(Sequencecharacterized amplified region)标记P4和P7之间(Xia et al.,Theor Appl Genet.,2012,124(7):1193-1200)。即Bnms4^b位点位于P4和P7之间。

设计的P4和P7引物的核苷酸序列如下所示：

P4F正向引物AACTTCTCTCCTCTGCGTCG，

P4R反向引物CCAGCTTCCAATCCGTAGAC；

P7F正向引物TTGAAGGCGTGCTTGGAG，

P7R反向引物TGACTTGGCAGCTTCTACGG。

为了进一步缩小目标基因区域的范围，对Bnms4^b进行精细定位，申请人根据目标区域的序列(以公布的白菜的基因组序列为参考)设计并鉴定出了Bnms4^b的多态性的标记如图 1。分子标记P4和P7在7365AC近等基因系群体的5050个单株中分别检测到15个和31个交换单株，这些单株在两个标记和Bnms4^b基因间发生了重组(图1)。然后用其余的标记对交换单株进行分析，发现两侧最近的分子标记是标记CL14和DD42，两个标记分别有1 个和3个单株在标记与Bnms4^b间表现交换。通过以上精细定位，将Bnms4基因定位在以甘蓝型油菜的基因组序列为参考的82kb范围内，即分子标记CL14和DD42之间，将所有标记整合成Bnms4^b的遗传连锁图谱如图1所示。用于精细定位Bnms4^b的引物的核苷酸序列见表1所示。

表1精细定位Bnms4^b的引物的核苷酸序列

P4F	AACTT TCTCCTCTGCGCG
		P4R	CCAGCTTCCATCCGTAGAC
DD35F	CCATTGGAGATGACATGCTG
		DD35R	TGTCGATTGGTCTAAGGCC
DD24F	CTTCGTTGTGCTTCCTGTC
		DD24R	CACCGTCCGTCACAGATCT
CL14F	TAATGTGTTGACGGCTGAAC
		CL14R	TCGTGTCCATGCATATC
ZUHEF	CGAGCGATCACTCATAATCA
		ZUHE5R	TAGTGGAGTTTCATGGCTAG
DD28F	AGCCGCTTGTTCGTACAGAG
		DD28R	TCGTCGTCTGAATCGCTGTC
SSR103F	CATCCCCATGACGAATCCTT
		SSR103R	AATCTTGTGCCAAAGCCTCG
4F3DF	CCGACAACCACTTAGGCTGT
		4F3DR	GAGCTTCATGGACCAGGTTC
DD20F	ACACGGAACTCAGACGCTAT
		DD20R	TGGCCTCTTAGACTCTCACA
DD42F	GCAAATGTCGTCTCCTCATA
		DD42R	AGGGTTTCTAGGTTACGAAG
SSR110F	GATTACTTGAAAAGAGTCCC
		SSR110R	AGCCATAGTAGCTTTGAGAT
S25F	CATCCGAGAGAAGAGTAGAG
		S25R	TACACAGGAGGTGATCTGAC

引物名称中最后一个英文字母含义分别为：F为正向引物；R为反向引物。

3.BAC文库的构建以及含Bnms4^b的BAC克隆的筛选与测序：

精细定位的结果显示Bnms4^b基因定位在标记CL14和DD42之间，下一步即可将两个目标基因进行染色体着陆，即筛选含有目标基因的BAC克隆。将含有Bnms4^b基因的油菜材料7365A，提取其暗光培养12-15天的幼嫩叶片的核DNA，超声波打断后连到特定载体上，构建出7365A的全基因组BAC(细菌人工染色体，bacterial artifical chromosome,BAC)文库(构建方法，步骤和试剂见Luo et al.,2003，Plant Functional Genomics，236:3–19)，本发明筛选到了1个含Bnms4^b基因的BAC克隆B107(图2)。利用第二代测序技术将其测通，发现B107为98kb(图3)。

从甘蓝型油菜中分离得到一种分离甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b，其CDS序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，序列表SEQ ID NO.1.分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b的CDS核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的不育株7365A。

该基因的启动子其序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO.2.为分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b的启动子核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的不育株7365A。

该基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。序列表SEQ IDNO.3. 为分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b编码的蛋白质的氨基酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的不育株7365A。

实施例2：不育基因Bnms4^b的分离和功能验证

一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b在甘蓝型油菜以及其他十字花科植物(以拟南芥为例)的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，其步骤是：

1.Bnms4^b候选基因的确定与拟南芥油菜转化实验

本实施例中采用的序列比对的程序来自白菜Chiifu-401的基因组网站提供的Blast (http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)软件，对包含Bnms4^b的BAC克隆B107的序列进行分析，从中预测了1个候选基因CC2。通过BAC序列比对分析其他同源基因的CDS序列初步确定候选基因CC2的ORF起始终止位点，开发引物扩增出目标基因的CDS序列，利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术得到CC2基因的5’UTR区域和3’UTR区域(图4)(GeneRacer ^TM kit,For full-length,RNA ligase-mediated rapidamplification of 5’and 3’cDNA ends(RLM-RACE),Catalog nos.L1500-01；L1500-02；L1502-01；L1502-02，来自 Invitrogen公司)。对CC2基因序列进行酶切位点分析，发现其可以不被KpnI和SalI酶切。设计扩增基因全长的引物CC2F(R)，左右引物分别加上SalI和KpnI的酶切位点，利用高保真PCR聚合酶(Phusion^TM High-Fidelity DNA Polymerse,来自NewEngland Biolads公司) 分离基因全长8164bp的序列，将扩增片段克隆到pCAMBIA2300(华中农业大学作物遗传改良国家实验室林拥军教授赠送)载体上，测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取插入片段序列正确的克隆的融合质粒，并转化大肠杆菌DH5α(购自北京全式金公司)，在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，酶切检测准确的克隆所包含的载体就是包含正确CC2全长的融合载体pC2300-CC2(p CAMBIA2300+Bnms4^b)(图5)。将载体质粒通过电转化的方法转导GV3101农杆菌菌株中(本实验室长期保存的菌株)，在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml庆大霉素的固体培养基上挑取单克隆，并进行PCR检测确认阳性克隆后，将该单克隆于-80℃保存起来，用于Col 野生型拟南芥的遗传转化。构建的Bnms4^b候选基因CC2全长载体用农杆菌花序蘸染法转化 Col拟南芥野生型植株(Zhang et al.,2006,Nature Protocols,1:641-646)。在含25mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选转化拟南芥植株的种子，抗性植株根长，子叶和真叶长势较大；非抗性植株根很短，植株矮小，子叶黄化(图6)。植株长到2-4片真叶后移植到土中培养，得到30多株抗性植株。提取阳性植株提取叶片总DNA(制备方法见Stewart et al.,1993, 14(5):748-749)，用pCAMBIA2300载体上存在的NPT-II基因的CDS序列设计的引物NPT-F 和NPT-R通过PCR进一步鉴定转化植株。这30多株经鉴定全部为阳性苗，并且全部表现为雄性不育(图7)，说明候选基因CC2就是Bnms4^b基因，为不育基因。

NPT-F(正向引物):GCCACAGTCGATGAATCCAG，

NPT-R(反向引物):ATGGTGGAGCACGACACTCT；

CC2F(正向引物):GCGGTACCAACCGAACTTTCATATAATCCGAATGGGGC，

CC2R(反向引物):GCGTCGACATATCACCAGCACCAACAGTTTTCTTTTGC；

为了验证CC2在油菜中的功能，将同样的载体pC2300-CC2转化到甘蓝型油菜7365C中。油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法(陈苇等，2006；Cardoza and Stewart，2003)。种子灭菌用70％浓度的酒精浸泡种子15min，0.1％升汞消毒15min，20％～30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。将灭菌的种子播于Medium 0培养基(配方见表2)，于25℃暗培养5d。在超净工作台内将获得的试管幼苗下胚轴切成0.5cm-0.8cm的小段，接种至含有农杆菌(悬浮过夜至对数生长期)的Medium 1上(配方见表2)浸染25min-30 min后，吸干液体，于25℃黑暗条件下共培养2d。将外植体转到Medium 2上的愈伤组织诱导培养基(配方见表2)上，于25℃光照培养21d。在将外植体转入Medium 3上分化培养基培养，每15-18d继代1次，直至分化出幼苗。当幼苗长出生长点时，将幼苗生长点下端切断插入到Medium 4生根培养基上培养。转化植株生根后，种植于混有腐殖土的细土纸杯中，保持70％相对湿度，待根发育稳定后移栽到大田。

提取阳性植株提取叶片总DNA(制备方法见：Stewart et al.,1993,14(5):748-749)，用引物NPT-F和NPT-R通过PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T₀代观察育性的表现，验证导入的候选基因的功能。结果显示在9株转基因T₀代植株中，有6株表现为雄性不育(图8)。这6个植株同时伴随有叶片不同程度发黄的表型，该结果再次证实CC2基因就是Bnms4^b基因。

表2在遗传转化步骤中所用的各种培养基的配方

实施例3：利用恢复基因BnMs3和不育基因Bnms4^b构建十字花科植物(以Col-0的野生型拟南芥为例)的不育材料和对应的保持材料

利用Bnms4^b可以创建其他十字花科植物的细胞核雄性不育系统：白菜，甘蓝，拟南芥，利用方式和甘蓝型油菜相同，都是利用该基因可以导致稳定彻底的雄性不育的特点。

BnMs3基因被本小组成员申请了专利保护(涂金星等，2011)，为7365A的恢复基因。结合此专利的成果，将含BnMs3基因的拟南芥转基因植株(可育，父本)和含Bnms4^b基因的转基因植株(不育，母本)进行杂交，获得同时含有恢复基因BnMs3和不育基因Bnms4^b的Col拟南芥材料，将这样的单株自交后，发现有育性分离的情况。将分离群体中的不育株和含有BnMs3的可育株杂交后继续出现育性分离，说明含有Bnms4^b的拟南芥植株的不育性可以被含有BnMs3的拟南芥植株保持下来。

在本发明所提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明所讲述内容后，本领域的技术人员可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样属于本申请所附的权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用

<130> 一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 4161

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 1

atgctcgctc cccttaaggt cacagaaccg cagatggtcc tattcaatat ccatggaaca 60

cactcctctt caccatttcc tttctcccac cgctgcattc aaaatcgcaa cttgagctcg 120

cgcaagccaa gtttctacaa ttcaatggag ctttgttctt catcctcatc ttctctcctc 180

cgcgtctcac acgaaaaact ctccttctct tcctcaatct ctcaatgcca actaaagccc 240

tcgactttcg ccaaacccag actccgaatc cacgcctccc tcgcatccga gaagactcaa 300

ggcctcccac gagacagccc acaacgcctc ctcaaggagc tagctcagcg caaacaatcc 360

accactccct ccaagaagaa actccctccc aaacgcttca tcctaaggcc gccactagac 420

gacaaaaaat tagcagagag gttcctcacc agcccgcagc tatctctaaa gtccttccct 480

ttactcagct cgtgtctccc tccttcaaac ctcaactcct ccgacaagac atggatcgac 540

gagtacctcc tcgaagccaa acatgcttta ggctactccc tcgaaccttc ctcgacctta 600

agcgacgaga atcctgctaa gcattttgac acgcttctct atccttctcc aactggtgtt 660

atgattgggc ttgatctggc attcaatttg cattctgcct ttggcaattg gttcccaggt 720

tctaagcctc ttcttgctca agcgatgaac aagatcatga agtctaatcc agctctgtac 780

gtgttgagag agaggataag gaaagatttg cagttatact cgtctgtgcc tgcagagccg 840

tatttgtcat ctcaaaacta tggtgaaata ttcggcaatc aaatcatatg gtttgtggat 900

gataccaatg tctatcgtgt cccaattcgc aagacttttg aaggcaattt gacaaccaag 960

ccaattaatg gtgcgatcat tattttcaat ccaagaactg ggcagctatt cctaaaggtt 1020

atccatacaa gcatcagtgg tcagctagcc aagtgcaaaa cagctgaaga ggtggctgca 1080

cttgtgcgct ctctccctgt tgaagaacag ccaaacaaga ttattgctca taaaggaatg 1140

ctcgatcccc ttaaggtcca cctgctggat ttccccaaca ttgttatcaa gggaagtgaa 1200

ctgcagcttc tgttccaggc gtgctttaag attgagaaat ttggtgatct gattttgaag 1260

gccacagaac cgcagatggt cctattcaat atctatgatg attggttaaa gagcatctct 1320

tcgtacactg ccttctcaag actcattctg atccttcgtg cgctttacgt gaataatgag 1380

aaggctaaga tgttgttgaa gcccgacaag tctgttgtca cggagccaca tcacatctgg 1440

ccctctctca ctgacgacca gtggatgaag gtggaggtag ctcttaggga tcttatccta 1500

tctgactatg caaagaagaa caatgtgaat acctcagctc tgacacaatc agagatcata 1560

gctgagatta ccccaccctc tcaacagctg caacatatag ctgggattga gaaacagcac 1620

gaaaaatcaa acaagaaccc cattattgac cataaagaag gtgtactacc ggtaatttgg 1680

gactatgaaa atacccctat acagcacggc atgaagactg cagtggccat agcgcacatc 1740

acatatgcct tagagatgat caactctggg ccttacaaat tctttgttta cctggcaagt 1800

ttcgcagtct ctagaatcaa tcgcgagcac gacatctttt tcagaagaat gcatgaatct 1860

acagacgatg agtttcatta ccatgcagtg tatgataggg aggaatatat ttacttcaag 1920

agtgagtttg cagatttatc tatcaagaat tctatccaaa atcttattga aagaatgatg 1980

gagggaagct atcaaggtaa aagtctgatt ttaatgtctg gcgacggagg attcaggaaa 2040

ttagtggacc ttctgagatc aaatgaaatg gaagtgagct tcatcaagcc tgcttcaaat 2100

gattgtgctt cactcacgag cgatgcgacg tctgtcagct tagacaccgt tttcgctgga 2160

aatccaatct ggcattgtgt attaaaaaca agatcacaaa ggagaacaga gagaagaaac 2220

gagaagaaga ggattcgtga actccaaaag gcgtccgtct ctgagaagaa gaggatccgt 2280

gaatccagct cgaggcctat tgggaatgat gtgattggta ttgatttggg aaccaccaat 2340

tcttgtgtag cagtgatgga aggaaagacc cctagggtta ttgagaacgc agaaggaacg 2400

agaaccacac catcagtgtt tgctattaac cagaagggtg agtttctcgt tggaacacca 2460

gctaaacgtc agggcgttac caacccaaca ggcacggttt ccgggagcaa gcgtttgatg 2520

gggagaggtt tcgatgatcc ccagacgcag aaggagatga aaatggttcc ttacaaaatt 2580

gttaaggcgc caaacggtga tgcttgggtt gaagccaacg ggcagaagtt ttctcccagc 2640

cagattagtg ctaatatcct caccaaaatg aaggagaccg ctgaagctta cctcgggaaa 2700

accatcacca aagctgttgt taccgttcct gcttacttca atgatgcgca gaggcaagcc 2760

acaaaggatg ctgggaaaat cgccggtctt gatgtccaga gaatcatcaa cgaaccaacg 2820

gctgctgcct tgtcatatgg gatgaacaat aaggagggtg tgattgctgt cttcgatctt 2880

ggaggtggaa attttgatgt ttctatcctg gaaatctcaa gtggtgtttt tgaggtcaaa 2940

gcaacaaacg gagatacgtt tttgggagga gaagacttcg acaacacttt gttggagtat 3000

ctggtttctg agttcaagag atcagacaac attgatctga ccaaggacaa gctcgccctc 3060

cagaggctca gagaagctgc tgagaaggcg aagatcgagc tttcttccac atctcagacc 3120

gagatcaacc tgcctttcat caccacagat gattctggag agaagcactt gaacataacc 3180

ttaactaggt ccaagtttga agctttggtc agcaagttga ttgagagaac aagaagcccg 3240

tgccaaaact gtctcaagga tgctggagtc tcgattaagg aaatcgatga ggttcttctt 3300

gttggtggaa tgacccgtgt tcccaaagtg caagatatag tctctgaaat ctttggaaag 3360

agcccgtgca aaggtgttaa cccggatgaa gcagttgcca tgggagctgc tattcaaggt 3420

ggtatcctcc gtggtgatgt caaagagttg ctccttttgg atgtgactcc tctctcactc 3480

ggtattgaga cacttggagg aatcttcact aggttgatca accgaaacac caccatccca 3540

acaaagaagt ctcatgtttt ctccacaact gcagacaacc aaatgcaagt gggaatcaaa 3600

gttcttcagg gagagcgtga gatggcagct gacaacaaaa gtctaggaga atttgatttc 3660

gttgggatcc cacctgcgcc tagaggaatg ccccagatcg aagttacgtt cgacattgat 3720

gcaaatggtg tcgtgactgt ctcagccaaa gacaaagcaa cgggtaaaga gaaacagatc 3780

acaatcagat cttcaggtgc tctctcagac gatgagatca acagaatggt gaaagaagct 3840

gagcttaact cgcacaagga tcaagagaag aagcaactga tcgaccttag gaacacagct 3900

gataccacga tctacagtgt tgagaagagc ttgcgtgagt acagagagaa gattcctgct 3960

gagattgcct ctgagattga aactgcagtg tctgacctca ggactgcaat ggctagtgaa 4020

gaaatcgagg acataaaggc taagattgaa gctgcaaaca aggctgtgtc aaacattggt 4080

gaacacatgt ccaatggatc cagttcgtct ggaaccactg gtggtggtga aggtgaaggt 4140

ccaagcgggg cagacacctg a 4161

<210> 2

<211> 5000

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 2

tatgtttgct tattattcgc aggctgcttg tggtttaaag aagaaagaag agattgttga 60

tatcgactct gttgatgcta agaatgacct cgcagccgtt gaatatgtgg aagatatcta 120

cagcttctac aagtctgttg aggttagtac ttaacttact tactcattca tgaatctttc 180

cttttgtgac attgtgttaa tgaaacttgt ataaacattg gctgagtgaa tggcgtccaa 240

ctgattacat gaggtcgcag cccgagatta acgaaaagat gagactgatt ctcgttgagt 300

ggttgataga tgtgtgcgtc agattcgagc taaacccgga aacgttttac ctcaccgtta 360

acatcatgga tcggttcttg tcggctaagc ctatacctag aaaagagctt cagctggttg 420

gtctcagtgc tcttctcatg tcatccaaat acgaagagat ctggccacca caggtggagg 480

atctagctga cattgcagac catgcataca gtcacaaaca gattctggtg atggagaaga 540

caatacttat actgtctaca ctcgagtggt acttggcggt tccgacacat tatgtcttcc 600

tcgcacgttt catcaaagct tccgttgcag accaacgagt acgagagctt ttctttttag 660

tttctttcca tggttttgtc agtttctcaa ctggttcttg ttttatgtct ttcagattat 720

ggtgcactat ctggcggagt taggtgtaat gcattacgac acaaccataa tgttcagccc 780

atcactggtt gctgcagctg caatctacgc agcaagatca gctcttcacc aagttcccat 840

ctggaccgac actctcaagc atcacaccgg ctattctgag actcagctca tgtgagtgtg 900

tgtaaaacaa aagatccttt tccatcttca tcaagctctt ggcgtttcag cagtggaagc 960

agcagcagca acaagaagaa gggagtgaga gtaagaaggg agctttacga aagaagtact 1020

ccaaggaaga aaggttcgct gtggctatga tcccccggcc aaatctttgt tgaccggaac 1080

cgactctgct taggagttat aaagaccacc accaagaaga agaagaagaa gatgaaatag 1140

tctactacta gatatggctt taaattagat ttaaagtttt gtacaagtct aatgagttac 1200

tttgaaaaca tattctctat tgaatgaatc caaatgcttc ttatcatcat gattcgtgtc 1260

tttagttgcg tcttataaat aaaccgaccg gtcgagattt ggttcaattt ccacgttaca 1320

catcaggtag gcctgggcat tttaacgtgg acccgaaaac ctgaaccgga accgaccaaa 1380

gaatacctgt cccggaaccg aaccgaaaat ttacaagtac cttttggatt taattttttt 1440

ttacccgaaa gaaccggaac cgaaaagaac cgacccgaat agatccagac ccgaaaagaa 1500

ctgatccgaa taaatccaac ccgataagaa ccgatttgta cccgacttaa aaacatgttt 1560

atctaagaat atgatttttt gtattctatt ttatataaat tattttatga tttagttaaa 1620

atatcttttg ttaacaacat ttgttattat tttgtaactc tttttaaata atatgaagct 1680

ttaaaatgta taatttagag tttaaaaatg ttttatttta attattaata gtttcatata 1740

agttatttgt aaaattttag atatatatga caaatatcga ctaaatttga tggcattgag 1800

tatgccatgt tcttttcaga ttctaaatac ccgaacccgg tccggacccg atatggaccc 1860

aaaatttacg ggtatttaat aggtatttta attatagaca tgaaccgatc cggacccgag 1920

aagaaccaac ccgacccgac ccgacccgaa aattcttaag tatctattgg atcttaatat 1980

ttaggatccg aaagatccgg acccaaagga accagtccga acccgatccg aagacccaaa 2040

cgcccatacc tcatcaggtc tgaggtaatt aatccatcga gaagacgaca actcatgcca 2100

cacctcaaca atccttcatt acatgcatac atggatagac ataagaaaac agaaccagaa 2160

gatttcaaaa agcctaagga agaccaaggc tttaagatca gaaacattac cagcttggtt 2220

agggagagat ctccagttct tatgaccata cttctgaatg aaagagatga gtttcaggtc 2280

ttcgtcgtag ctccatggtc ctctcttcac tttggttttg tcacaacatg gcgctcttcc 2340

tttgcccatt ttctctactc acacacacac acacttttga gtttcctttt accaaatcaa 2400

gttggtccta tgtgtattta tacaagaaac tggtgtgtga tcctgacttt tagaaatatg 2460

ttataaacaa atgacaatgg tcaaatcaga tttgtttaaa ttaattacta tctatatttg 2520

tggttgaatg tcacatgatt ccttctttcc tagttataca cttaccattt gtatgtcaaa 2580

ataaatagta attatgtgat aaaacatctt aagatgccac tatgatatat ccttgtgatt 2640

atatcgttct gtaaaaataa ttgactatta ttagagataa aaattgctct gaagttcatt 2700

acttttctaa tgcaaatgaa gggaagaaat gccattcttt gaggtttgct tgacttgaac 2760

gtgaattgtg agtcagcaat ttttatgagg tctgtacaat atgccaatac cacaagacaa 2820

acacaagtca acaattttct atttttggag tgtccagtca aacatttaca caggaaaaaa 2880

aataattttt ttaaaagtat tagtatataa tatacaatgt gcttctacat ttggtcaaag 2940

ttttagagag agaaagttcc agagagaaaa agtagatcta tttttgggtc cgacgtacgg 3000

ccggtgcgtg agcgaactgg aggcttcttt agttccatcc ccgccggcct tgtctccggg 3060

aaatggaggc tttttagctc tgccgtcgct ggtttttaac ttcgggggtg aaagcgttcc 3120

ttgccttgtg ttgccagttt ttggttccct agttccattt tagagtttgg tttttatgtc 3180

tttggttatg cggtttcggg ctggattcgg tggatgagat ctcgtcggag gacgaacgac 3240

tctccggtgg taaatggtga tgtctcgtgc gaagccttct tctgctctcc gataatagaa 3300

acacacgagg tgaaggcgtt tgcagtgaag atggtgtgga actaatgagc tctggtgtgt 3360

tccggtgaat cgatggatgt ttcaccggtg gtggcttgaa acgggggtga tgtccttagc 3420

ggttgttcac gggaacggcg acaccacgtt tcggtttcta gagttttttt aagtgggttt 3480

ttggaccgtg gttttagttt gtccttaatg gttaggcttt gtaacatttg gacttggcct 3540

tttaattaaa taaattattg acgaaagaaa aaaaaacaat gcacactaaa aatgtttata 3600

gtagggctgg gcaaataaac cgaacccgaa aacccaaacc gaatccgatc cgataaaaat 3660

gaatccgaac cgatccgaac ccgacgtaaa taccgaatgg atcttgtttt gtggtatttc 3720

gggttatggg tattatccga acagaacccg aatctaaatg gatatccgat agaacccgaa 3780

acattcaaaa cctcgaaaag atcttgtacc aaacatgatc tcaattccta atatgtatcc 3840

aaaatacact aagaaatatt gaacatctaa aatacttatc tattacatga aggttggtgg 3900

ttctattaca tgaagtttga tggttgaaga tggccgttga atcttgaagt atttagattt 3960

agattttgtt ttcgttaaac aatgtttctc atttcatgag aacttggttt ttattttatg 4020

cttttattta tttggttttc tttttataag taaatatgtt tacttttcgt ttgattttga 4080

atgatcacgg ttgatgttcc ttatttttga atcgattttt acttaagttt tagttacaaa 4140

ataggtacaa atcatgtatt ttaaaattga agaacaaatt ttactcatgt tttggttata 4200

aaataggtaa aaatctggta cttttaaacc gaaaaaccga ttgggacccg aacccgaaag 4260

tatattgggt tgtaccggtt ctttgaagat ttactaaccc cgacccgaac ccgataaaac 4320

ccgaaccggt ccggaaccga actttcatat aatccgaatg gggctgattt tgataaaccc 4380

gaaaaaccga aacccgattg gataaaaccg aaacccgttt gggaccccga atgcccaggc 4440

ctagtttata gtttctattt atttatagct cttattttat ttgattataa ttgagaaata 4500

atacgtactg tatatatata ccatgcacaa acaatgcacc cccttctcac attcattgat 4560

aaatcagaga agcgggaaag aaaaaaaaaa acaatgcaca ctaaaaatgt ttatattttc 4620

tatttattta tagctcttat tttatttgat tataattgag aaataatacg tactgtatat 4680

agataccatg cacaaacaat gcaccccctt ctcacattca ttgataaatc agagagccgg 4740

gaaagaaaaa aaacaatgca cactaaaaat gtttatagtt tctatttatt tatagctctt 4800

attttatttg attataattg agaaataata cgtactgtat atatatacca tgcacaaaca 4860

atgcaccccc ttctcacatt cattgataaa tcagagaagc gggaaaaaaa aagaaagaaa 4920

gaaaagatct aagggaacac tgggaatgca gaagacacta gggttctgtt tctttctcga 4980

atctgaagtt tgctaaagga 5000

<210> 3

<211> 1386

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜

<400> 3

Met Leu Ala Pro Leu Lys Val Thr Glu Pro Gln Met Val Leu Phe Asn

1 5 10 15

Ile His Gly Thr His Ser Ser Ser Pro Phe Pro Phe Ser His Arg Cys

20 25 30

Ile Gln Asn Arg Asn Leu Ser Ser Arg Lys Pro Ser Phe Tyr Asn Ser

35 40 45

Met Glu Leu Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Leu Arg Val Ser His

50 55 60

Glu Lys Leu Ser Phe Ser Ser Ser Ile Ser Gln Cys Gln Leu Lys Pro

65 70 75 80

Ser Thr Phe Ala Lys Pro Arg Leu Arg Ile His Ala Ser Leu Ala Ser

85 90 95

Glu Lys Thr Gln Gly Leu Pro Arg Asp Ser Pro Gln Arg Leu Leu Lys

100 105 110

Glu Leu Ala Gln Arg Lys Gln Ser Thr Thr Pro Ser Lys Lys Lys Leu

115 120 125

Pro Pro Lys Arg Phe Ile Leu Arg Pro Pro Leu Asp Asp Lys Lys Leu

130 135 140

Ala Glu Arg Phe Leu Thr Ser Pro Gln Leu Ser Leu Lys Ser Phe Pro

145 150 155 160

Leu Leu Ser Ser Cys Leu Pro Pro Ser Asn Leu Asn Ser Ser Asp Lys

165 170 175

Thr Trp Ile Asp Glu Tyr Leu Leu Glu Ala Lys His Ala Leu Gly Tyr

180 185 190

Ser Leu Glu Pro Ser Ser Thr Leu Ser Asp Glu Asn Pro Ala Lys His

195 200 205

Phe Asp Thr Leu Leu Tyr Pro Ser Pro Thr Gly Val Met Ile Gly Leu

210 215 220

Asp Leu Ala Phe Asn Leu His Ser Ala Phe Gly Asn Trp Phe Pro Gly

225 230 235 240

Ser Lys Pro Leu Leu Ala Gln Ala Met Asn Lys Ile Met Lys Ser Asn

245 250 255

Pro Ala Leu Tyr Val Leu Arg Glu Arg Ile Arg Lys Asp Leu Gln Leu

260 265 270

Tyr Ser Ser Val Pro Ala Glu Pro Tyr Leu Ser Ser Gln Asn Tyr Gly

275 280 285

Glu Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Trp Phe Val Asp Asp Thr Asn Val

290 295 300

Tyr Arg Val Pro Ile Arg Lys Thr Phe Glu Gly Asn Leu Thr Thr Lys

305 310 315 320

Pro Ile Asn Gly Ala Ile Ile Ile Phe Asn Pro Arg Thr Gly Gln Leu

325 330 335

Phe Leu Lys Val Ile His Thr Ser Ile Ser Gly Gln Leu Ala Lys Cys

340 345 350

Lys Thr Ala Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Arg Ser Leu Pro Val Glu

355 360 365

Glu Gln Pro Asn Lys Ile Ile Ala His Lys Gly Met Leu Asp Pro Leu

370 375 380

Lys Val His Leu Leu Asp Phe Pro Asn Ile Val Ile Lys Gly Ser Glu

385 390 395 400

Leu Gln Leu Leu Phe Gln Ala Cys Phe Lys Ile Glu Lys Phe Gly Asp

405 410 415

Leu Ile Leu Lys Ala Thr Glu Pro Gln Met Val Leu Phe Asn Ile Tyr

420 425 430

Asp Asp Trp Leu Lys Ser Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Phe Ser Arg Leu

435 440 445

Ile Leu Ile Leu Arg Ala Leu Tyr Val Asn Asn Glu Lys Ala Lys Met

450 455 460

Leu Leu Lys Pro Asp Lys Ser Val Val Thr Glu Pro His His Ile Trp

465 470 475 480

Pro Ser Leu Thr Asp Asp Gln Trp Met Lys Val Glu Val Ala Leu Arg

485 490 495

Asp Leu Ile Leu Ser Asp Tyr Ala Lys Lys Asn Asn Val Asn Thr Ser

500 505 510

Ala Leu Thr Gln Ser Glu Ile Ile Ala Glu Ile Thr Pro Pro Ser Gln

515 520 525

Gln Leu Gln His Ile Ala Gly Ile Glu Lys Gln His Glu Lys Ser Asn

530 535 540

Lys Asn Pro Ile Ile Asp His Lys Glu Gly Val Leu Pro Val Ile Trp

545 550 555 560

Asp Tyr Glu Asn Thr Pro Ile Gln His Gly Met Lys Thr Ala Val Ala

565 570 575

Ile Ala His Ile Thr Tyr Ala Leu Glu Met Ile Asn Ser Gly Pro Tyr

580 585 590

Lys Phe Phe Val Tyr Leu Ala Ser Phe Ala Val Ser Arg Ile Asn Arg

595 600 605

Glu His Asp Ile Phe Phe Arg Arg Met His Glu Ser Thr Asp Asp Glu

610 615 620

Phe His Tyr His Ala Val Tyr Asp Arg Glu Glu Tyr Ile Tyr Phe Lys

625 630 635 640

Ser Glu Phe Ala Asp Leu Ser Ile Lys Asn Ser Ile Gln Asn Leu Ile

645 650 655

Glu Arg Met Met Glu Gly Ser Tyr Gln Gly Lys Ser Leu Ile Leu Met

660 665 670

Ser Gly Asp Gly Gly Phe Arg Lys Leu Val Asp Leu Leu Arg Ser Asn

675 680 685

Glu Met Glu Val Ser Phe Ile Lys Pro Ala Ser Asn Asp Cys Ala Ser

690 695 700

Leu Thr Ser Asp Ala Thr Ser Val Ser Leu Asp Thr Val Phe Ala Gly

705 710 715 720

Asn Pro Ile Trp His Cys Val Leu Lys Thr Arg Ser Gln Arg Arg Thr

725 730 735

Glu Arg Arg Asn Glu Lys Lys Arg Ile Arg Glu Leu Gln Lys Ala Ser

740 745 750

Val Ser Glu Lys Lys Arg Ile Arg Glu Ser Ser Ser Arg Pro Ile Gly

755 760 765

Asn Asp Val Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val Ala

770 775 780

Val Met Glu Gly Lys Thr Pro Arg Val Ile Glu Asn Ala Glu Gly Thr

785 790 795 800

Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Ala Ile Asn Gln Lys Gly Glu Phe Leu

805 810 815

Val Gly Thr Pro Ala Lys Arg Gln Gly Val Thr Asn Pro Thr Gly Thr

820 825 830

Val Ser Gly Ser Lys Arg Leu Met Gly Arg Gly Phe Asp Asp Pro Gln

835 840 845

Thr Gln Lys Glu Met Lys Met Val Pro Tyr Lys Ile Val Lys Ala Pro

850 855 860

Asn Gly Asp Ala Trp Val Glu Ala Asn Gly Gln Lys Phe Ser Pro Ser

865 870 875 880

Gln Ile Ser Ala Asn Ile Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala

885 890 895

Tyr Leu Gly Lys Thr Ile Thr Lys Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr

900 905 910

Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Lys Ile Ala

915 920 925

Gly Leu Asp Val Gln Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu

930 935 940

Ser Tyr Gly Met Asn Asn Lys Glu Gly Val Ile Ala Val Phe Asp Leu

945 950 955 960

Gly Gly Gly Asn Phe Asp Val Ser Ile Leu Glu Ile Ser Ser Gly Val

965 970 975

Phe Glu Val Lys Ala Thr Asn Gly Asp Thr Phe Leu Gly Gly Glu Asp

980 985 990

Phe Asp Asn Thr Leu Leu Glu Tyr Leu Val Ser Glu Phe Lys Arg Ser

995 1000 1005

Asp Asn Ile Asp Leu Thr Lys Asp Lys Leu Ala Leu Gln Arg Leu

1010 1015 1020

Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Thr Ser

1025 1030 1035

Gln Thr Glu Ile Asn Leu Pro Phe Ile Thr Thr Asp Asp Ser Gly

1040 1045 1050

Glu Lys His Leu Asn Ile Thr Leu Thr Arg Ser Lys Phe Glu Ala

1055 1060 1065

Leu Val Ser Lys Leu Ile Glu Arg Thr Arg Ser Pro Cys Gln Asn

1070 1075 1080

Cys Leu Lys Asp Ala Gly Val Ser Ile Lys Glu Ile Asp Glu Val

1085 1090 1095

Leu Leu Val Gly Gly Met Thr Arg Val Pro Lys Val Gln Asp Ile

1100 1105 1110

Val Ser Glu Ile Phe Gly Lys Ser Pro Cys Lys Gly Val Asn Pro

1115 1120 1125

Asp Glu Ala Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Ile Leu

1130 1135 1140

Arg Gly Asp Val Lys Glu Leu Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu

1145 1150 1155

Ser Leu Gly Ile Glu Thr Leu Gly Gly Ile Phe Thr Arg Leu Ile

1160 1165 1170

Asn Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Lys Ser His Val Phe Ser

1175 1180 1185

Thr Thr Ala Asp Asn Gln Met Gln Val Gly Ile Lys Val Leu Gln

1190 1195 1200

Gly Glu Arg Glu Met Ala Ala Asp Asn Lys Ser Leu Gly Glu Phe

1205 1210 1215

Asp Phe Val Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile

1220 1225 1230

Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Val Val Thr Val Ser

1235 1240 1245

Ala Lys Asp Lys Ala Thr Gly Lys Glu Lys Gln Ile Thr Ile Arg

1250 1255 1260

Ser Ser Gly Ala Leu Ser Asp Asp Glu Ile Asn Arg Met Val Lys

1265 1270 1275

Glu Ala Glu Leu Asn Ser His Lys Asp Gln Glu Lys Lys Gln Leu

1280 1285 1290

Ile Asp Leu Arg Asn Thr Ala Asp Thr Thr Ile Tyr Ser Val Glu

1295 1300 1305

Lys Ser Leu Arg Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Pro Ala Glu Ile Ala

1310 1315 1320

Ser Glu Ile Glu Thr Ala Val Ser Asp Leu Arg Thr Ala Met Ala

1325 1330 1335

Ser Glu Glu Ile Glu Asp Ile Lys Ala Lys Ile Glu Ala Ala Asn

1340 1345 1350

Lys Ala Val Ser Asn Ile Gly Glu His Met Ser Asn Gly Ser Ser

1355 1360 1365

Ser Ser Gly Thr Thr Gly Gly Gly Glu Gly Glu Gly Pro Ser Gly

1370 1375 1380

Ala Asp Thr

1385

Claims (4)

1.一种分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b，其CDS序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b，其启动子序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.权利要求1至3任一项所述的一种分离的甘蓝型油菜核不育基因Bnms4^b在甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良中的应用。