CN105579583B - 雌性不育系的繁殖及杂交制种技术 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学和育种领域，具体地涉及一种用于制备杂交水稻的方法，更具体地涉及雌性不育系的繁殖和保持及其在制备杂交水稻中的用途。

Description

雌性不育系的繁殖及杂交制种技术

技术领域

本发明属于植物分子生物学和育种领域，具体地涉及一种用于制备杂交水稻的方法，更具体地涉及雌性不育系的繁殖和保持，及其在制备杂交水稻中的用途。

背景技术

水稻雌性不育类型多样，是不同基因突变和环境条件相互作用的结果。人们对水稻雌性不育的研究有限,还有很多问题需要做进一步的探讨和研究。目前对水稻雌性不育的研究主要集中在细胞学分析上,而遗传学和分子生物学的研究还比较少。

水稻育种上的突破经常从特异性育种材料的发展开始,如洪群英、洪春利在广东发现矮脚南特,李必湖在海南发现的野败雄性不育株,石明松在湖北发现农垦58不育株。这些特殊突变体的发现为遗传育种学家提供了坚实的材料基础,掀起了我国水稻育种矮化及杂交育种的多次浪潮。但随着水稻遗传育种研究和应用的深入,育种材料发掘与创新的难度不断增加。

现有杂交水稻“三系”或“两系”法,由于亲本育性的制约，杂交制种均难以实现机械化生产,从劳动力上限制了杂交稻种子的生产规模,导致种子成本居高不下,制约着杂交水稻的推广应用。

若在杂交制种过程中使用雌性不育系作父本，雌性不育父本可以授粉雄性不育系(母本)产生杂交种子，而雌性不育系(父本)自身不能结实，不会产生自交种子而影响杂交种子纯度，所以无需在授粉后清除。因此在生产上可以将雄性不育系(母本)与雌性不育系(父本)混播，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉；授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。因此，二系三系需分行间作，授粉后父本需要割除，耗费大量人力成本的问题，通过本技术可以得到克服。

发明简述

本发明提供了一种繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法，所述方法包括：

(a)提供第一植株，所述第一植株的调控雌性器官发育的基因发生纯合隐性突变，所述植株表现为雌性不育；

(b)向第一植株中引入外源构建体，形成第二植株，所述外源构建体包含：

i)第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的正常雌性器官发育；

ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；

iii)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体；以及

(c)第二植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性核雌性不育的第一植株，另一半为含有外源构建体的第二植株。

在本发明中，上述繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法中所提到的第一核苷酸序列可以为OsFMS2或OsFMS1。更优化的，所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物雌性器官中表达。

上述繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、PA的核苷酸序列构成的组。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。具体地，所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

上述繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法中所提到的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因构成的组之一。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在种子或胚乳中特异表达的启动子。

本发明还提供了一种从雌性不育植株产生种子的方法，所述方法包括：

(a)提供第一植株，所述第一植株的调控雌性器官发育的基因发生纯合隐性突变，所述植株表现为雌性不育；

(b)向第一植株中引入外源构建体，形成第二植株，所述外源构建体包含：

i)第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的雌性生育力；

ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；

iii)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体；以及

(c)第二植株自花授粉，产生含有或不含所述外源构建体的种子。

如上所述的从雌性不育植株产生种子的方法，其中所述的第一核苷酸序列为OsFMS2或OsFMS1。其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物胚珠、心皮或其他雌性器官中表达。

如上所述的从雌性不育植株产生种子的方法，其中所述的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、PA的核苷酸序列构成的组。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。更具体的，所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

如上所述的从雌性不育植株产生种子的方法，其中所述的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因构成的组。所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在种子或胚乳中特异表达的启动子。

本发明还提供了一种构建体，其特征在于所述构建体包含：

i)第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的雌性生育力；

ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；和iii)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体。

在本发明中，上述构建体中所包含的第一核苷酸序列为OsFMS2或OsFMS1。所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物胚珠、心皮或其他雌性器官中表达。

在本发明中，上述构建体所包含的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶的核苷酸序列构成的组。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。更具体的，所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

在本发明中，上述构建体所包含的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因构成的组。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在种子或胚乳中特异表达的启动子。

本发明还提供了一种利用隐性核雌性不育系的杂交制种方法，所述方法包括将隐性核雌性不育植株与雄性不育植株混播，以制备杂交种，其特征在于所述隐性核雌性不育植株含有如SEQ ID NO:5、19或23所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID NO:5、19或23所示，这类序列突变会导致植物雌性不育。

附图说明

图1是雌性不育突变体材料osfms2。

图2是osfms2突变体和野生型黄华占小花形态。

图3是osfms2突变体和野生型黄华占花药形态。

图4是osfms2突变体和野生型黄华占花粉I₂-KI染色分析。

图5是osfms2突变体和野生型黄华占雌性器官形态比较。

图6是野生型黄华占和osfms2突变体中OsFMS2基因cDNA序列比对，多态性位点用粗体标出。

图7是野生型黄华占和日本晴中OsFMS2基因cDNA序列比对，位点多态性用红色粗体显示。

图8是野生型黄华占和日本晴中OsFMS2基因氨基酸序列比对，多态性用红色粗体表示。

图9是外源构建体pFMS2的载体图。

图10是携带图9中外源构建体的荧光种子和不携带外源构建体的非荧光种子表现为

1:1分离。

图11是osfms1突变体与野生型抽穗期表型，左侧为野生型；右侧为突变体，叶片倒挂。

图12是osfms1突变体与野生型穗子表型，左侧为野生型；中间为杂合子；右侧为突变体。

图13是野生型与osfms1突变体中OsFMS1的基因序列比对。

图14是野生型与osfms1突变体中OsFMS1的氨基酸序列比对。

图15是外源构建体pFMS1的载体图。

图16是携带图15中外源构建体的荧光种子和不携带外源构建体的非荧光种子表现为1:1分离。

图17是雌性不育系的繁殖方法流程图。

发明详述

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明旨在提出一种能够有效的繁殖隐性水稻核雌性不育系的方法，和充分利用水稻种质资源开展杂交育种、降低杂交制种成本的手段。

本发明提供了一种保持雌性不育系纯合隐性等位状态的繁殖方法，所述方法以纯合隐性核雌性不育突变体为转化受体材料，转入3个目标基因，分别是突变后会导致植株雌性不育的雌性育性基因、花粉失活基因和筛选基因。其中，雌性育性基因可使雌性不育的转化受体材料恢复育性，花粉失活基因可使含有转化的外源构建体的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作雌性不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产雌性不育系和雌性不育保持系。

在本发明中，所述雌性育性基因主要在雌性器官表达。更具体的，在水稻植株中，所述雌性育性基因包括但不限于OsFMS2和OsFMS1。本发明还提供了一种获得雌性不育系材料的方法，所述方法包括对上述雌性育性基因及其他调控雌性器官发育的基因，通过突变的技术手段获得雌性不育突变体材料，进而通过本发明中所公开的方法将其应用于杂交制种。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，还可以是通过RNAi、基因定点突变等基因沉默手段产生，所述基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法或CRISPR/Cas9等定点突变方法。

在本发明中，所述花粉失活基因可以干扰花粉(雄配子)的形成或功能，更具体的包括但不限于可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶(DNA(Adenosine-N6)methyltransferase)、亲和素，还可以是显性的雄性不育基因，或者可选自原核调控系统等。举例而言，Mariani,et al.,Nature Vol.347；pp.737；(1990)表明，Aspergillus oryzae RNase-T1或Bacillus amyloliquefaciens的RNase(被命名为“barnase”)在绒毡层中的表达诱导了绒毡层细胞的破裂，导致雄性不育。Quaas,et al.,Eur.J.Biochem.Vol.173:pp.617(1988)描述了RNase-T1的化学合成，而barnase基因的核苷酸序列由Hartley,J.Molec.Biol.；Vol.202:pp.913(1988)公开。Agrobacteriumrhizogenes的rolB基因编码通过从吲哚酚-β-甙释放游离吲哚从而干扰茁长素代谢的酶。Estruch,et al.,EMBO J.Vol.11:pp.3125(1991)和Spena,et al.,Theor.Appl.Genet.；Vol.84:pp.520(1992)表明，烟草中rolB基因的花粉囊-特异性表达产生了花粉囊枯萎的植株，其中，花粉的产生大大减少，rolB基因是可用于控制花粉产生的基因的例子。Slightom,et al.,J.Biol.Chem.Vol.261:pp.108(1985)公开了rolB基因的核苷酸序列。编码白喉毒素基因的DNA分子可从American Type Culture Collection(Rockville,MD),ATCCNo.39359或ATCC No.67011获得，关于例子和使用方法，见Fabijanski,et al.,E.P.Appl.No.90902754.2,“Molecular Methods of Hybrid Seed Production”。DAM甲基化酶基因用于在美国专利No.5,689,049和PCT/US95/15229Cigan,A.M.and Albertsen,M.C.,“Reversible Nuclear Genetic System for Male Sterility in TransgenicPlants.”讨论的方法中导致不育。还见Albertsen et al的美国专利No.5,962,769“Induction of Male Sterility in Plants by Expression of High Levels ofAvidin”对亲和素基因导致不育的讨论。

本发明所述的雌性不育系的繁殖方法中还可包含筛选基因，用于筛选经转化的细胞或组织。所述筛选基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因，合适的筛选标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁膦抗性基因。所述筛选基因还可以是荧光筛选基因，包括但不限于红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因。

更具体地，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性雌性不育osfms2突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系：其中，雌性育性基因OsFMS2可使转化受体材料育性恢复；花粉失活基因PA可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；荧光色选基因RFP用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作雌性不育系(父本)生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产雌性不育系和雌性不育保持系。该技术可生产大量雌性不育材料(父本)，杂交制种时可实现父母本混播，解决了水稻杂交制种过程中分行种植问题，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉过程中的劳动力投入；同时，授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。

本发明还提出了一种构建体，根据本发明的实施例，该构建体包括：第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子为雌性育性基因；第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活蛋白。利用该构建体，能够有效地将水稻雌性育性基因和花粉失活基因引入到纯合隐性核雌性不育水稻突变体植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的父本，由此，可以有效地用于水稻杂交,得到的杂交种也为非转基因。进一步的，上述构建体还可包括第三表达盒，所述第三表达盒含有第三核酸分子，所述第三核酸分子为筛选标记基因。利用该构建体，能够有效地将含有转基因的种子与不含有转基因的种子分开，非转基因种子用作雌性不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地生产不育系。

在一种阐释性的实施方式中，上述保持雌性不育植株纯合隐性状态的繁殖方法中，还可进一步的包括以下核苷酸序列：可选的第四核苷酸序列，其与第一核酸分子可操作地相连，偏好于在植物雌性器官中表达，其中第一核酸分子(又称第一核苷酸序列)为雌性育性基因，具有恢复雌性不育系雌性育性的功能；可选的第五核苷酸序列，指导偏好于雄性配子的表达，其与第二核酸分子(又称第二核苷酸序列)可操作地相连，所述第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组，其中第二核酸分子为花粉失活蛋白，能抑制可育雄性配子的形成或功能；可选的第六核苷酸序列，其与第三核酸分子(又称第三核苷酸序列，为筛选标记基因)可操作地相连，偏好于在种子或胚乳中特异表达的功能，具体的所述第六核苷酸序列可以是END2、LTP2等启动子。

由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到植物的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，本发明还提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。

本发明还提出了一种新的育种方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雌性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育的雌性配子，因此能够进行自体受精，可以得到携带外源基因的种子和不携带外源基因的种子，两者各占50％。其中，携带外源基因的种子可以作为水稻雌性不育保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产雌性不育系和保持系；另外，不携带外源基因的植株(雌性不育)可以用作杂交亲本中的父本，为雄性不育系提供花粉。由此，可以有效地实现水稻杂交。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻雌性不育植株育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雌性不育植株中。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。

在本发明的第六方面，本发明还提供了一种水稻雌性不育突变osfms2。与野生型相比，所述突变体植株生长发育正常，同期开花。外稃和内稃大小、形态、开张尺寸、开张时间与野生型没有差别。突变体花药与野生型一致，呈黄色，花药能正常开裂，花粉散粉正常，进一步用I2-KI溶液对突变体的花粉进行染色检测，发现突变体与野生型的花粉染色正常。突变体的雌器官(包括子房，花柱，柱头)与野生型的雌器官在外观下无明显区别。突变体基因克隆分析以及与野生型基因组序列比对显示该突变体的第12号染色体上的LOC_Os12g10540等位基因发生突变。在野生型黄华占中该基因OsFMS2的编码区全长为813bp,其核苷酸序列SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，共含270个氨基酸。而在该雌性不育突变体中，该基因OsFMS2编码区的第52位的碱基由C突变为T，导致相应密码子由CAG变为终止密码子TAG，导致基因提前终止，具体的该突变后的OsFMS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。在日本晴中，所述OsFMS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-Blunt-simple cloning kit购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶购自NEB公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pCAMBIA2300来自于CAMBIA公司。

实施例1、雌性不育系的繁殖及杂交制种技术

该技术的核心思想是：以核隐性雌性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中，其中，雌性育性基因可使转化受体的雌性育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子即为雌性不育系，而转基因种子用作保持系。通过保持系自交结实，由此繁殖雌性不育系和保持系。在杂交制种过程中，雌性不育系授粉雄性不育系产生杂交种子，而雌性不育系自身不能结实，不会产生自交种子而影响杂交种子纯度，所以无需在授粉后清除。因此在生产上可以将雌性与雄性不育系混播，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉；授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。所述雌性不育系的繁殖方法如图17所示，雌性不育系可与雄性不育系混播，进行杂交制种。

实施例2、水稻雌性不育突变体及基因在育种中的应用

水稻雌性突变体材料及突变后会导致植株雌性不育的雌性育性基因可以用于新一代杂交育种技术，该技术的核心思想是：以水稻核隐性雌性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中，其中，育性基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子即为雌性不育系，而转基因种子用作保持系。通过保持系自交结实，由此繁殖雌性不育系和保持系。在杂交制种过程中，雌性不育系授粉雄性不育系产生杂交种子，而雌性不育系自身不能结实，不会产生自交种子而影响杂交种子纯度，所以无需在授粉后清除。因此在生产上可以与雌性不育系混播，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉；授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。

实施例3、水稻雌性不育突变体(osfms2)筛选

该突变体的获得是通过EMS诱变籼稻黄华占种子(M0)，EMS诱变浓度是0.7％，诱变时间为20小时,来自M0代种子植株结实后混收，获得突变体库(M1)。来自M1代种子的植株在种子成熟期用于筛选，获得不育株。不育株割稻桩再生，再生株在生殖期用I2-KI染色检测花粉发育和染色反应。其中一个突变体表现为花粉可育，但植株自交完全不育。以突变体为母本,用野生型花粉授粉仍然不育,以突变体为父本授粉野生型植株，可以获得种子，说明不育是由雌性不育引起并能稳定遗传。判断该突变体为雌性不育突变体(female-sterility mutant)，命名为osfms2。

实施例4、水稻雌性不育突变体(osfms2)遗传分析

osfms2雌性突变体不育株作父本与野生型黄华占杂交，36株杂交F1材料全部表现为可育。再将F1代进行自交单株收种，种植的247株F2代植株中，65株表现为雌性不育，182棵植株表型为完全可育，不育与可育植株的分离比接近1:3，显示该突变是由隐性核基因控制。

实施例5、水稻雌性不育突变体(osfms2)育性稳定性分析

为了确定osfms2突变体育性是否受环境光照温度等条件影响，不育株与野生型黄华占杂交F1代自交产生的F2代植株在深圳、三亚、湖南、北京种植，进一步观察植株育性和表型分离比。在所有区域，不育株：可育株均表现为1:3分离比(表1)，割稻桩再生的不育株仍表现为完全不育，说明该突变体不育表型不受地理纬度、环境和季节等环境因素的影响，

表1：水稻雌性不育突变体(osfms2)杂交F2代分离比

	可育株数	不育株数	χ2(3:1)
				深圳	107	37	0.037
三亚	127	40	0.098
				湖南	98	29	0.318
北京	147	51	0.061

实施例6、水稻雌性不育突变体(osfms2)生殖器官表型分析

与野生型相比，突变体植株生长发育正常(图1)，同期开花。外稃和内稃大小、形态、开张尺寸、开张时间与野生型没有差别(图2)。突变体花药与野生型一致，呈黄色(图3)，花药能正常开裂，花粉散粉正常，进一步用I₂-KI溶液对突变体的花粉进行染色检测，结果如图4所示，突变体与野生型的花粉染色正常。突变体的雌器官(包括子房，花柱，柱头)与野生型的雌器官在外观下无明显区别(图5)。

实施例7、水稻雌性不育突变体(osfms2)基因的克隆

突变体基因克隆采取MutMap方法，即利用突变体与原野生亲本杂交构建F2群体，通过重测序进行基因定位的方法。将不育株作父本与野生型黄华占杂交获得F1，种植F1，单株收集F2种子分株系种植，从分离比符合3:1的F2株系群体中选取30棵F2代不育植株，取叶片提取基因组DNA，等量混合后用于高通量基因组测序，共获得21Gb基因组序列数据(PE101)，相当于50x水稻基因组。

得到F2代不育株原始测序数据后，过滤掉低质量(含N≥5)的序列，然后采用SOAP2将序列比对到日本晴参考基因组上，比对率为74.87％，覆盖整个基因组88％。比对之后，采用soapsnp寻找不育株与参考基因组之间存在的SNP。同样的，将野生型黄华占重测序数据比对到日本晴参考基因组上并寻找两者之间的SNP之后，通过计算野生型黄华占在每个SNP位点处主要基因型的频率，选取cutoff≥0.8(覆盖深度≥5)，从而得到每个SNP位点处比较可靠的野生型黄华占的基因型。之后，针对不育株与野生型黄华占之间的所有SNP位点，计算不育株在这些位点的主要基因型频率和欧氏距离(ED值)，频率≥0.8，ED值越高的作为可能与突变性状相关的区域，通过查询日本晴参考基因组注释信息，寻找位于UTR(基因上游2.5kbp作为5’-UTR，下游1.5kbp作为3’-UTR)，exon或剪切位点附近并能影响到所在基因功能的SNP位点作为候选的可能与突变性状相关的突变位点，其所在基因作为候选突变基因。

与野生型黄华占基因组序列比较显示突变基因是位于第12染色体上的LOC_Os12g10540等位基因。在野生型黄华占中该基因OsFMS2的编码区全长813bp,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，它所编码的蛋白含270个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在不育突变体中，该基因编码区的第52位点由C突变为T，相应密码子为CAG变为终止密码子TAG，导致基因提前终止(图6)，其突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，突变后的核苷酸序列与野生型序列的比对结果如图6所示，下划线标示的碱基为突变位点处的碱基。。

采用SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)研究工具HRM(High Resolution Melt，即高分辨率熔解)分析，一共分析了280个F2植株，进一步验证所有的雌性不育突变体植株均携带纯合突变型位点，而可育植株携带纯合野生型或杂合型位点。该位点为纯合野生型的植株自交后代全部可育，该位点为杂合型的植株自交后代表现不育：可育为68:212，符合1:3分离。

该基因OsFMS2的编码区在粳稻日本晴和野生型黄华占之间存在核苷酸序列多态性，其核苷酸比对结果如图7所示，从图中可以看出共有5个碱基不同,其氨基酸序列的比对结果如图8所示。其中第81位、643位和765位的碱基差异并没有引起氨基酸的变化，而在第415位日本晴为T，黄华占为G,相应的日本晴在该处为丝氨酸，黄华占为丙氨酸；第781位日本晴为G，黄华占为A，相应的日本晴在该处为丙氨酸，黄华占为苏氨酸；进一步分析，该基因在籼稻品种9311和野生型黄华占之间没有多态性。在日本晴中该基因OsFMS2的编码区序列如SEQ ID NO:3所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

实施例8、osfms2突变体植株与其它水稻的杂交分析

黄华占osfms2突变体植株能够与生产中常用的品种(包括不育系)杂交，产生可育种子。部分组合的杂交种子显示出明显的杂种优势，说明该黄华占突变体在杂交育种中有一定的应用价值，可以作为培育恢复系的亲本材料。

实施例9、OsFMS2基因及其突变体在育种中的应用

根据实施例1所述原理，发明人采用水稻OsFMS2基因构建了表达载体pFMS2。在构建水稻的植物表达载体之前，发明人首先分别对表达载体内的PA、OsFMS2和RFP三个表达盒单独进行了水稻转化，并进一步对各个表达盒的功能进行了验证。结果表明各个表达盒单独转化水稻时，都能够工作良好，达到预期的设计效果。

进一步发明人构建了以下水稻表达载体：通过装配PA、OsFMS2和RFP表达框各个元件，来构建如图9所示的pFMS2载体，该载体含有3个表达框。分别为，雌性育性基因表达框，启动子、终止子均为育性基因OsFMS2内源的相应调控序列；花粉致死表达框，花粉致死基因为PA,启动子为PG47，终止子为IN2-1，其中在PA基因前面还有一个导肽序列ZM-BT1，用于将PA蛋白靶向淀粉体；筛选基因表达框，筛选基因为RFP基因，启动子为Ltp2，终止子为PinII，其中，启动子Ltp2前面还有一个35S增强子序列。

进一步,发明人通过装配下述DNA元件，构建了图9所示的pFMS2载体：

1)以pCAMBIA2300载体为基础；

2)RFP基因表达盒：RFP基因(SEQ ID NO：6)的开放读码框连接于LTP2启动子(SEQID NO：7)和PINII终止子(SEQ ID NO：9)之间，在LTP2启动子的上游还连有一个35S增强子序列(SEQ ID NO:8),重组成RFP的基因表达盒(LTP2：RFP：PINII)；

3)OsFMS2基因表达盒：目标基因OsFMS2及其启动子和终止子的全长核苷酸序列如SEQ

ID NO：10所示，其中OsFMS2基因的启动子序列如SEQ ID NO：11所示，其终止子序

列如SEQ ID NO：12所示，其核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

4)PA基因表达盒：PG47，ZM-BT1，PA，IN2-1，目标基因PA(其核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示)的开放读码框连接于启动子PG47(其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示)、转运肽ZM-BT1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)的下游，终止子IN2-1(其核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示)的上游。

水稻转化

利用电激法将质粒pFMS2转入农杆菌Agl0菌株，利用农杆菌介导法对OsFMS2隐性纯合突变的osfms2水稻进行遗传转化，得到26株单拷贝转基因植株材料。具体的转化受体材料品种为水稻黄华占。

转基因水稻植株的花粉育性检测

对上述所得到的26株单拷贝转基因水稻(OsFMS2位点隐性纯合突变)植株进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有明显的形态差异，但是花粉育性明显不同。对pFMS2构建体转化水稻得到的转基因植株材料，进行花粉可染率检测，同时对野生型水稻进行花粉可染率检测。采用的方法为：在水稻开花期，从转基因水稻植株、及其野生型对照植株各随机抽取多个单株，各株取一朵花，每朵花取1个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1％的I2-KI溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数，可以着色为深蓝色的为可育花粉，而不能够着色的为败育花粉。分析转基因水稻植株的花粉可染率。结果显示野生型对照植株的可着色的花粉占98％～100％；而多个随机抽取的转基因植株中，正常花粉(可着色)与败育花粉(不能着色)比例接近1:1，表明所构建的转基因株系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，即构建体pFMS2使转基因株系花粉的50％失活。该结果表明本发明所提供的载体能够达到预期的花粉失活功能。

转基因水稻植株的荧光种子与非荧光种子分离分析

对上述实施例所得到的26株单拷贝转基因水稻植株(OsFMS2位点隐性纯合突变)所结T1代种子进行荧光分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比(图10)，即携带外源基因的荧光种子和不携带外源基因的非荧光种子表现为1:1分离，表明本发明所提供的载体各元件作为整体表现良好，达到预期的目的。

实施例9、OsFMS1基因及其突变体在育种中的应用

除上述的OsFMS2基因外，另一个控制水稻雌性育性的基因OsFMS1(LOC_Os03g11600)也已经克隆完成。osfms1突变体雄蕊生长发育完全正常,而雌蕊外形除了比野生型稍小并无显著差异,进一步细胞学观察,可能是珠被发育异常增生。该突变体自交完全不育,以突变体为母本,用野生型花粉授粉仍然不育,而且该不育表型不受地理纬度、环境和季节的影响,说明不育是由雌性不育引起并能稳定遗传。从分蘖后期开始,该突变体的上位叶片(包括剑叶),主叶脉发育不全或大部分退化,导致叶片发生倒挂(图11),隐性突变材料穗子完全不育(图12)，而且该叶片倒挂表型和雌性不育表型完全连锁。

该突变体作为父本与野生型杂交，20株F1代全部可育，F1代自交单株收种，种植的1200株F2代植株中，312株表现为雌性不育，888棵植株表型为完全可育，不育与可育植株的分离比接近1:3，显示该突变是由隐性核基因控制。变体基因克隆分析以及与野生型基因组序列比对显示该突变体第3染色体上的LOC_Os03g11600等位基因发生突变。该基因的编码区全长为591bp,其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，共含196个氨基酸。而在该雌性不育突变体中，该基因编码区的第83位的碱基由T突变为C，导致相应密码子由GTC变为GCC，导致编码的氨基酸由缬氨酸变为丙氨酸，该基因突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。OsFMS1基因的野生型核苷酸序列与突变体的核苷酸序列的比对结果如图13所示，氨基酸序列的比对结果如图14所示。

该雌性不育突变体雌性完全不育,其雄性可育且育性稳定,又表现为隐性遗传,通过配种繁育,并将雌性不育特性用在杂交水稻制种上,可实现杂交水稻种子的机械化生产制备。同时，突变体在表现雌性不育的同时,中上部叶片在叶环处弯曲倒挂,这种上层叶片自然弯下又表现为隐性遗传的性状,转到杂交稻亲本上,就可减少制、繁种时传粉的阻挡,提高制种产量,并降低劳动成本。因此,该基因同样具有在杂交水稻中的应用前景。

与pFMS2相同，发明人采用水稻OsFMS1基因构建了表达载体pFMS1,pFMS1表达载体也包含了OsFMS1基因、PA和RFP三个表达盒，通过装配PA、OsFMS1和RFP表达框各个元件，来构建图15所示的pFMS1载体，该载体含有3个表达框。

1)以pCAMBIA2300载体为基础；

2)RFP基因表达盒：RFP基因(SEQ ID NO：6)的开放读码框连接于LTP2启动子(SEQID NO：7)和PINII终止子(SEQ ID NO：9)之间，其中LTP2启动子的上游还连有一个35s增强子序列(SEQ ID NO:8),重组成RFP的基因表达盒(LTP2：RFP：PINII)；

3)OsFMS1基因表达盒：目标基因OsFMS1及其启动子和终止子的全长核苷酸序列如SEQ

ID NO：20所示，其中OsFMS1基因的启动子序列如SEQ ID NO：21所示，其终止子序

列如SEQ ID NO：22所示，其核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示；

4)PA基因表达盒：PG47，ZM-BT1，PA，IN2-1，目标基因PA(其核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示)的开放读码框连接于启动子PG47(其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示)、转运肽ZM-BT1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)的下游，终止子IN2-1(其核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示)的上游。

水稻转化

利用电激法将质粒pFMS1转入农杆菌Agl0菌株，利用农杆菌介导法对隐性纯合的osfms1水稻突变材料进行遗传转化，得到19株单拷贝转基因植株材料。

转基因水稻植株的花粉育性检测

对上述所得到的19株单拷贝转基因水稻(OsFMS1位点隐性纯合突变)植株进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有明显的形态差异，但是花粉育性明显不同。对pFMS1构建体转化水稻得到的转基因植株材料，进行花粉可染率检测，同时对野生型水稻进行花粉可染率检测。采用的方法为：在水稻开花期，从转基因水稻植株、及其野生型对照植株各随机抽取多个单株，各株取一朵花，每朵花取1个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1％的I2-KI溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数，可以着色为深蓝色的为可育花粉，而不能够着色的为败育花粉。分析转基因水稻植株的花粉可染率。结果显示野生型对照植株的可着色的花粉占98％～100％；而多个随机抽取的转基因植株中，正常花粉(可着色)与败育花粉(不能着色)比例接近1:1，表明所构建的转基因株系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，即构建体pFMS1使转基因株系花粉的50％失活。该结果表明本发明所提供的载体能够达到预期的花粉失活功能。

转基因水稻植株的荧光种子与非荧光种子分离分析

对上述实施例所得到的19株单拷贝转基因水稻植株(OsFMS1位点隐性纯合突变)所结T1代种子进行荧光分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比(图16)，即携带外源基因的荧光种子和不携带外源基因的非荧光种子表现为1:1分离，表明本发明所提供的载体各元件作为整体表现良好，达到预期的目的。

实施例10、其它水稻雌性育性基因

除了以上克隆的两个水稻雌性育性基因外，对其他调控雌性器官发育的基因，我们可通过诱变筛选或CRISPR/Cas等定点突变的技术手段获得雌性不育突变体，进而通过本专利中的方法将其用于水稻杂交制种。

例如，利用诱变筛选，发明人还获得了OsFMS2的另外一个突变体植株，其中在OsFMS2的第3外显子与第4外显子之间的内含子上，剪切识别位点“GT—AG”突变为“AT--AG”，突变后的基因组DNA序列为SEQ ID NO：23，同样获得了雌性不育突变株，可利用本专利中的方法将其用于水稻杂交制种。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京思创达科技有限公司

<120> 雌性不育系的繁殖及杂交制种技术

<130> SCDP001

<150> 201410001109.7

<151> 2014-01-02

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 1

atggggaggg gcaggattga gatcaagagg atcgagaaca cgacaagccg ccaggtgacc 60

ttctgcaagc gccgcaacgg gcttctcaag aaggcgtatg agctctccgt cctctgcgat 120

gccgaggtgg ctctcatcgt cttctccagc cgtggccgcc tctacgagta ctccaacaac 180

aacaatgtga aggctacaat tgacaggtac aagaaggcgc atgcttgtgg ctcaacttct 240

ggtgcacctc tcatagaggt caatgctcag caatactacc agcaggagtc tgccaaactg 300

cgccaccaga ttcagatgct gcaaaacacc aacaagcacc tggttggcga taatgtgagc 360

aacctgtcac tgaaggagct gaagcaactt gaaagccgcc tggagaaagg cattgcaaag 420

atcagagcca ggaagaatga actgctggct tcagagatca attacatggc caaaagggag 480

attgagcttc agaacgacaa catggacctc agaaccaaga ttgctgagga ggagcagcag 540

ctgcagcagg tgacggtggc ccggtcggcc gccatggagc tgcaggctgc ggcggcggcg 600

cagcagcagc agcagaatcc gttcgcggtg gcggcggcgc agttggacat gaagtgcttc 660

ttcccgttga acctgttcga ggcggcggcg caggtgcagg ccgtggcggc gcagcgccag 720

cagatcatcc ccaccgagct caacctcggc taccaccacc acctcgccat tcccggcgcc 780

accgccgccg acgcgccgcc tcctcacttc tga 813

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 2

Met Gly Arg Gly Arg Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Ser Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ser Asn Asn Asn Asn Val Lys

50 55 60

Ala Thr Ile Asp Arg Tyr Lys Lys Ala His Ala Cys Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Gly Ala Pro Leu Ile Glu Val Asn Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu

85 90 95

Ser Ala Lys Leu Arg His Gln Ile Gln Met Leu Gln Asn Thr Asn Lys

100 105 110

His Leu Val Gly Asp Asn Val Ser Asn Leu Ser Leu Lys Glu Leu Lys

115 120 125

Gln Leu Glu Ser Arg Leu Glu Lys Gly Ile Ala Lys Ile Arg Ala Arg

130 135 140

Lys Asn Glu Leu Leu Ala Ser Glu Ile Asn Tyr Met Ala Lys Arg Glu

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Asn Asp Asn Met Asp Leu Arg Thr Lys Ile Ala Glu

165 170 175

Glu Glu Gln Gln Leu Gln Gln Val Thr Val Ala Arg Ser Ala Ala Met

180 185 190

Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gln Gln Gln Gln Asn Pro Phe

195 200 205

Ala Val Ala Ala Ala Gln Leu Asp Met Lys Cys Phe Phe Pro Leu Asn

210 215 220

Leu Phe Glu Ala Ala Ala Gln Val Gln Ala Val Ala Ala Gln Arg Gln

225 230 235 240

Gln Ile Ile Pro Thr Glu Leu Asn Leu Gly Tyr His His His Leu Ala

245 250 255

Ile Pro Gly Ala Thr Ala Ala Asp Ala Pro Pro Pro His Phe

260 265 270

<210> 3

<211> 813

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Japonica）

<400> 3

atggggaggg gcaggattga gatcaagagg atcgagaaca cgacaagccg ccaggtgacc 60

ttctgcaagc gccgcaacgg acttctcaag aaggcgtatg agctctccgt cctctgcgat 120

gccgaggtgg ctctcatcgt cttctccagc cgtggccgcc tctacgagta ctccaacaac 180

aacaatgtga aggctacaat tgacaggtac aagaaggcgc atgcttgtgg ctcaacttct 240

ggtgcacctc tcatagaggt caatgctcag caatactacc agcaggagtc tgccaaactg 300

cgccaccaga ttcagatgct gcaaaacacc aacaagcacc tggttggcga taatgtgagc 360

aacctgtcac tgaaggagct gaagcaactt gaaagccgcc tggagaaagg catttcaaag 420

atcagagcca ggaagaatga actgctggct tcagagatca attacatggc caaaagggag 480

attgagcttc agaacgacaa catggacctc agaaccaaga ttgctgagga ggagcagcag 540

ctgcagcagg tgacggtggc ccggtcggcc gccatggagc tgcaggctgc ggcggcggcg 600

cagcagcagc agcagaatcc gttcgcggtg gcggcggcgc agctggacat gaagtgcttc 660

ttcccgttga acctgttcga ggcggcggcg caggtgcagg ccgtggcggc gcagcgccag 720

cagatcatcc ccaccgagct caacctcggc taccaccacc accttgccat tcccggcgcc 780

gccgccgccg acgcgccgcc tcctcacttc tga 813

<210> 4

<211> 270

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa Japonica）

<400> 4

Met Gly Arg Gly Arg Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Ser Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ser Asn Asn Asn Asn Val Lys

50 55 60

Ala Thr Ile Asp Arg Tyr Lys Lys Ala His Ala Cys Gly Ser Thr Ser

65 70 75 80

Gly Ala Pro Leu Ile Glu Val Asn Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu

85 90 95

Ser Ala Lys Leu Arg His Gln Ile Gln Met Leu Gln Asn Thr Asn Lys

100 105 110

His Leu Val Gly Asp Asn Val Ser Asn Leu Ser Leu Lys Glu Leu Lys

115 120 125

Gln Leu Glu Ser Arg Leu Glu Lys Gly Ile Ser Lys Ile Arg Ala Arg

130 135 140

Lys Asn Glu Leu Leu Ala Ser Glu Ile Asn Tyr Met Ala Lys Arg Glu

145 150 155 160

Ile Glu Leu Gln Asn Asp Asn Met Asp Leu Arg Thr Lys Ile Ala Glu

165 170 175

Glu Glu Gln Gln Leu Gln Gln Val Thr Val Ala Arg Ser Ala Ala Met

180 185 190

Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gln Gln Gln Gln Asn Pro Phe

195 200 205

Ala Val Ala Ala Ala Gln Leu Asp Met Lys Cys Phe Phe Pro Leu Asn

210 215 220

Leu Phe Glu Ala Ala Ala Gln Val Gln Ala Val Ala Ala Gln Arg Gln

225 230 235 240

Gln Ile Ile Pro Thr Glu Leu Asn Leu Gly Tyr His His His Leu Ala

245 250 255

Ile Pro Gly Ala Ala Ala Ala Asp Ala Pro Pro Pro His Phe

260 265 270

<210> 5

<211> 813

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 5

atggggaggg gcaggattga gatcaagagg atcgagaaca cgacaagccg ctaggtgacc 60

ttctgcaagc gccgcaacgg gcttctcaag aaggcgtatg agctctccgt cctctgcgat 120

gccgaggtgg ctctcatcgt cttctccagc cgtggccgcc tctacgagta ctccaacaac 180

aacaatgtga aggctacaat tgacaggtac aagaaggcgc atgcttgtgg ctcaacttct 240

ggtgcacctc tcatagaggt caatgctcag caatactacc agcaggagtc tgccaaactg 300

cgccaccaga ttcagatgct gcaaaacacc aacaagcacc tggttggcga taatgtgagc 360

aacctgtcac tgaaggagct gaagcaactt gaaagccgcc tggagaaagg cattgcaaag 420

atcagagcca ggaagaatga actgctggct tcagagatca attacatggc caaaagggag 480

attgagcttc agaacgacaa catggacctc agaaccaaga ttgctgagga ggagcagcag 540

ctgcagcagg tgacggtggc ccggtcggcc gccatggagc tgcaggctgc ggcggcggcg 600

cagcagcagc agcagaatcc gttcgcggtg gcggcggcgc agttggacat gaagtgcttc 660

ttcccgttga acctgttcga ggcggcggcg caggtgcagg ccgtggcggc gcagcgccag 720

cagatcatcc ccaccgagct caacctcggc taccaccacc acctcgccat tcccggcgcc 780

accgccgccg acgcgccgcc tcctcacttc tga 813

<210> 6

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atggcctcct ccgagaacgt gatcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggccaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtag 678

<210> 7

<211> 812

<212> DNA

<213> 大麦(Hordeum vulgare)

<400> 7

aaccgtctct tcgtgagaat aaccgtggcc taaaaataag ccgatgagga taaataaaat 60

gtggtggtac agtacttcaa gaggtttact catcaagagg atgcttttcc gatgagctct 120

agtagtacat cggacctcac atacctccat tgtggtgaaa tattttgtgc tcatttagtg 180

atgggtaaat tttgtttatg tcactctagg ttttgacatt tcagttttgc cactcttagg 240

ttttgacaaa taatttccat tccgcggcaa aagcaaaaca attttatttt acttttacca 300

ctcttagctt tcacaatgta tcacaaatgc cactctagaa attctgttta tgccacagaa 360

tgtgaaaaaa aacactcact tatttgaagc caaggtgttc atggcatgga aatgtgacat 420

aaagtaacgt tcgtgtataa gaaaaaattg tactcctcgt aacaagagac ggaaacatca 480

tgagacaatc gcgtttggaa ggctttgcat cacctttgga tgatgcgcat gaatggagtc 540

gtctgcttgc tagccttcgc ctaccgccca ctgagtccgg gcggcaacta ccatcggcga 600

acgacccagc tgacctctac cgaccggact tgaatgcgct accttcgtca gcgacgatgg 660

ccgcgtacgc tggcgacgtg cccccgcatg catggcggca catggcgagc tcagaccgtg 720

cgtggctggc tacaaatacg taccccgtga gtgccctagc tagaaactta cacctgcaac 780

tgcgagagcg agcgtgtgag tgtagccgag ta 812

<210> 8

<211> 331

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc 60

agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 120

attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 180

ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 240

tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 300

cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga t 331

<210> 9

<211> 331

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）

<400> 9

cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc 60

agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 120

attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 180

ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 240

tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 300

cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga t 331

<210> 10

<211> 7493

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 10

aatccagcca tatatatttg ttgcaattat cttttgtttt ggcagagtaa cctaaaggga 60

aattcgtacc ctatcaatca tattttttta gataaggcta aaaaaagcta ccactcactc 120

ttaagaatat gttaattgga agaaaaaaag agaagctacc attcattctc aagaatatgt 180

taattgaaga aaaagagagc tatctacacc atccatcatg gtgggaccag attgtagcta 240

caaatgtatg gaaaatacaa atgtatttgt agaaatagag aaaaagttgc atatcaagta 300

cagtcatatt tcaaatagcc ctgtacaact gtgaaggaat ctcgactagt tgtctcttgg 360

tttgagggat atacctattt taggatgact gatatttcta gaaccacact ctaattcaaa 420

tctgctgatt tcatgtgtag agtacacact tctgatagat ttagcttctt aattgggcac 480

agctaactag ctagctctgc ccatttggtc tctccaattc tccatgagat aattaagtag 540

caatttataa gggattaaca aaatgcagca gcacacaaat actatatata tagccacatc 600

agtgtctgtc tgcataacag cataagatat agaagatgag ctgatcatca tatccatggc 660

agcaggccgg tgcagaatga agttcatgag gttcagaagt gaggaggcgg cgcgtcggcg 720

gcggtggcgc cgggaatggc gaggtggtgg tggtagccga ggttgagctc ggtggggatg 780

atctgctggc gctgcgccgc cacggcctgc acctgcgccg ccgcctcgaa caggttcaac 840

gggaagaagc acttcatgtc caactgcgcc gccgccaccg cgaacggatt ctgctgctgc 900

tgctgcgccg ccgccgcagc ctgcagctcc atggcggccg accgggccac cgtcacctgc 960

tgcagctgct gctcctcctc agcaatctgc aagtgtgcac atgatctctc atcaacgtat1020

agtagagaca gatgtgtcgt tgatgtagag atatattgtt cttttcgtca agctttatag1080

attaattagc tagctatttg ttcaaattaa tttaaacaaa tagctagcta attaatctct1140

gatttgcaaa caagaaattg gaagttggtt ctgatttctt gcagtcacct gatatgtatt1200

taccttggtt ctgaggtcca tgttgtcgtt ctgaagctca atctcctgaa atcatgacaa1260

gaacattgca aatgagtaat gctaacaaga attatgcaat caggtaaaaa gaatagagga1320

ttaagaaagg agtttgcaat cattgatcag tatgtacaat tgtatgtaag atgcaattct1380

agtaacacac ataccctttt ggccatgtaa ttgatctctg aagccagcag ttcattctga1440

gaaaaaatta aacaaataag gattaacagt taatttgtac atttttaagg ccacttagta1500

agttaacatt gcatcagaaa ctgaagaatt gttcaaacaa agtaaatcaa ggtgatcata1560

tatatctaac agcactgaga ttttgttcta aaggtgacac catgaggttg gtaattgaat1620

gttcatgtga aaatggtatt ttatatatag ttgtttacct tcctggctct gatctttgca1680

atgcctttct ccaggcggct ttcaagttgc ttcagctcct tcagtgacag gttgctcaca1740

ttatcgccaa ccaggtgcct ttcacatagg aaaacaaacc aaacgaaaat aggtatttcc1800

aggtcatcac attgattctg tcaagtaatc tcttttcaat attatcatcg atatatacac1860

atgtgtttct tgaatggcag atataaaaat tgtgtattag tattaggcac ttacttgttg1920

gtgttttgca gcatctgaat ctggtggcgc agtttggcag actcctgctg gtagtattgc1980

ttcagacaag ataattaaca agacgatcga tcagatttaa ttacgtttat catgtagctc2040

taattgatca gcaaaaaaaa aagtaacagt aaccttaatt gtagtgcaac agaatgactg2100

cattcatgct tttacattga agtttatttt gtgaattttg tttgttctct tcagtcacta2160

actttaaatt gcaagccact agccacaaaa gggtacactt acagtttcta agaaaagtat2220

actcttaaac tcagagaaag acaaatatat ggagaacttc agtgcagaat tgcagactag2280

gcattaggca atctccaagt ggttcacata ctacattaat tatgaattca atcttgtcgt2340

aaagattgat gctgtatagc tataacacat gaatgtatat aagcacaaag atcaagccat2400

accctgatga aactaacaaa ttaatataat gcagcagtca attacctacc acaaaaagta2460

tataaaatac tttaaatgca aggcatctat atgctctcac tttatatgta tgaatatgcc2520

ttggttttag aatagtcacc aaattaattt aactgaaact aaggcaaaat gaatagaaga2580

aggtaattaa caaagcagca acatatatat gggttacctg agcattgacc tctatgagag2640

gtgcaccaga agttgagcca caagcatgcg ccttcttgta cctgtcaatt gtagccttca2700

cactgcagta tatatcccat cagtcgagtg gtactctctc aacactacaa cataaatact2760

gataattgtg catgcatggt aatgtagtgt gttcatatat gccaacaaga gaagaaatgc2820

aacacacatg actatacatg tcatgaatgc agaaataatg catgtgagga gcaagcgttt2880

aattacttca gcataaaatt gtgcagaaga aaggtagcca ttggaatgca tgctgtctct2940

agctgcaaga actgtgttga agcgaacaca agaacggaat gaaatgagta tacacgagct3000

agagagaaag agagatggtc agatggatgg ccattggctt attaactgat gcacaacttt3060

gcaccggaga agagcaaaca cagcgaatat gggaggacgt tgctgcagtt tctagcttgg3120

tgcaagttct tctcatgcat gtccatggtg tctatatgtg tatcggtgta tggagaagca3180

aggaaaagga aactcttgat agctagtttc tagggtgaac tatctactga acatacaaca3240

ttgacaggag actgagcttc cttgctgtgc atgatatgat gtgtgttgtg tgaactgtgg3300

agaataaaat atgataaaag atggcagtgg ctttgctagc tgctcaagta ctgatagcac3360

tgatatatat tatgtaaagt ttgcatgcat gcatactcat gtacatgtac tcgagagaga3420

ttgcaaatga atttgacatg tataaaaaca atgagacttt gcaaacttta aataattatt3480

tgactgcatg catgaatgaa ttggaagggg attctaatgt atctttcaaa tagcctcccc3540

ttaatatgtg tgtacatatc taattcacac atctcacttt gaaaatgatg agcaatagct3600

aaggaatttt ccatggaggt taagagagta actttattta gatacaaaaa caatataatc3660

atgcatgcat gacaaatcac catatatagt accatgcata tagtttgaaa taaatcttac3720

aattttattt cgtaatctga gcagatgata actgaaaaaa gtaagcaagt cttgttacat3780

gcacagatga aattaaagtc catgcataca tggttaattc tttccagcaa aatcaattta3840

gcaagcagga tatataaatg gactttagta aagccttctg accataagac taagaaaatt3900

agaacagaat aatccttttt caagtaacta aacaggacaa cattttcagc attaatctta3960

cagctagctg atgagcaaac atatacatct tgatgagttt ttatgataaa ctctaacatt4020

tttcctaaat catttcacac cttgagttaa gtaattcaca tatcatctaa gaatgtgtat4080

aatattaaac tcattctaaa atatttacca agagtcagtt ttaaccacaa ctaaactttt4140

actcaataac aaactattag ccacaaataa agcaacacaa caagcacgct gagcatgaaa4200

tgacacgaag ggaaacaaag caatcagcaa gatcagcaag ttagtttcaa gaactgagta4260

caaaattaag ccaatatatt tacagcaagt acatacttgt tgttgttgga gtactcgtag4320

aggcggccac ggctggagaa gacgatgaga gccacctcgg catcgcagag gacggagagc4380

tcatacgcct tcttgagaag cccgttgcgg cgcttgcaga aggtcacctg gcggcttgtc4440

gtgttctcga tcctcttgat ctcaatcctg cccctcccca tgtcttcttg ctctcaactg4500

atcaacaaaa aaggagacca gagatcagat caaagaacag caaaaacatt gcatgagaag4560

tttgatagat gcagaagaga gagtactgat gaaagatctg gtaatgatta aagaacagca4620

caaactctca gctgattaaa aaagagagag agaccggatt aaagaaacaa ctaaaacttg4680

catgagaaat tgatagatgc agaaaagaga ctgatgaaag atctagtagt gatttacagt4740

actacatcac acgctgatcg atctaagaaa ttaatgaatt caactatact gagagatctg4800

agatcgtgat tcacatagta tgtgtataaa gtgatcgatc taacaaattc aagcatgttt4860

tatacatgta aatccaaaag gaataagaaa ccagctatag ctaaagaggg gtaaaacaag4920

agaaaaaaac tgaactttga aagaaaaaga tgatttttgc ttataaaaaa gaaagaaaaa4980

gatgatgaaa gacttggcgg atatggatca aatttggaga ctgggacaat atctatccca5040

tcatttgaca taagcaaagc tcaatcatcg cctatttaga agatatagag cctagatgca5100

agtatagagt gatcgagtaa acaagatcta gcaaaagtag tctcaagaaa caaaactttc5160

agatgtgcag agattgctcg aaataatgaa gggaagaagc gaaaaagaaa gctcaaagaa5220

ccagatgggt agatgaatca agaaggataa gatgcaagaa cagcacgtct ccacaaaaag5280

gaaaaaaaga accaaccaaa tctgaagaat catgtttaag aaagcatgga aaagctagca5340

atttcgattt gcttaactaa ctatcttaac atatctagct aagaattgac caaagaaaac5400

tcatcacaaa gtgagaagca agaggtcggc cgcaggaaac tagcttcttc cttttctcct5460

gtctcctcac aagatcaaag atctgcctaa ggcaagaaga gaaatttcaa gaaagaacga5520

aaaaactgaa accttccaaa agaaaccagg atcactgggc cggaaagaat ccttgctaca5580

taaatagaga aagaagctag gaagaatttc caatctgaac aaagaagcat caaactggaa5640

gccaagcatc acagtttctc tttgcaagaa ctcgaagcac aggaaaaggg tttcttttcc5700

tcaaagagag aacatacaaa cttgaatcta aactgcagct gaatcagtgc cttaacaaag5760

aactctacac acacccagat aactaaaaca cattagcacg caaagagata tataacctag5820

ctaaaattgg tcctgaagct gatctgatct ttctttctct accttcgttt cttggagtag5880

gaaaggagag ctccagttgg tgggttttct gctgctgtgt gaggtgcaga ggattaatag5940

gagaaggcaa agggaaagca ggaaagagag gaagaagggc tagctagcta gcttagctgc6000

aaaggccact ggccttcttt gctatcttgc ttacccattt atagctattt agacatcttt6060

gcatgtatat tctttaagca agaatttata acctctcttt ttttctatct tgtgtaattt6120

gtgcctagaa acactgatct gcagagagga tatttagttg tttgtacttt gtaggcactg6180

ctaaagtatg tttagagatt ggtcgatgtc cagaaggctg gagttataag caacctagca6240

agttatgaaa aaaataagca actgatcatc ccttgttatg tgtttagtac atctgcagaa6300

taactgaagt caacttgccg gttaattatc atatatgcat gcctagctag ttcttgcaaa6360

tgttgtgtgc ttaattttgg aagaattagt tatataggtg ctaattctag aacttgatta6420

gcatggacac attaagcagc ctttttttgt tacacaagct ttcatattat ttccattatc6480

acatgcacag ccacaactat atatatatat acacacacac acacttgctg ccctaattag6540

atagtaagat gacttgctaa tcctgacata aatcgacagc tggttcaaat tggcatagta6600

caaccttcca agtatttttt gtctatcctt ggtttcaatt tccttggaga ggaaagatac6660

atatgttgcc tatgtatgca tgcacagaaa accatacata cactgcatca cactgttgcg6720

ttctttctaa cacacagtgt atatgcagct tctgagtaac ttgtattcaa ctcatatata6780

tccatttatt atcttattaa aaagtacttt tttgttgcat gaatacatgc attgtctagt6840

aatgtggcag ttcatttcct agccatgcat ctgcaatgca aaccaagtgg tagctactag6900

atgctagttg gctagctagt tccaattgct tggcaattca catgcatata tatgaagaac6960

acaccaacct ctcctagctt gcaaaagctc actgtaatat atagctagta cagcacagat7020

aatatgaggc tgcagtgaca tggcaatata tgcaatccca aaccctatct ccattgctac7080

ttgctatagc ctctcttgct atctctctct cactcccttg tgatgcaaat gcaatagcca7140

gcagcattga ctgctagctg tgtgtactgc tgcatgcttg ccattcttgt tgctgttggt7200

ggccagggag gagaacattt ctctccatgc ttgtttcagc tttcagattg aatgcatggt7260

gccaaataaa ttaaatactt gaaagcctaa cctggaaggt tgcaaacttg caatcacgtt7320

gtatatattt tgatgttagc atatatttag cactccaatt aactccatta gtttctttgt7380

taattttttt attttctttt tttagagaag ggtatttttg ttgttaatta gtttctagtt7440

aatgtcccaa attattctgt actctgactg acaggatata ttggcgggta aac 7493

<210> 11

<211> 2971

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 11

gtcagagtac agaataattt gggacattaa ctagaaacta attaacaaca aaaataccct 60

tctctaaaaa aagaaaataa aaaaattaac aaagaaacta atggagttaa ttggagtgct 120

aaatatatgc taacatcaaa atatatacaa cgtgattgca agtttgcaac cttccaggtt 180

aggctttcaa gtatttaatt tatttggcac catgcattca atctgaaagc tgaaacaagc 240

atggagagaa atgttctcct ccctggccac caacagcaac aagaatggca agcatgcagc 300

agtacacaca gctagcagtc aatgctgctg gctattgcat ttgcatcaca agggagtgag 360

agagagatag caagagaggc tatagcaagt agcaatggag atagggtttg ggattgcata 420

tattgccatg tcactgcagc ctcatattat ctgtgctgta ctagctatat attacagtga 480

gcttttgcaa gctaggagag gttggtgtgt tcttcatata tatgcatgtg aattgccaag 540

caattggaac tagctagcca actagcatct agtagctacc acttggtttg cattgcagat 600

gcatggctag gaaatgaact gccacattac tagacaatgc atgtattcat gcaacaaaaa 660

agtacttttt aataagataa taaatggata tatatgagtt gaatacaagt tactcagaag 720

ctgcatatac actgtgtgtt agaaagaacg caacagtgtg atgcagtgta tgtatggttt 780

tctgtgcatg catacatagg caacatatgt atctttcctc tccaaggaaa ttgaaaccaa 840

ggatagacaa aaaatacttg gaaggttgta ctatgccaat ttgaaccagc tgtcgattta 900

tgtcaggatt agcaagtcat cttactatct aattagggca gcaagtgtgt gtgtgtgtat 960

atatatatat agttgtggct gtgcatgtga taatggaaat aatatgaaag cttgtgtaac1020

aaaaaaaggc tgcttaatgt gtccatgcta atcaagttct agaattagca cctatataac1080

taattcttcc aaaattaagc acacaacatt tgcaagaact agctaggcat gcatatatga1140

taattaaccg gcaagttgac ttcagttatt ctgcagatgt actaaacaca taacaaggga1200

tgatcagttg cttatttttt tcataacttg ctaggttgct tataactcca gccttctgga1260

catcgaccaa tctctaaaca tactttagca gtgcctacaa agtacaaaca actaaatatc1320

ctctctgcag atcagtgttt ctaggcacaa attacacaag atagaaaaaa agagaggtta1380

taaattcttg cttaaagaat atacatgcaa agatgtctaa atagctataa atgggtaagc1440

aagatagcaa agaaggccag tggcctttgc agctaagcta gctagctagc ccttcttcct1500

ctctttcctg ctttcccttt gccttctcct attaatcctc tgcacctcac acagcagcag1560

aaaacccacc aactggagct ctcctttcct actccaagaa acgaaggtag agaaagaaag1620

atcagatcag cttcaggacc aattttagct aggttatata tctctttgcg tgctaatgtg1680

ttttagttat ctgggtgtgt gtagagttct ttgttaaggc actgattcag ctgcagttta1740

gattcaagtt tgtatgttct ctctttgagg aaaagaaacc cttttcctgt gcttcgagtt1800

cttgcaaaga gaaactgtga tgcttggctt ccagtttgat gcttctttgt tcagattgga1860

aattcttcct agcttctttc tctatttatg tagcaaggat tctttccggc ccagtgatcc1920

tggtttcttt tggaaggttt cagttttttc gttctttctt gaaatttctc ttcttgcctt1980

aggcagatct ttgatcttgt gaggagacag gagaaaagga agaagctagt ttcctgcggc2040

cgacctcttg cttctcactt tgtgatgagt tttctttggt caattcttag ctagatatgt2100

taagatagtt agttaagcaa atcgaaattg ctagcttttc catgctttct taaacatgat2160

tcttcagatt tggttggttc tttttttcct ttttgtggag acgtgctgtt cttgcatctt2220

atccttcttg attcatctac ccatctggtt ctttgagctt tctttttcgc ttcttccctt2280

cattatttcg agcaatctct gcacatctga aagttttgtt tcttgagact acttttgcta2340

gatcttgttt actcgatcac tctatacttg catctaggct ctatatcttc taaataggcg2400

atgattgagc tttgcttatg tcaaatgatg ggatagatat tgtcccagtc tccaaatttg2460

atccatatcc gccaagtctt tcatcatctt tttctttctt ttttataagc aaaaatcatc2520

tttttctttc aaagttcagt ttttttctct tgttttaccc ctctttagct atagctggtt2580

tcttattcct tttggattta catgtataaa acatgcttga atttgttaga tcgatcactt2640

tatacacata ctatgtgaat cacgatctca gatctctcag tatagttgaa ttcattaatt2700

tcttagatcg atcagcgtgt gatgtagtac tgtaaatcac tactagatct ttcatcagtc2760

tcttttctgc atctatcaat ttctcatgca agttttagtt gtttctttaa tccggtctct2820

ctctcttttt taatcagctg agagtttgtg ctgttcttta atcattacca gatctttcat2880

cagtactctc tcttctgcat ctatcaaact tctcatgcaa tgtttttgct gttctttgat2940

ctgatctctg gtctcctttt ttgttgatca g 2971

<210> 12

<211> 440

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 12

ctacacatga aatcagcaga tttgaattag agtgtggttc tagaaatatc agtcatccta 60

aaataggtat atccctcaaa ccaagagaca actagtcgag attccttcac agttgtacag 120

ggctatttga aatatgactg tacttgatat gcaacttttt ctctatttct acaaatacat 180

ttgtattttc catacatttg tagctacaat ctggtcccac catgatggat ggtgtagata 240

gctctctttt tcttcaatta acatattctt gagaatgaat ggtagcttct ctttttttct 300

tccaattaac atattcttaa gagtgagtgg tagctttttt tagccttatc taaaaaaata 360

tgattgatag ggtacgaatt tccctttagg ttactctgcc aaaacaaaag ataattgcaa 420

caaatatata tggctggatt 440

<210> 13

<211> 1488

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 13

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240

caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300

tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360

ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420

ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480

ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540

gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cctggactgg 600

ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660

acgggcgagg ggttcgcggc ggcgcccgac atcgaccacc tcaacccgcg cgtgcagcgg 720

gagctctccg cctggctcaa ctggctcagg tccgacgccg tggggttcga cggctggcgc 780

ctcgacttcg ccaagggcta ctcgccggcc gtcgccagaa tgtacgtgga gagcacgggg 840

ccgccgagct tcgtcgtcgc ggagatatgg aactcgctga gctacagcgg ggacggcaag 900

ccggcgccca accaggacca gtgccggcag gagctgctgg actggacgcg ggccgtcggc 960

gggcccgcca tggcgttcga cttccccacc aagggcctgc tgcaggcggg cgtgcagggg1020

gagctgtggc ggctgcgcga cagctccggc aacgcggccg gcctgatcgg gtgggcgccc1080

gagaaggccg tcaccttcgt cgacaaccat gacaccgggt cgacgcagaa gctctggccg1140

ttcccatccg acaaggtcat gcagggctac gcctacatcc tcacccatcc aggagtcccc1200

tgcattttct acgaccacat gttcgactgg aacctgaagc aggagatatc cacgctgtct1260

gccatcaggg cgcggaacgg catccgcgcc gggagcaagc tgcggatcct cgtggcggac1320

gcggacgcgt acgtggccgt cgtcgacgag aaggtcatgg tgaagatcgg gacaaggtac1380

ggcgtgagca gcgtggtccc gtcggatttc cacccggcgg cgcacggcaa ggactactgc1440

gtctgggaga aagcgagcct ccgcgtcccg gcggggcgcc acctctag 1488

<210> 14

<211> 2737

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 14

tgcaccggac actgtctggt ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct 60

tcggttcctt tgctcctttg cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg 120

aacctttatg cacctgtgga atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt 180

gttgggcatt caaccaccaa aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca 240

atctccccct ttttggtgat tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa 300

ttgaactagt ttgcataagg taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt 360

ttacttgata tgcatggttg ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac 420

ttgttttgtt ttttgcaaat ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc 480

aaaggtatat gaataagatt gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt 540

tcaaatgctt ttcctttgac taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt 600

tcaagagggt tttaaataga tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata 660

taccaattga aaatcaacat accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa 720

aaagtggtgg tgcggtcctt ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaatc 780

gccaaaaacg gagactttgt gagccattta tactttctcc ccattggtaa atgaaatatg 840

agtgaaagat tataccaaat ttggacagtg atgcggagtg acggcgaagg ataaacgata 900

ccgttagagt ggagtggaag ccttgtcttc gccgaagact ccatttccct ttcaatctac 960

gacttagcat agaaatacac ttgaaaacac attagtcgta gccacgaaag agatatgatc1020

aaaggtatac aaatgagcta tgtgtgtaat gtttcaatca aagtttcgag aatcaagaat1080

atttagctca ttcctaagtt tgctaaaggt tttatcatct aatggtttgg taaagatatc1140

gactaattgt tctttggtgc taacataagc aatctcgata tcaccccttt gttggtgatc1200

cctcaaaaag tgataccgaa tgtctatgtg cttagtgcgg ctgtgttcaa cgggattatc1260

cgccatgcag atagcactct cattgtcaca taggagaggg actttgctca atttgtagcc1320

atagtcccta aggttttgcc tcatccaaag taattgcaca caacaatgtc ctgcggcaat1380

atacttggct tcggcggtag aaagagctat tgagttttgt ttctttgaag tccaagacac1440

cagggatctc cctagaaact gacaagtccc tgatgtgctc ttcctatcaa ttttacaccc1500

tgcccaatcg gcatctgaat atcctattaa atcaaaggtg gatcccttgg ggtaccaaag1560

accaaattta ggagtgtaaa ctaaatatct catgattctt ttcacggccc taaggtgaac1620

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agatgcacat aaatagagta aagatcctat catcgaccgg tatacctttt ggtctacgga1740

tttacctccc gtgtcgaggt cgagatgccc attagttccc atgggtgtcc tgatgggctt1800

ggcatccttc attccaaact tgttgagtat gtcttgaatg tactttgttt ggctgatgaa1860

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agacatctcg aatttcggaa tcatgatcct actaaactct tcacaagtag atttgttagt1980

agacccaaat ataatatcat caacataaat ttggcataca aacaaaactt ttgaaatggt2040

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atagagtgaa aattaatcca gaggctctat tagaaccttc aattagtaat accaagatat2460

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<210> 15

<211> 225

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 15

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<210> 16

<211> 348

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 16

gatctgacaa agcagcatta gtccgttgat cggtggaaga ccactcgtca gtgttgagtt 60

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<210> 17

<211> 591

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 17

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<210> 18

<211> 196

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 18

Met Asp Leu Val Ser Pro Ser Glu His Leu Cys Tyr Val Arg Cys Thr

1 5 10 15

Tyr Cys Asn Thr Val Leu Ala Leu Gln Val Gly Val Pro Cys Lys Arg

20 25 30

Leu Met Asp Thr Val Thr Val Lys Cys Gly His Cys Asn Asn Leu Ser

35 40 45

Phe Leu Ser Pro Arg Pro Pro Met Val Gln Pro Leu Ser Pro Thr Asp

50 55 60

His Pro Leu Gly Pro Phe Gln Gly Pro Cys Thr Asp Cys Arg Arg Asn

65 70 75 80

Gln Pro Leu Pro Leu Val Ser Pro Thr Ser Asn Glu Gly Ser Pro Arg

85 90 95

Ala Pro Phe Val Val Lys Pro Pro Glu Lys Lys His Arg Leu Pro Ser

100 105 110

Ala Tyr Asn Arg Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln Arg Ile Lys Ala Ala

115 120 125

Lys Pro Asp Ile Pro His Arg Glu Ala Phe Ser Met Ala Ala Lys Asn

130 135 140

Trp Ala Lys Cys Asp Pro Arg Cys Ser Ser Thr Val Ser Thr Ser Asn

145 150 155 160

Ser Asn Pro Glu Pro Arg Val Val Ala Ala Pro Ile Pro His Gln Glu

165 170 175

Arg Ala Asn Glu Gln Val Val Glu Ser Phe Asp Ile Phe Lys Gln Met

180 185 190

Glu Arg Ser Gly

195

<210> 19

<211> 591

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 19

atggatctcg tgtcgccgtc cgagcacctg tgctacgtgc gctgcaccta ctgcaacacc 60

gtgctcgcgc tgcaggttgg agccccatgc aagaggctga tggacaccgt gaccgtgaaa 120

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gctgccaaga actgggcgaa gtgcgacccc cgctgctcat cgacggtttc cacctccaac 480

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caggtggtcg agagcttcga catcttcaag cagatggagc gcagcggcta g 591

<210> 20

<211> 5426

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 20

cagtaaaagg cagcccatca taagctttca ttaattagcg gtacgtgtac tttttcactg 60

aagctaggag catgcctaaa cgtacctgca actctcatgt gaaaaactca cctactaaca 120

taatcgatta gtcacgagtg cataatgaac acatatagct agtgtcgatc ggccgtatca 180

tcaaagtatg ttatctggac ctacaataat cgaccagctt atcgattgaa agacaaaaag 240

gttgtacgta tagtttgcta ggtagcattg gtacgttgta ctccttatat attgtcaaat 300

gacttgatat aaagtatgta gtagcacata ataaggcacg caacagttgc tactttccca 360

gcttgctgtc tgagtgatct ctgaactgtt cttttgttct caatgaacaa taaacataaa 420

agcgatgtta tatatcattt ggccctgaat gttagtgcag atattaacat atatatagat 480

actcgtgcat catggatgca tcaagataaa cctaaccgca aaaacatttg catgcatgta 540

tgcacacata tccttaaaaa atatccgtgc ttgcttaatt tgattattgt ttcattattt 600

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accagtggcg aaaacaacag ccaaacaaca tgttaataat tagatcgatc ccctccctca 780

cacacacccc ccgtggcgtc gccatcggag cttctgttca tgtgtctccg atctgcagca 840

gagctttgcc tttttaattt gtccggagat gcatgcatcg atcgatccaa acagctcgat 900

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tatgtagtaa atgtccacga tcagcttttc caaatactct taactactat aatttatctg1380

aatttacttc ttctaaaaca ctcctaaaaa agattggaag tacactagtc acgcataatc1440

aatagaaata tttttattat taattttact aatgcgattt ttatttgaaa aatcatatac1500

ttatttttca tatatttata tttaaagaat tatctataag aaaattatta ttattgaaat1560

cgagccagcc caactggtgt tatattaaga agagaaaata tgtatacaca aggtgctgtc1620

aactactccc tccattttat attgtagtcg ttttactctt tttttcttgt caaactttat1680

caaatttgac caattttata gaaaaaatta gcaacatata aaatatcaaa ttagtttcat1740

taaatcgaac attaaatata ttttaataat atgtttgttt tatgttgaaa atactactat1800

atttttctat aaatttaatc aaacttgaaa aagtttgact aagaaaaaag tcaaacgact1860

tataatatga aatggaggga gtaattacaa aataaaactg agaaacctac tacattcctc1920

aacaactcaa atgccagtta aggaagatat tctctaaaga tttcacacca cacaagctcc1980

aaagtttcat ttccgatcct ccatagaaaa aagaaactcc tagatatttc aattttcaaa2040

aaacatttca aaaatctata aactgcagag attattttag gtgctctgag aactaacacc2100

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gcccttttat tcataggaag gataggaatt ttttcataaa ggattgcact gctatggttc4440

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attaaagaaa catgcaacta cacaatttct gcattttttt ccttttcttg tgttttttct4620

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gtgcatcatt caggctgacc ttggtgtggt tagcaaggtg taatagtggt tgtttggttg4740

catgtattag tttaacctgg ttttatatga ggtgttgttt cattggttgg atcgatatgt4800

gaaaacttgt atgcatggta ttcgtttggt tggataaatg aaccttgagt atactcatct4860

ttctatgtgg atggtaagat tatccctact acccataaat agaaatatta ccaagtgcaa4920

gatactctaa attattataa aatacacaca tttcagatat aaatgcagct aagtcaaatg4980

cgatcgccta cacatgaaat cagcagattt gaattagagt gtggttctag aaatatcagt5040

catcctaaaa taggtatatc cctcaaacca agagacaact agtcgagatt ccttcacagt5100

tgtacagggc tatttgaaat atgactgtac ttgatatgca actttttctc tatttctaca5160

aatacatttg tattttccat acatttgtag ctacaatctg gtcccaccat gatggatggt5220

gtagatagct ctctttttct tcaattaaca tattcttgag aatgaatggt agcttctctt5280

tttttcttcc aattaacata ttcttaagag tgagtggtag ctttttttag ccttatctaa5340

aaaaatatga ttgatagggt acgaatttcc ctttaggtta ctctgccaaa acaaaagata5400

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<210> 21

<211> 6036

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 21

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aagctaggag catgcctaaa cgtacctgca actctcatgt gaaaaactca cctactaaca 120

taatcgatta gtcacgagtg cataatgaac acatatagct agtgtcgatc ggccgtatca 180

tcaaagtatg ttatctggac ctacaataat cgaccagctt atcgattgaa agacaaaaag 240

gttgtacgta tagtttgcta ggtagcattg gtacgttgta ctccttatat attgtcaaat 300

gacttgatat aaagtatgta gtagcacata ataaggcacg caacagttgc tactttccca 360

gcttgctgtc tgagtgatct ctgaactgtt cttttgttct caatgaacaa taaacataaa 420

agcgatgtta tatatcattt ggccctgaat gttagtgcag atattaacat atatatagat 480

actcgtgcat catggatgca tcaagataaa cctaaccgca aaaacatttg catgcatgta 540

tgcacacata tccttaaaaa atatccgtgc ttgcttaatt tgattattgt ttcattattt 600

gcatatataa gaagccaaat gaagatcagt tagctccttt tttacataaa tatggttgga 660

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tatgtagtaa atgtccacga tcagcttttc caaatactct taactactat aatttatctg1380

aatttacttc ttctaaaaca ctcctaaaaa agattggaag tacactagtc acgcataatc1440

aatagaaata tttttattat taattttact aatgcgattt ttatttgaaa aatcatatac1500

ttatttttca tatatttata tttaaagaat tatctataag aaaattatta ttattgaaat1560

cgagccagcc caactggtgt tatattaaga agagaaaata tgtatacaca aggtgctgtc1620

aactactccc tccattttat attgtagtcg ttttactctt tttttcttgt caaactttat1680

caaatttgac caattttata gaaaaaatta gcaacatata aaatatcaaa ttagtttcat1740

taaatcgaac attaaatata ttttaataat atgtttgttt tatgttgaaa atactactat1800

atttttctat aaatttaatc aaacttgaaa aagtttgact aagaaaaaag tcaaacgact1860

tataatatga aatggaggga gtaattacaa aataaaactg agaaacctac tacattcctc1920

aacaactcaa atgccagtta aggaagatat tctctaaaga tttcacacca cacaagctcc1980

aaagtttcat ttccgatcct ccatagaaaa aagaaactcc tagatatttc aattttcaaa2040

aaacatttca aaaatctata aactgcagag attattttag gtgctctgag aactaacacc2100

tagatattta attaggaacc tggctagcta ggggtatatg tcaagcagta ccggtactat2160

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ctctagctag ttactgtaag catatgctat agctagctat aggagcaaac atatactgtt2340

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atatacgtac atgaaaaagt ctttctacac gttataagag aatatcccgt gcttcttaca2520

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actaaacgtt aacgttagta aatatggttc actaggtatc tttttaatga tggtaaaatt2640

accattttaa aaaagatgtt tctctttttc gtttcgacaa gatagagcgg tgtatgttga2700

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acgtgtactt tttcactgaa gctaggagca tgcctaaacg tacctgcaac tctcatgtga3120

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acagttgcta ctttcccagc ttgctgtctg agtgatctct gaactgttct tttgttctca3420

atgaacaata aacataaaag cgatgttata tatcatttgg ccctgaatgt tagtgcagat3480

attaacatat atatagatac tcgtgcatca tggatgcatc aagataaacc taaccgcaaa3540

aacatttgca tgcatgtatg cacacatatc cttaaaaaat atccgtgctt gcttaatttg3600

attattgttt cattatttgc atatataaga agccaaatga agatcagtta gctccttttt3660

tacataaata tggttggacc agcagctcta aattctaatc caatactaga aagtgaagtt3720

ttattcgcaa ctgaaaacac cagtggcgaa aacaacagcc aaacaacatg ttaataatta3780

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tgtctccgat ctgcagcaga gctttgcctt tttaatttgt ccggagatgc atgcatcgat3900

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atttgaaaaa tcatatactt atttttcata tatttatatt taaagaatta tctataagaa4560

aattattatt attgaaatcg agccagccca actggtgtta tattaagaag agaaaatatg4620

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tgttgaaaat actactatat ttttctataa atttaatcaa acttgaaaaa gtttgactaa4860

gaaaaaagtc aaacgactta taatatgaaa tggagggagt aattacaaaa taaaactgag4920

aaacctacta cattcctcaa caactcaaat gccagttaag gaagatattc tctaaagatt4980

tcacaccaca caagctccaa agtttcattt ccgatcctcc atagaaaaaa gaaactccta5040

gatatttcaa ttttcaaaaa acatttcaaa aatctataaa ctgcagagat tattttaggt5100

gctctgagaa ctaacaccta gatatttaat taggaacctg gctagctagg ggtatatgtc5160

aagcagtacc ggtactatct tccgagtcag agagagaggg agcaattgga ccattcacaa5220

tttgagggca cagtacaagg cacaactgga tgggatgtag tactactgtg gcttcgccac5280

cggatcggat ggacaccact ctagctagtt actgtaagca tatgctatag ctagctatag5340

gagcaaacat atactgttcc catagcctcg agatgcatat gatattacga tgtgtagagt5400

acatgtacac atatggagag agagagagag agagagagat agaagagacc tgtcagatca5460

ctatgctgag ttatacatat atacgtacat gaaaaagtct ttctacacgt tataagagaa5520

tatcccgtgc ttcttacaca ccatctctat attttttcaa aaagagaaat tttaccgttc5580

ttgagaaaat atcaaggtac taaacgttaa cgttagtaaa tatggttcac taggtatctt5640

tttaatgatg gtaaaattac cattttaaaa aagatgtttc tctttttcgt ttcgacaaga5700

tagagcggtg tatgttgata tatccatcca tccaaccatg gatctcatct cgctatctat5760

cttagctttg cttgcaacat ttgcctcgaa agaaagaaat aaagaaaagg aaaaataaaa5820

acttttctgg tgctcgctct cccgatcact gtggttggtc tcgtgcgtac ggggtccatg5880

tgtgcgtggg accccctcgc cattattgca acaatagaaa ccctacccca tccttcctct5940

ctcccgctgt gcccaactct cccccccccc tctctttctc tctcctcctt cccgtcttct6000

tcctccggcc tcttctcctc ttattgccct tgattc 6036

<210> 22

<211> 1342

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 22

tataaatcga tgtgtgcaaa gtatatgtca tgtgttcaag tttcatacta tagttgacaa 60

ctgatataat taattatcat atgtaaaata cgcatgtttg caggttttca catatataaa 120

cacgcaatca gtagtcagtg cagatctatc tctatatatg tgaaatacaa ttatctgtaa 180

atttattttt cagataaagg agatatttta ctgaagatag caccatacca ctttgaaatg 240

aatgtttgcc ataagtaatt tggaggattc aatttcctaa ttaaggaaaa attttcctat 300

agagcccttt tattcatagg aaggatagga attttttcat aaaggattgc actgctatgg 360

ttcaatttta taggggaaaa ataagcaaga ggtcaaatct cttggaaact ttgctttcct 420

ttgttagttc ctacaatgct agcgaagagc tccttttcat ctttcctgcg ctttttttgt 480

acgattaaag aaacatgcaa ctacacaatt tctgcatttt tttccttttc ttgtgttttt 540

tctatcttgc gtttcatagg gccggggccg gttgctcaaa tactctcagc ttgccttaca 600

tatgtgcatc attcaggctg accttggtgt ggttagcaag gtgtaatagt ggttgtttgg 660

ttgcatgtat tagtttaacc tggttttata tgaggtgttg tttcattggt tggatcgata 720

tgtgaaaact tgtatgcatg gtattcgttt ggttggataa atgaaccttg agtatactca 780

tctttctatg tggatggtaa gattatccct actacccata aatagaaata ttaccaagtg 840

caagatactc taaattatta taaaatacac acatttcaga tataaatgca gctaagtcaa 900

atctacacat gaaatcagca gatttgaatt agagtgtggt tctagaaata tcagtcatcc 960

taaaataggt atatccctca aaccaagaga caactagtcg agattccttc acagttgtac1020

agggctattt gaaatatgac tgtacttgat atgcaacttt ttctctattt ctacaaatac1080

atttgtattt tccatacatt tgtagctaca atctggtccc accatgatgg atggtgtaga1140

tagctctctt tttcttcaat taacatattc ttgagaatga atggtagctt ctcttttttt1200

cttccaatta acatattctt aagagtgagt ggtagctttt tttagcctta tctaaaaaaa1260

tatgattgat agggtacgaa tttcccttta ggttactctg ccaaaacaaa agataattgc1320

aacaaatata tatggctgga tt 1342

<210> 23

<211> 5693

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa Indica）

<400> 23

aaagatgtct aaatagctat aaatgggtaa gcaagatagc aaagaaggcc agtggccttt 60

gcagctaagc tagctagcta gcccttcttc ctctctttcc tgctttccct ttgccttctc 120

ctattaatcc tctgcacctc acacagcagc agaaaaccca ccaactggag ctctcctttc 180

ctactccaag aaacgaaggt agagaaagaa agatcagatc agcttcagga ccaattttag 240

ctaggttata tatctctttg cgtgctaatg tgttttagtt atctgggtgt gtgtagagtt 300

ctttgttaag gcactgattc agctgcagtt tagattcaag tttgtatgtt ctctctttga 360

ggaaaagaaa cccttttcct gtgcttcgag ttcttgcaaa gagaaactgt gatgcttggc 420

ttccagtttg atgcttcttt gttcagattg gaaattcttc ctagcttctt tctctattta 480

tgtagcaagg attctttccg gcccagtgat cctggtttct tttggaaggt ttcagttttt 540

tcgttctttc ttgaaatttc tcttcttgcc ttaggcagat ctttgatctt gtgaggagac 600

aggagaaaag gaagaagcta gtttcctgcg gccgacctct tgcttctcac tttgtgatga 660

gttttctttg gtcaattctt agctagatat gttaagatag ttagttaagc aaatcgaaat 720

tgctagcttt tccatgcttt cttaaacatg attcttcaga tttggttggt tctttttttt 780

cctttttgtg gagacgtgct gttcttgcat cttatccttc ttgattcatc tacccatctg 840

gttctttgag ctttcttttt cgcttcttcc cttcattatt tcgagcaatc tctgcacatc 900

tgaaagtttt gtttcttgag actacttttg ctagatcttg tttactcgat cactctatac 960

ttgcatctag gctcctttct aaataggcga tgattgagct ttgcttatgt caaatgatgg1020

gatagatatt gtcccagtct ccaaatttga tccatatccg ccaagtcttt catcatcttt1080

ttctttcttt tttatgagca aaaatcatct ttttctttca aagttcagct tttttctctt1140

gttttacccc tctttagcta tagctggttt cttattcctt ttggatttac atgtataaaa1200

catgcttgaa tttgttagat cgatcacttt atacacatac tatgtgaatc acgatctcag1260

atctctcagt atagttgaat tcattaattt cttagatcga tcagcgtgtg atgtagtact1320

gtaaatcact actagatctt tcatcagtct cttttctgca tctatcaatt tctcatgcaa1380

gttttagttg tttctttaat ccggtctctc tctctttttt aatcagctga gagtttgtgc1440

tgttctttaa tcattaccag atctttcatc agtactctct cttctgcatc tatcaaactt1500

ctcatgcaat gtttttgctg ttctttgatc tgatctctgg tctccttttt tgttgatcag1560

ttgagagcaa gaagacatgg ggaggggcag gattgagatc aagaggatcg agaacacgac1620

aagccgccag gtgaccttct gcaagcgccg caacggactt ctcaagaagg cgtatgagct1680

ctccgtcctc tgcgatgccg aggtggctct catcgtcttc tccagccgtg gccgcctcta1740

cgagtactcc aacaacaaca agtatgtact tgctgtaaat atattggctt aattttgtac1800

tcagttcttg aaactaactt gctgattgct ttgtttccct tcgtgtcatt tcatgctcag1860

cgtgcttgtt gtgttgcttt atttgtggct aatagtttgt tattgagtaa aagtttagtt1920

gtggttaaaa ctgactcttg gtaaatattt tagaatgagt ttaatattat acacattctt1980

agatgatatg tgaattactt aactcaaggt gtgaaatgat ttaggaaaaa tgttagagtt2040

tatcataaaa actcatcaag atgtatatgt ttgctcatca gctagctgta agattaatgc2100

tgaaaatgtt gtcctgttta gttacttgaa aaaggactat tctgttctaa ttttcttagt2160

cttatggtca gaaggcttta ctaaagtcca tttatatatc ctgcttgcta aattgatttt2220

gctggaaaga attaaccatg tatgcatgga ctttaatttc atctgtgcat gtaacaagac2280

ttgcttactt ttttcagtta tcatctactc agattacgaa ataaaattgt aagatttatt2340

tcaaactata tgcatggtac tatatatggt gatttgtcat gcatgcatga ttatattgtt2400

tttgtatcta aataaagtta ctctcttaac ctccatggaa aattccttag ctattgctca2460

tcattttcaa agtgagatgt gtgaattaga tatgtacaca catattaagg ggaggctatt2520

tgaaagatac attagaatcc ccttccaatt cattcatgca tgcagtcaaa taattattta2580

aagtttgcaa agtctcattg tttttataca tgtcaaattc atttgcaatc tctctcgagt2640

acatgtacat gagtatgcat gcatgcaaac tttaaataat atatatcagt gctatcagta2700

cttgagcagc tagcaaagcc actgccatct tttatcatat tttattctcc acagttcaca2760

caacacacat catatcatgc acagcaagga agctcagtct cctgtcaatg ttgtatgttc2820

agtagatagt tcaccctaga aactagctgt caagagtttc cttttccttg cttctccata2880

caccgataca catatagaca ccatggacat gcatgagaag aacttgcacc aagctagaaa2940

ctgcagcaac gtcctcccat attcgctgtg tttgctcttc tccggtgcaa agttgtgcat3000

cagttaataa gccaatggcc atccatctga ccatctctct ttctctctag ctcgtgtata3060

ctcatttcat tccgttcttg tgttcacttc aacacagttc ttgcagctag agacagcatg3120

cattccaatg gctacctttc ttctgcacaa ttttatgctg aagtaattaa acgcttgctc3180

ctcacatgca ttatttctgc attcatgaca tgtatagtca tgtgtgttgc atttcttctc3240

ttgttggcat atatgaacac actacattac catgcatgca caattatcag tatttatgtt3300

gtagtgttga gagagtacca ctcgactgat gggatatata ctgcagtgtg aaggctacaa3360

ttgacaggta caagaaggcg catgcttgtg gctcaacttc tggtgcacct ctcatagagg3420

tcaatgctca ggtaacccat atatatgttg ctgctttgtt aattaccttc ttctattcat3480

tttgccttag tttcagttaa attaatttgg tgactattct aaaaccaagg catattcata3540

catataaagt gagagcatat agatgccttg cattttaagt attttatata ctttttgtgg3600

taggtaattg actgctgcat tatattaatt tgttagtttc atcagggtat ggcttgatct3660

ttgtgcttat atacattcat gtgttatagc tatacagcat caatctttac gacaagattg3720

aattcataat taatgtagta tgtgaaccac ttggagattg cctaatgcct agtctgcaat3780

tctgcactga agttctccat atatttgtct ttctctgagt ttaagagtat acttttctta3840

gaaactgtaa gtgtaccctt ttgtggctag tggcttgcaa tttaaagtta gtgactgaag3900

agaacaaaca aaattcacaa aataaacttc aatgtaaaag catgaatgca gtcattctgt3960

tgcactacaa ttaaggttac tgttactttt tttttttgct gatcaattag agctacatga4020

taaacgtaat taaatctgat cgatcgtctt gttaattgtc ttgtctgaag caatactacc4080

agcaggagtc tgccaaactg cgccaccaga ttcagatgct gcaaaacacc aacaaataag4140

tgcctaatac taatacacaa tttttatatc tgccattcaa gaaacacatg tgtatatatc4200

gatgataata ttgaaaagag attactttac agaatcaatg tgatgacctg gaaataccta4260

ttttcgtttg gtttgttttc ctatgtgaaa ggcacctggt tggcgataat gtgagcaacc4320

tgtcactgaa ggagctgaag caacttgaaa gccgcctgga gaaaggcatt tcaaagatca4380

gagccaggaa ggtaaacaac tatatataaa ataccatttt cacatgaaca ttcaattacc4440

aacctcatgg tgtcaccttt agaacaaaat ctcagtgctg ttagatatat atgatcacct4500

tgatttactt tgtttgaaca attcttcagt ttctgatgca atgttaactt actaagtggc4560

cttaaaaatg tacaaattaa ctgttaatcc ttatttgttt aattttatct cagaatgaac4620

tgctggcttc agagatcaat tacatggcca aaagggtatg tgtgttacta gaattgcatc4680

ttacatacaa ttgtacatac tgatcaatga ttgcaaactc ctttcttaat cctctattct4740

ttttacctga ttgcataatt cttgttagca ttactcattt gcaatgttct tgtcatgatt4800

tcaggagatt gagcttcaga acgacaacat ggacctcaga accaaggtaa atacatatca4860

ggtgactgca agaaatcaga accaacttcc aatttcttgt ttgcaaatca gagattaatt4920

agctagctat ttgtttaaat taatttgaac aaatagctag ctaattaatc tataaagctt4980

gacgaaaaga acaatatatc tctacatcaa cgacacatct atctctacta tacgttgatg5040

agagatcatg tgcacacttg cagattgctg aggaggagca gcagctgcag caggtgacgg5100

tggcccggtc ggccgccatg gagctgcagg ctgcggcggc ggcgcagcag cagcagcaga5160

atccgttcgc ggtggcggcg gcgcagctgg acatgaagtg cttcttcccg ttgaacctgt5220

tcgaggcggc ggcgcaggtg caggccgtgg cggcgcagcg ccagcagatc atccccaccg5280

agctcaacct cggctaccac caccaccttg ccattcccgg cgccgccgcc gccgacgcgc5340

cgcctcctca cttctgaacc tcatgaactt cattctgcac cggcctgctg ccatggatat5400

gatgatcagc tcatcttcta tatcttatgc tgttatgcag acagacacta ctgatgtggc5460

tatatatata gtatttgtgt gctgctgcat tttgttaatc ccttataaat tgctacttaa5520

ttatctcatg gagaattgga gagaccaaat gggcagagct agctagttag ctgtgcccaa5580

ttaagaagct aaatctatca gaagtgtgta ctgatgagtg atgagtattt ttcttcattt5640

gggatcaaat taaactaagt aaaacatata tatttgactt atgttttacg tgc 5693

Claims (7)

1.一种繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法，所述方法包括：

（a）提供第一植株，所述第一植株的调控雌性器官发育的基因发生纯合隐性突变，所述植株表现为雌性不育；

（b）向第一植株中引入外源构建体，形成第二植株，所述外源构建体包含：

i）第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的雌性生育力，所述的第一核苷酸序列为OsFMS2或OsFMS1；

ii）第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；

iii) 第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体；以及

（c）第二植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性核雌性不育的第一植株，另一半为含有外源构建体的第二植株。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物雌性器官中表达。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素、rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、PA的核苷酸序列构成的组。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白基因构成的组。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2启动子。