CN104837334B - 植物新型保持系及不育系建立及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物保持系和不育系及其用途，将育性恢复基因、花粉致死基因、抗除草剂基因同时转入到纯合隐性核雄性不育植株中，该转基因植株自交后产生两类种子：不携带转基因的不育系种子，没有除草剂抗性，可通过除草剂筛除；携带转基因的可育种子，即保持系，具有除草剂抗性，可与不育系授粉杂交用于不育系的繁殖。本发明创制的不育系育性稳定，不受环境影响，且该植物隐性核不育基因适用于绝大多数植物品种。

Description

植物新型保持系及不育系建立及其用途

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和育种领域。具体地，本发明的实施方案涉及含有制种技术的转基因植物。更具体地，本发明涉及纯合隐性核雄性不育植株的育性恢复及其用途。进一步本发明涉及构建植物保持系及繁殖雄性不育系的方法，更具体地，本发明涉及一种构建体，一种植物细胞、组织或器官，一种繁殖植物雄性不育系的方法，一种恢复植物不育植株雄性育性的方法，一种制备植物种子的方法，一种用于制备杂交植物的方法，以及植物雄性不育系在制备杂交水稻中的用途。

背景技术

杂交育种是选育新品种主要途径，是近代育种最重要的方法，杂交种的创制、利用和产业化是国际农业跨国集团种业市场竞争的焦点。由于杂交引起基因重组，后代会出现组合双亲控制的优良性状基因型，产生加性效应，并利用某些基因互作，形成具超亲类型新个体。作物杂交育种具有巨大的发展潜力，已经成为提高粮食产量的主要途径。近几十年来，杂种优势作为一种提高作物产量、改良作物品质、提高作物抗虫、抗病、抗逆的手段已被广泛利用。利用杂种优势育种已成为许多作物的主要育种方法。而有效控制作物自花授粉、受精是获得高纯度杂交F1种子、从而利用作物杂种优势的关键。而杂交育种中必须要解决的关键问题是(1)获得可用的不育系：一般为雄性不育(由细胞质不育或隐性核不育基因控制)；(2)杂交配组：不育系可与相应的父本植物组合生产具有优良性状的杂交后代；(3)不育系的繁殖：不育系能在一定条件下恢复育性使其得到保持。因此，作物雄性不育系的选育是杂种优势利用的关键环节。

上世纪七、八十年代，以袁隆平为代表的中国科学家们利用水稻野败型细胞质不育基因资源创制了“三系”杂交水稻，使水稻产量提高了近20％，被称为第二次“绿色革命”，为保障我国粮食供应起到了非常重要的作用，使我国的水稻育种与生产技术处于世界领先水平，也向世人展示了杂种优势的强大作用。水稻杂交育种中常用的是“三系”和“两系”杂交。“三系”杂交需要有特定的恢复系和保持系，育种程序和生产环节复杂，选育新不育系及新组合的周期长、效率低，种质资源的利用率低于5％。另外，三系杂交粳稻优势不强，不育细胞质较单一，存在某种毁灭性病虫害暴发的潜在危险。“两系”杂交水稻由于不受恢复系、保持系之间关系的制约，亲本的遗传多样性得到明显改善，选育出高产杂交稻组合的速度明显加快，促进了超级杂交稻的研究和生产。但目前“两系”杂交中采用的不育系多为“光温敏”不育系，其育性受环境中的温度和光照影响。这些环境因素的不稳定会直接影响杂交种子的纯度和数量，加大制种风险，严重时会使企业和农民造成重大经济损失，限制“两系”杂交稻的大面积推广。而且利用目前技术所能选用的两系杂交稻不育系十分有限，例如粳稻品种中几乎没有很好的两系杂交组合，限制了品种资源的充分利用。因而，培育不受环境影响且可自主繁殖的稳定不育系已成为限制“两系”杂交技术广泛应用的技术瓶颈。

玉米是利用杂种优势最早，且杂交种在世界上普及推广最成功的作物。玉米是雌雄异花作物，繁殖系数高的作物，杂交种生产时，在隔离区内父、母本按比例种植，母本雄穗刚露出时拔掉，父本花粉自由授粉杂交。玉米杂交优势的利用及生产上应用杂交种，使得玉米生产水平产生了巨大变化。但是，玉米杂交种生产中存在着常用育种的亲本遗传基础差异不够大，并因此影响到主要育种目标如高产、稳产、抗逆、早熟等的尽快实现。同时，在杂交种生产过程中，存在着母本去雄工作繁重且不彻底、进而影响杂交种产量和质量不稳定的问题，急待解决。

杂种优势在双子叶植物如烟草和油菜的生产中也得到应用。油菜是世界的第三大油料作物，而中国油菜总产和面积占世界三分之一，是最大的油菜生产国，中国的油菜杂种优势利用处于世界领先水平。油菜中常用的杂交育种也是基于细胞质不育和细胞核不育两大类，存在“三系”和“两系”杂交育种，到目前为止，生产上应用最多的油菜细胞质雄性不育系主要有三个：波里马细胞质不育系，陕2A CMS和萝卜细胞质不育系OguCMS。尽管细胞质雄性不育系已得到广泛应用，但在技术上依旧受到恢复源限制、育性稳定性、胞质单一化等方面的影响。因此，与水稻中一样，油菜杂交种开发中存在同样的种质资源利用率低、杂交种纯度较低的问题。

因而，目前的植物杂交育种技术仍有待改进。

发明内容

本发明旨在解决上述植物杂交育种技术瓶颈问题。为此，本发明的一个目的在于提供一种具有能够有效构建新型稳定的植物保持系和雄性不育系的方法，从而扩展植物种质资源在杂交育种中的应用，消除杂交制种过程中的风险，提高杂交种子纯度。

围绕如何提高不育系的稳定性及打破杂交品种资源利用的局限性，并进一步解决现有制种技术复杂且成本高等技术瓶颈问题，我们建立了一种新的杂交育种技术。该技术利用隐性核基因控制的雄性不育系和转基因技术，将育性恢复基因、花粉致死基因、抗除草剂基因连锁，同时转入到纯合隐性核雄性不育植株(不育系)中，育性恢复基因的功能使转基因植株恢复育性；但到花粉发育后期，花粉致死基因使含有转基因的花粉失活，只有不携带转基因的花粉保留活性。该转基因植株自交后产生两类种子：不携带转基因的不育系种子，没有除草剂抗性，可通过除草剂筛除；携带转基因的可育种子，具有除草剂抗性，可以通过除草剂筛选存活下来，即保持系，可与不育系授粉杂交用于不育系的繁殖。

本发明所提供的繁殖不育系的方法，所述方法包括：(a)提供第一植株，所述第一植株为不育系，所述不育系含有一个纯合隐性的等位不育基因；(b)向第二植株中引入下述构建体，所述第二植株含有一个纯合隐性的等位不育基因，所述构建体包含：(i)第一核苷酸序列，当其在所述第一或第二植株中表达时，能功能性互补所述植株的纯合隐性植物不育性状；(ii)第二核苷酸序列，其表达抑制所述第二植株中雄性配子的形成或功能，从而使得在含有所述隐性等位基因的所述第二植株中产生的雄配子不含所述构建体；(iii)第三核苷酸序列，该序列编码产物的表达能用于选择具有所述构建体的植物细胞；以及(c)用所述第二植株的所述雄性配子使所述第一植株受精，以繁殖保持了所述第一植株纯合隐性等位状态的后代；进一步的，上述的第三核苷酸序列选自抗草甘膦、抗草丁膦、抗百草枯、抗草铵膦、抗莠去津、抗溴苯腈、抗2，4-D、抗咪唑啉酮或抗磺酰脲类等除草剂的基因构成的组。

具体地，上述第一核苷酸序列为育性恢复基因，选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA或AID1构成的组。其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达，或者所述的第四核苷酸序列仅在存在诱导物质或诱导条件时才具有功能。更具体的，所述的第四核苷酸序列选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA、AID1、5126、Ms26、Ms22或Ms45的雄性组织调控序列构成的组。

具体地，上述第二核苷酸序列选自DAM甲基化酶基因、Zea maysα淀粉酶基因、细胞毒素编码基因、或Barnase与Barstar的组合序列构成的组。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作地相连，所述第五核苷酸序列指导偏好于雄性配子的表达。更具体地，所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。

具体地，上述第三核苷酸序列具体为具有除草剂抗性的ALS基因突变体。其中所述的ALS基因突变体在水稻中的突变为Trp548、Ala96和/或Ser627突变，优选带有Trp548Cys、Trp548Met、Ala96Val、Ala96Thr和/或Ser627Asn突变；其中所述的ALS基因突变体在油菜中的突变为Ala107、Ala190、Trp559和/或Ser638突变。具体地，其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作地连接，所述第六核苷酸序列为组成型表达启动子。更具体地，其中所述的第六核苷酸序列为35s启动子。

本发明还提供了一种方法，用于从具有雌性配子和雄性配子的植株产生种子,所述方法包括：(a)向第一植株中引入下述构建体，所述第一植株含有一个纯合隐性的等位不育基因，所述构建体包含：(i)第一核苷酸序列，当其在所述第一植株中表达时，能功能性互补所述植株的纯合隐性植物不育性状；(ii)第二核苷酸序列，其表达抑制所述第一植株中雄性配子的形成或功能，从而使得在含有所述隐性等位基因的所述第一植株中产生的雄配子不含所述构建体；(iii)第三核苷酸序列，该序列编码产物的表达能用于选择具有所述构建体的植物细胞；(b)使所述植株自体受精；以及(c)产生含有所述构建体的种子；其特征在于所述的第三核苷酸序列选自抗草甘膦、抗草丁膦、抗百草枯、抗草铵膦、抗莠去津、抗溴苯腈、抗2，4-D、抗咪唑啉酮或抗磺酰脲类等除草剂的基因构成的组。

具体地，本发明是基于下列发现而完成的：

发明人以油菜核隐性不育brms2和brms1突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3组功能基因转化至上述不育系：育性恢复基因使雄性不育油菜植株恢复育性，花粉失活基因(BrSZ1/Pr2组合)使含有转基因的花粉失活，即失去授精能力；除草剂抗性基因用于转基因种子即保持系和非转基因种子即不育系的分拣，其中非转基因种子被除草剂筛除，转基因种子则用作保持系，与不育系授粉杂交，来源源不断地繁殖不育系。

本发明提供了一种构建体。该构建体包括：第一表达盒，含有油菜雄性不育恢复基因；第二表达盒，含有花粉致死基因；第三表达盒，含有除草剂抗性基因。利用该构建体，能够有效地将油菜育性恢复基因和花粉致死基因引入到油菜不育系植株中，从而杀死带转基因成分的花粉并恢复油菜的育性。

本发明的第二方面，通过常规技术，例如农杆菌介导的蘸花法，将前述构建体引入到油菜中，得到转基因植株。

本发明的第三方面提供了一种繁殖油菜雄性不育系的方法。将前面所述的构建体转入到油菜纯合隐性雄性不育植株中，获得转基因油菜植株，转基因油菜植株能够产生可育的不含有转基因的雄性配子，通过自交，得到携带外源基因的种子和不携带外源基因的种子。其中不携带外源基因的种子不抗除草剂，可以被除草剂筛除，携带外源基因的种子抗除草剂可以存活，作为保持系，与雄性不育系授粉杂交，进行不育系的繁殖。

本发明的第四方面提供了一种恢复油菜不育植株育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到油菜纯合隐性雄性不育植株中。

本发明的第五方面提供了一种制备油菜种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的构建体引入到油菜植株中；将所述油菜植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。

本发明的第六方面提供了一种转基因植株，即转基因油菜植株。根据本发明的实施例，所述转基因植株是通过将前面所述的构建体引入到油菜纯合隐性雄性不育植株中获得的。

本发明的第七方面，发明人以水稻核隐性不育osfg2突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个功能基因转化至上述不育系：育性恢复基因OsFG2使雄性不育水稻植株恢复育性，花粉致死基因(Zm-AA1)使含有转基因的花粉失活，即失去授精能力；除草剂抗性基因用于转基因种子即保持系和非转基因种子即不育系的分拣，其中非转基因种子被除草剂筛除，转基因种子则用作保持系，与不育系授粉杂交，来源源不断地生产不育系。

本发明的第八方面，通过常规技术，例如农杆菌介导的幼胚或成熟胚转化，将前述构建体引入到水稻中，得到转基因植株。

本发明的第九方面，提供了一种繁殖水稻雄性不育系的方法。将前面所述的构建体转入到水稻纯合隐性雄性不育植株中，获得转基因水稻植株，转基因水稻植株能够产生可育的不含有转基因的雄性配子，通过自交，得到携带外源基因的种子和不携带外源基因的种子。其中不携带外源基因的种子不抗除草剂，可以被除草剂筛除，携带外源基因的种子抗除草剂可以存活，并作为保持系，与雄性不育系授粉杂交，进行不育系的繁殖。

本发明的第十方面，提供了一种恢复水稻不育植株育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中。

本发明的第十一方面，提供了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的构建体引入到水稻植株中；将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。

本发明的第十二方面提供了一种转基因植株，即转基因水稻植株。根据本发明的实施例，所述转基因植株是通过将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雄性不育植株中获得的。

这种新型的杂交育种技术具有显著的优越性：(1)该技术创制的不育系育性稳定，不受环境影响，解除了环境因素对杂交育种的制约，消除了生产上的潜在风险；(2)所利用的植物隐性核不育基因适用于该种植物的绝大多数品种，使杂种优势的资源利用大幅提高；(3)终止携带转基因的花粉的受精过程，防止外源基因漂移到其它植物中；(4)所产生的不育系不含转基因，消除人们对转基因作物的顾虑；(5)利用除草剂基因方便地将不育种子和可育种子分开，方便获得保持系，进一步与不育系授粉杂交繁殖不育系种子，保证了不育种子的纯度。

该技术涉及三个连锁的功能元件：花粉致死基因，抗除草剂基因，育性恢复基因。其中所选用的花粉致死基因在花粉中表达的时间、水平及致死效率都直接关系到该技术能否成功应用，因此本发明利用花粉特异性启动子驱动花粉失活基因在花粉成熟期特异表达，实现了特异性花粉致死的效果；利用植物内源启动子控制的雄性不育恢复核基因转化对应的植物雄性不育植株，使转基因植株恢复育性；利用抗除草剂基因可以方便地将转基因植株自交后产生的两类种子分开：不携带转基因的不育种子，没有除草剂抗性，可通过除草剂筛除，携带转基因的可育种子，具有除草剂抗性，可以作为保持系存活下来，由此可以通过自交方便地、源源不断地得到保持系；保持系进一步与不育系授粉杂交，使不育系恢复结实，得到不含有转基因的不育系，使不育系得到繁殖；由此得到的不育系既可以与任意父本杂交，用于杂交种子的生产。利用本发明构建的新型育性调控载体转化植物雄性不育植株，得到的转基因植物植株恢复育性，其花粉育性和种子的除草剂抗性均表现预期的结果。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明一个实施例的植物表达载体pBnSI的结构示意图，其中P1为来自拟南芥基因组的花粉特意表达启动子P1，BrSZ1为细菌来源的barnase基因编码区，T1为来自于拟南芥Rbcs基因的终止子，P2为来自于烟草花叶病毒的组成型启动子35S启动子，Pr2为人工合成的来自于细菌的barstar基因，T2为35S终止子，BrMS2为油菜育性恢复基因表达框BrMS2，T3表示人工合成的rbcs 3A终止子，P4为NOS启动子，Pr4为抗除草剂基因，T4为Nos终止子。

图2为根据本发明一个实施例的油菜保持系可育花粉粒和败育花粉粒(不可育)的Alexander染色结果,其中A表示转基因植株花粉的染色结果；B为野生型植株花粉的染色结果。

图3为油菜保持系结实的种子的抗除草剂筛选。

图4为根据本发明一个实施例的植物表达载体pOsSI的结构示意图，PG47为来自玉米基因组的花粉特异表达启动子；TP-Zm-AA1表示融合了brittle-1导肽序列的玉米来源的Zm-AA1基因编码区；In2-1为来自于玉米基因组的终止子；P5为来自于水稻基因组的启动子；OsFG2表示水稻育性恢复基因表达框；T5表示来源于水稻基因组的终止子；Ubi为来自玉米基因组的组成型表达启动子；Pr5为抗除草剂基因；T3为人工合成的终止子。

图5为根据本发明一个实施例的水稻可育花粉粒和败育花粉粒的I2-KI染色结果。

图6为水稻保持系结实的种子的抗除草剂筛选

图7为创制保持系、繁殖不育系和生产杂交种的技术路线。

发明详细描述：

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人分别以油菜、水稻核隐性不育突变体为转化受体材料，通过分别将紧密连锁的3组目标基因转化至不育突变体中，其中，育性恢复基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，除草剂抗性基因可以用于转基因种子和非转基因种子的筛选分拣，非转基因种子由于不含有抗除草剂基因而被除草剂筛除；转基因种子抗除草剂可以通过除草剂筛选存活下来，用作保持系与不育系杂交授粉来源源不断地、稳定地繁殖不育系。例如，根据本发明的一个实施例，可以以油菜核隐性不育brms2/brms2和brms1/brms1突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3组目标基因转化至不育系：育性恢复基因BrMS2可使转化受体育性恢复，花粉失活基因BrSZ1/Pr2组合可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，抗除草剂基因Pr4用于转基因种子和非转基因种子的筛选，非转基因种子由于不含有抗除草剂基因而被除草剂筛除，转基因种子含有抗除草剂基因可以通过除草剂筛选存活下来，用作保持系与不育系授粉杂交来源源不断地、稳定地繁殖不育系。再例如，根据本发明的另一个实施例，可以以水稻核隐性不育osfg2/osfg2突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至不育系：育性恢复基因OsFG2可使转化受体育性恢复，花粉失活基因Zm-AA1可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，抗除草剂基因Pr5用于转基因种子和非转基因种子的筛选，非转基因种子由于不含有抗除草剂基因而被除草剂筛除，转基因种子含有抗除草剂基因可以通过除草剂筛选存活下来，用作保持系与不育系授粉杂交来源源不断地、稳定地繁殖不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了植物杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。

由此，在本发明的一个实施例，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括：第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子编码油菜或水稻雄性不育恢复基因；第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活基因；第三表达盒，所述第三表达盒含有第三核酸分子，所述第三核酸分子编码除草剂抗性基因。利用该构建体，能够有效地将油菜、水稻雄性不育恢复基因和花粉失活基因分别引入到油菜、水稻植株例如纯合隐性雄性不育植株中，通过除草剂筛选，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过与不育系授粉杂交以繁殖不育系，并通过自交源源不断地生产保持系。另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交制种之中的亲本。由此，可以有效地用于油菜、水稻杂交育种。

在本文中，构建体的形式不受特别限制，根据本发明的具体示例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体(有时也称为表达载体、遗传载体或载体)呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。根据本发明的实施例，可以采用Ti载体，例如可以采用将第一、第二和第三表达盒设置在表达载体pOsSI或pBnSI的T-DNA之左右边界之间。由此，可以通过农杆菌介导的转化方法将第一、第二和第三表达盒转化至受体植株，例如油菜brms2和brms1隐性核雄性不育突变体或水稻osfg2隐性核雄性不育突变体中。由此，可以获得油菜或水稻转化株系。如此获得的转化株系有如下特点：(1)转化位点在各世代始终处于杂合状态，因此有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)，所以外源基因仅通过雌配子传递至下一代，不会通过花粉漂移到环境中；(2)转化体自交可结实，所结可育种子(含有抗除草剂基因)与不育种子(不含有抗除草剂基因)的比例为1：1，通过除草剂筛选，可以将两类种子区分开来，其中可育株(带有外源基因)抗除草剂筛选存活下来用作保持系，可以通过与不育系杂交授粉方便地、源源不断地繁殖不育系，另一方面，可育株也可以通过自交方便地、源源不断地生产保持系，而通过保持系与不育系杂交授粉繁殖的不育株(不含转基因成分)在生产上用作杂交制种的亲本；(3)因为不育系不含转基因，因此用其生产的杂交种子不含转基因，用此杂交种生产的商品粮食更不含转基因，从而消除了转基因生物安全的隐患。该新型杂交育种体系为充分利用植物杂种优势提供了切实可行的技术新突破。

在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的载体，优选核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

油菜为四倍体，含有AA基因组和CC基因组，油菜细胞核隐性核不育通常由两对基因控制，如隐性核不育材料S45AB的育性受两个隐性基因(BnMS1和BnMS2)调控，当两个基因都为隐性纯合时表现为不育。隐性核不育材料9012AB的不育性状受双基因(BnMs3,BnMs4)控制。根据本发明的实施例，油菜雄性不育恢复基因的类型并不受特别限制。在本发明的一个实施例中，所述油菜雄性不育恢复基因编码具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质，可以采用的油菜雄性不育恢复基因为BrMS2，可以将其作为油菜受体brms2和brms1纯合突变体(完全雄性不育)的野生型育性恢复基因。据本发明的具体实施例，在本发明的一个实施例中，所述油菜雄性不育恢复基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，与油菜内源的雄性不育基因BnMS2(其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)相比，本发明载体中的雄性不育恢复基因有8个单碱基突变，其中6个是同义突变，2个是错义突变，导致两处(第179位和第297位)编码的氨基酸发生改变。该序列能够有效地使油菜brms2/brms2和brms1/brms1不育受体植株的育性得到恢复。在本发明的一个实施例中，所述油菜转化载体的第一表达盒还可以进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。根据本发明的实施例，第一启动子和第一终止子的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，对于BrMS2基因，可以采用BrMS2的内源启动子、ORF区及终止区的序列，均为野生油菜基因组序列。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第一终止子具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该启动子和终止子的组合，能够进一步显著地提高表达相应蛋白的效率，进而能够提高利用构建体构建保持系的效率,并且能够更有效地使油菜brms2和brms1不育受体植株的育性得到恢复。

根据本发明的实施例，油菜花粉失活基因的类型并不受特别限制。已知的花粉失活基因可以编码碳水化合物降解或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，茁长素(auxin)、rolB、细胞毒素、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统。举例而言，Mariani,et al.,Nature Vol.347；pp.737；(1990)表明，Aspergillus oryzae RNase-T1或Bacillus amyloliquefaciens的RNase(被命名为“barnase”)在绒毡层中的表达诱导了绒毡层细胞的破裂，导致雄性不能生育。Quaas,et al.,Eur.J.Biochem.Vol.173:pp.617(1988)描述了RNase-T1的化学合成，而barnase基因的核苷酸序列由Hartley,J.Molec.Biol.；Vol.202:pp.913(1988)公开。Agrobacterium rhizogenes的rolB基因编码通过从吲哚酚-β-甙释放游离吲哚从而干扰茁长素代谢的酶。Estruch,et al.,EMBOJ.Vol.11:pp.3125(1991)和Spena,et al.,Theor.Appl.Genet.；Vol.84:pp.520(1992)表明，烟草中rolB基因的花粉囊-特异性表达产生了花粉囊枯萎的植株，其中，花粉的产生大大减少，rolB基因是可用于控制花粉产生的基因的例子。Slightom,et al.,J.Biol.Chem.Vol.261:pp.108(1985)公开了rolB基因的核苷酸序列。编码白喉毒素基因的DNA分子可从American Type Culture Collection(Rockville,MD),ATCC No.39359或ATCCNo.67011获得，关于例子和使用方法，见Fabijanski,et al.,E.P.Appl.No.90902754.2,“Molecular Methods of Hybrid Seed Production”。DAM甲基化酶基因用于在美国专利No.5,689,049和PCT/US95/15229Cigan,A.M.and Albertsen,M.C.,“Reversible NuclearGenetic System for Male Sterility in Transgenic Plants.”讨论的方法中导致不育。还见Albertsen et al的美国专利No.5,962,769“Induction of Male Sterility inPlants by Expression of High Levels of Avidin”对亲和素基因导致不育的讨论。

根据本发明的实施例，所述花粉失活基因BrSZ1编码具有如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的蛋白质，由此，可以编码Barnase蛋白。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因BrSZ1具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高表达相应蛋白的效率。根据本发明的实施例，第二表达盒进一步包括：第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为花粉特异性启动子；以及第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。由此，可以更有效的提高相应基因的表达效率。另外，根据本发明的实施例，在第二表达盒以外，构建体中还可以进一步包括编码Pr2蛋白的表达盒，所述Pr2编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的蛋白质，由此，可以编码Barstar蛋白,该表达盒的启动子为P2和终止子为T2序列分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示，构成P2::Pr2::T2表达盒。由此，第二表达盒可以有效地编码花粉失活蛋白，可以通过花粉特异性启动子使得目的基因(花粉失活基因)能够被靶向定位到特定的细胞中，而Pr2表达框编码的Pr2蛋白，则可以在花粉以外的组织器官抑制BrSZ1的泄露表达，最终可以使含有转基因的花粉失活，但是又不造成植物其它组织器官的非预期表型。该设计使得所有含有此基因的转基因花粉失活，不能授精，还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因不能通过花粉漂移到环境中。

另外，根据本发明的实施例，油菜转化的构建体还可以进一步包括：第三表达盒，所述第三表达盒包含第三核酸分子，所述第三核酸分子编码抗除草剂基因，所述抗除草剂基因的类型并不受特别限制。由此，便于通过抗除草剂基因的表达来确定植物是否含有构建体所引入的基因。根据本发明的实施例，可以采用选自抗草甘膦、抗草丁膦、抗百草枯、抗咪唑啉酮基因的至少一种作为筛选基因。在本发明的一个实施例中，可以采用Pr4蛋白作为抗除草剂基因，跟野生型油菜植株的基因相比，该突变基因319位点核苷酸G变为A，导致所编码的氨基酸位点由Ala变为Thr，含有该突变基因的油菜具有除草剂抗性，过表达该突变基因可以使转基因植物具有咪唑啉酮类除草剂抗性。在本发明的一个实施例中，所述第三表达盒进一步包括：第三启动子，所述第三启动子与所述第三核酸分子可操作地相连，所述第三启动子为组成型启动子；第三终止子，所述第三终止子与所述第三核酸分子可操作地相连。在本发明的一个实施例中，所述第三启动子P4具有如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第三终止子T3具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。由此，含有该表达框的水稻种子在除草剂筛选下，可以呈现抗与不抗除草剂两类种子，因此该表达框在本发明中用于辨认和分选保持系种子。

由此，根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的构建体，以非转基因隐性核雄性不育油菜(brms2/brms2和brms1/brms1)作为转化的受体，进行遗传转化，得到整合含有以下紧密连锁的四个外源基因Pr4，BrMS2，BrSZ1，Pr2的油菜保持系。外源基因的插入与内源雄性不育位点(brms2/brms2和brms1/brms1)是非连锁的，因此得到的转基因油菜保持系含有独立的纯合的brms2和brms1隐性不育位点及杂合的外源基因整合位点。

由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到油菜的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种油菜细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该油菜细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。在本发明的一个实施例中，所述油菜细胞、组织或器官来自油菜纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述油菜纯合隐性雄性不育植株包含BrMS2基因的纯合隐性等位基因。由此，本发明的油菜细胞、组织或器官，可以有效地用于构建保持系并繁殖雄性不育系。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该油菜细胞、组织或器官，不再赘述。

根据本发明的实施例，水稻雄性不育恢复基因的类型并不受特别限制。在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因编码具有如SEQ ID NO：18所示氨基酸序列的蛋白质。即，可以采用的水稻雄性不育恢复基因为OsFG2，由此，可以将其作为水稻受体osfg2纯合突变体(完全雄性不育)的野生型育性恢复基因。OsFG2基因编码的蛋白，在花药发育阶段特异表达。根据本发明的具体实施例，在本发明的一个实施例中，所述水稻雄性不育恢复基因具有如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列，该序列能够有效地使水稻osfg2/osfg2不育受体植株的育性得到恢复。水稻受体osfg2纯合突变体是经过EMS诱变黄华占品种所得，在黄华占不育突变体中，与野生型黄华占相比，该基因编码区的第1688位点由G突变为A，导致对应的其编码的蛋白序列的第563位点的氨基酸由甘氨酸(G)变为天门冬氨酸(D)。在本发明的一个实施例中，所述水稻转化载体的第一表达盒还可以进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地相连，所述第一启动子为雄配子特异性启动子；以及第一终止子，所述第一终止子与所述第一核酸分子可操作地相连。根据本发明的实施例，第一启动子和第一终止子的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，对于OsFG2基因，可以采用OsFG2的内源启动子、ORF区及终止区的序列，均为野生水稻基因组序列。在本发明的一个实施例中，所述第一启动子具有如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第一终止子具有如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，利用该启动子和终止子的组合，能够进一步显著地提高表达相应蛋白的效率，进而能够提高利用构建体构建保持系的效率,并且能够更有效地使水稻osfg2不育受体植株的育性得到恢复。

根据本发明的实施例，水稻花粉失活基因的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因编码具有如SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的蛋白质。由此，可以编码Zm-AA1所编码的α-淀粉酶。根据本发明的实施例，所述花粉失活基因具有如SEQ IDNO：23所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高表达相应蛋白的效率。根据本发明的实施例，第二表达盒进一步包括：第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地相连，所述第二启动子为花粉特异性启动子；以及第二终止子，所述第二终止子与所述第二核酸分子可操作地相连。由此，可以更有效的提高相应基因的表达效率。另外，根据本发明的实施例，在第二表达盒中还可以进一步包括编码导肽的序列，由此，第二表达盒可以有效地编码具有导肽的花粉失活蛋白，由此，可以使得目的基因(花粉失活基因)能够被靶向定位到特定的细胞器中。例如，根据本发明的实施例，编码导肽的序列具有如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列(来自于玉米的brittle-1基因的编码导肽(TP)的序列)。由此，可以有效地将所表达的蛋白靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。进而，根据本发明的具体实施例，该基因在玉米花粉特异性启动子PG47驱动下，与来自于玉米的brittle-1基因的编码导肽(TP)的序列及终止子IN2-1组成表达框，可在发育后期的成熟花粉中特异性表达淀粉酶，并靶向淀粉体，分解花粉中的淀粉，从而使花粉失去活力，丧失授精能力，造成转基因花粉失活。该设计使得所有含有此基因的转基因花粉失活，不能授精还能严格防止基因漂移等生物安全问题，失活的花粉不能与周围其它植株或杂草授粉，因而转基因不能通过花粉漂移到环境中。

另外，根据本发明的实施例，水稻转化的构建体还可以进一步包括：第三表达盒，所述第三表达盒包含第三核酸分子，所述第三核酸分子编码抗除草剂基因，所述抗除草剂基因的类型并不受特别限制。由此，便于通过抗除草剂基因的表达来确定植物是否含有构建体所引入的基因。根据本发明的实施例，可以采用选自抗草甘膦、抗草丁膦、抗百草枯、抗咪唑啉酮基因的至少一种作为筛选基因。在本发明的一个实施例中，可以采用Pr5蛋白作为抗除草剂基因，该基因是OsALS 548(核苷酸1642、1643位由TG变为AT，导致548位氨基酸由Trp变为Met)位点突变后的具有除草剂抗性的水稻基因，过表达该突变的水稻基因可以使转基因植物具有咪唑啉酮类除草剂抗性。在本发明的一个实施例中，所述第三表达盒进一步包括：第三启动子，所述第三启动子与所述第三核酸分子可操作地相连，所述第三启动子为组成型启动子；第三终止子，所述第三终止子与所述第三核酸分子可操作地相连。在本发明的一个实施例中，所述第三启动子具有如SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，所述第三终止子具有如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。由此，含有该表达框的水稻种子在除草剂筛选下，可以呈现抗与不抗除草剂两类种子，因此该表达框在本发明中用于辨认和分选保持系种子。

由此，根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的构建体，以非转基因隐性核雄性不育水稻(osfg2/osfg2)作为转化的受体，进行遗传转化，得到整合含有以下紧密连锁的三个外源基因Pr5，OsFG2，Zm-AA1的水稻保持系。外源基因的插入与内源雄性不育位点(osfg2/osfg2)是非连锁的，因此得到的转基因水稻保持系含有独立的纯合的osfg2隐性不育位点及杂合的外源基因(包括OsFG2基因)整合位点。

由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到水稻的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该水稻细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。在本发明的一个实施例中，所述水稻细胞、组织或器官来自水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述水稻纯合隐性雄性不育植株包含OsFG2基因的纯合隐性等位基因。由此，本发明的水稻细胞、组织或器官，可以有效地用于构建保持系并繁殖雄性不育系。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该水稻细胞、组织或器官，不再赘述。

由此，在本发明的第2方面，本发明提出了一种构建油菜或水稻雄性不育系的方法。根据本发明的实施例，参考图7，该方法包括：将前面所述的油菜或水稻构建体引入到第一油菜或水稻纯合隐性雄性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二油菜或水稻植株，所述第二油菜或水稻植株能够产生可育雄性配子，并且第二油菜或水稻植株中的外源基因处于杂合状态，因此第二油菜或水稻植株中有一半花粉不含外源基因，一半含有外源基因，含外源基因的花粉失活(即失去授精能力)。进而培育所得到的第二油菜或水稻植株，通过第二油菜或水稻植株即转化体与其相应的不育植株杂交授精，可以使不育植株恢复结实得到不携带外源基因的种子，从而使油菜或水稻雄性不育系得以繁殖。根据本发明的实施例，第一油菜或水稻纯合隐性雄性不育植株包含BrMS1/BrMS2或OsFG2基因的纯合隐性等位基因。另外，根据本发明的实施例，可以通过除草剂筛选进行分拣的步骤，即通过检测油菜或水稻种子是否抗除草剂来进行分拣，区分其是否携带外源基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。

在本发明的第3方面，本发明提出了一种恢复油菜或水稻不育植株雄性育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的油菜或水稻构建体引入到油菜或水稻纯合隐性雄性不育植株中。在本发明的一个实施例中，所述油菜或水稻纯合隐性雄性不育植株本别包含BrMS1/BrMS2或OsFG2基因的纯合隐性等位基因。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。

在本发明的第4方面，本发明提出了一种制备油菜或水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的油菜或水稻构建体分别引入到油菜或水稻植株中；以及将所述油菜或水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。在本发明的一个实施例中，所述油菜或水稻植株为油菜或水稻纯合隐性雄性不育植株。在本发明的一个实施例中，所述油菜或水稻纯合隐性雄性不育植株包含BrMS1/BrMS2或OsFG2基因的纯合隐性等位基因。

在本发明的第5方面，本发明提出了一种用于制备杂交油菜或水稻的方法。根据本发明的实施例，该方法采用油菜或水稻雄性不育系，该油菜或水稻雄性不育系是通过前面构建油菜或水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的油菜或水稻雄性不育系进行杂交，提高油菜或水稻杂交的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该方法，不再赘述。

在本发明的第6方面，本发明提出了油菜或水稻雄性不育系在制备杂交种子中的用途。根据本发明的实施例，所述油菜或水稻雄性不育系是通过前面构建油菜或水稻雄性不育系的方法构建的。由此，可以进一步利用本发明的油菜或水稻雄性不育系与恢复系进行杂交，筛选优良的杂交组合，提高杂交制种的效率。前面关于构建体所描述的特征和优点，也适用于该用途，不再赘述。

需要说明的是，根据本发明实施例的构建体及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。具体实施方式述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

具体实施方式

下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：油菜表达载体pBnSI的构建：

在构建油菜的植物表达载体之前，发明人首先分别对表达载体内的每个表达盒单独进行了油菜转化，并进一步对各个表达盒的功能进行了验证。结果表明各个表达盒单独转化油菜时，都能够工作良好，达到预期的设计效果。进一步发明人构建了以下表达载体。其中抗除草剂基因参考中国专利201310116228.2，本发明通过引用并入本专利。

通过装配BrSZ1、Pr2、BrMS2和Pr4表达框的各个元件，来构建如图1所示的pBnSI载体。该载体含有4个表达框，其中，第一表达框为barnase的表达框，组成为来自拟南芥基因组的花粉特意表达启动子P1，如序列表中SEQ ID NO:4所示，细菌来源的barnase基因编码区BrSZ1，如需列表中SEQ ID NO:7所示，以及来自于拟南芥Rbcs基因的终止子T1，如序列表中SEQ ID NO:5所示，构成第一表达框P1::BrSZ1::T1；第二表达框为barstar表达框，组成为来自于烟草花叶病毒的组成型启动子35S启动子P2，如序列表中SEQ ID NO:13所示，人工合成的来自于细菌的barstar基因Pr2，如序列表中SEQ ID NO:8所示，以及35S终止子T2，如序列表中SEQ ID NO:14所示，构成第二表达框P2::Pr2::T2；第三表达框为油菜育性恢复基因表达框BrMS2，该表达框包括来自油菜基因组的BrMS2启动子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:26所示，和来自油菜基因组的BrMS2基因编码区，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:2所示，以及人工合成的rbcs 3A终止子T3，如序列表中SEQ ID NO:15所示，构成第三表达框BrMS2；第四表达框为抗除草剂基因表达框，组成为NOS启动子P4，如序列表中SEQ IDNO:16所示，抗除草剂基因Pr4，如序列表中SEQ ID NO:17所示，Nos终止子T4，如序列表中SEQ ID NO:11所示，构成第四表达框P4::Pr4::T4。

将上述各表达框的元件测序验证后，在pCAMBIA1301载体中依次连入上述片段，最终得到植物表达载体pBnSI，如图1所示。

实施例2：油菜转化

利用电激法将质粒pBnSI转入农杆菌EHA105菌株，利用农杆菌介导的蘸花法对含有纯合的brms2和brms1隐性不育位点的油菜进行遗传转化，得到22株单拷贝转基因植株材料。所述的含有纯合的brms2和brms1隐性不育位点的油菜转化受体材料为甘蓝型油菜。

实施例3：转基因油菜植株的花粉育性检测

对实施例2所得到的22株单拷贝转基因油菜(含有纯合的brms2和brms1隐性不育位点)植株进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有明显的形态差异，但是花粉育性明显不同。

对pBnSI构建体转化油菜得到的转基因植株材料，进行花粉可染率检测，同时对野生型油菜进行花粉可染率检测(图2)。

采用的方法为：在油菜开花期，从转基因油菜植株、及其野生型对照植株各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取1个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1％的Alexander溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数，染成橘红色的为可育花粉，绿色的为败育花粉(图2显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒)。

分析转基因油菜植株的花粉可染率，结果显示对照植株的橘红色花粉占98％～100％；而多个随机抽取的转基因植株中，正常花粉与败育花粉比例接近1:1，表明所构建的保持系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，即构建体pBnSI使转基因株系花粉的50％失活。该结果表明本发明所提供的载体能够达到预期的花粉失活功能。即：一方面barnase基因的表达由花粉特异性启动子驱动，另一方面由35S组成型启动子驱动barstar基因，这样，barnase在花粉中特异性高表达，可以致死雄配子，从而达到花粉败育的目的，同时，barnase在花粉以外的其它植物组织中的表达泄露，就可以完全被组成型表达的barstar所彻底抑制，因此植株的其他表型完全正常。

实施例4：转基因油菜植株的抗除草剂种子与不抗除草剂种子分离分析

对实施例2所得到的22株单拷贝转基因油菜植株(含有纯合的brms2和brms1隐性不育位点)所结T1代种子进行抗除草剂性分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比(图3)，即携带外源基因的抗除草剂种子和不携带外源基因的不抗除草剂种子表现为1:1分离，表明本发明所提供的载体各元件作为整体表达达到预期的花粉失活功能和种子筛选标记功能。

实施例5：水稻表达载体pOsSI的构建：

在构建水稻的植物表达载体之前，发明人首先分别对表达载体内的每个表达盒单独进行了水稻转化，并进一步对各个表达盒的功能进行了验证。结果表明各个表达盒单独转化水稻时，都能够工作良好，达到预期的设计效果。进一步发明人构建了以下水稻表达载体。其中抗除草剂基因参考中国专利201210037789.9，本发明通过引用并入本专利。

通过装配Zm-AA1、OsFG2和Pr5表达框各个元件，来构建图4所示的pOsSI载体。该载体含有3个表达框，其中，第一表达框为Zm-AA1的表达框，组成为来自玉米基因组的花粉特异表达启动子PG47，如序列表中SEQ ID NO:28所示，融合了brittle-1导肽序列的玉米来源的Zm-AA1基因编码区，如序列表中SEQ ID NO:29所示，以及来自于玉米基因组的终止子In2-1，如序列表中SEQ ID NO:30所示，构成第一表达框PG47::TP::Zm-AA1::In2-1；第二表达框为水稻育性恢复基因OsFG2表达框，组成为来自于水稻基因组的启动子P5，如序列表中SEQ ID NO:31所示，来自水稻基因组的OsFG2基因编码区，如序列表中SEQ ID NO:32所示，以及来源的水稻基因组的终止子T5，如序列表中SEQ ID NO:33所示，构成第二表达框P5::OsFG2::T5；第三表达框为抗除草剂基因表达框，组成为来自玉米基因组的组成型表达启动子Ubi，如序列表中SEQ ID NO:25所示，抗除草剂基因Pr5，如序列表中SEQ ID NO:27所示，以及人工合成的终止子T3，如序列表中SEQ ID NO:15所示，构成第四表达框P6::Pr5::T6。

将上述各表达框的元件测序验证后，在pCAMBIA1301载体中依次连入上述片段，最终得到植物表达载体pOsSI，如图4所示。

实施例6：水稻转化

利用电激法将质粒pOsSI转入农杆菌Agl0菌株，利用农杆菌介导法对含有纯合的osfg2隐性不育位点的水稻进行遗传转化，得到32株单拷贝转基因植株材料。具体的转化受体材料为水稻黄华占品种。

实施例7：转基因水稻植株的花粉育性检测

对实施例6所得到的32株单拷贝转基因水稻(含有纯合的osfg2隐性不育位点)植株进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有明显的形态差异，但是花粉育性明显不同。

对pOsSI构建体转化水稻得到的转基因植株材料，进行花粉可染率检测，同时对野生型水稻进行花粉可染率检测(图5)。

采用的方法为：在水稻开花期，从转基因水稻植株、及其野生型对照植株各随机抽取单株，各株取一朵花，每朵花取1个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1％的I2-KI溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数，可以着色为深蓝色的为可育花粉，而不能够着色的为败育花粉(图5显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒)。分析转基因水稻植株的花粉可染率。

结果显示对照植株的可着色的花粉占98％～100％；而多个随机抽取的转基因植株中，正常花粉(可着色)与败育花粉(不能着色)比例接近1:1，表明所构建的保持系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，即构建体pOsSI使转基因株系花粉的50％失活。该结果表明本发明所提供的载体能够达到预期的花粉失活功能。

实施例8：转基因水稻植株的抗除草剂种子与不抗除草剂种子分离分析

对实施例6所得到的32株单拷贝转基因水稻植株(含有纯合的osfg2隐性不育位点)所结T1代种子进行抗除草剂性分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比(图6)，即携带外源基因的抗除草剂种子和不携带外源基因的不抗除草剂种子表现为1:1分离，表明本发明所提供的载体各元件作为整体表达达到预期的花粉失活功能和种子筛选标记功能。

实施例9：创制保持系、繁殖不育系及生产杂交种的技术路线

通过以上在油菜和水稻中经过一系列实施例创制新型保持系和不育系，发明人提出以下创制保持系、繁殖不育系及生产杂交种的技术路线(图7)：该技术涉及三个连锁的功能元件：花粉致死基因，抗除草剂基因，育性恢复基因。其中所选用的花粉致死基因在花粉中表达的时间、水平及致死效率都直接关系到该技术能否成功应用，因此本发明利用花粉发育后期特异性启动子驱动花粉失活基因在花粉成熟期特异表达，实现了特异性花粉致死的效果；利用植物内源启动子控制的雄性不育恢复核基因转化对应的植物雄性不育植株，使转基因植株恢复育性；利用抗除草剂基因可以方便地将转基因植株自交后产生的两类种子分开：不携带转基因的不育种子，没有除草剂抗性，可通过除草剂筛除，携带转基因的可育种子，具有除草剂抗性，可以作为保持系存活下来，由此可以方便地、源源不断地得到保持系；保持系进一步与不育系授粉杂交，使不育系恢复结实，得到不含有转基因的不育系，使不育系得到繁殖；由此得到的不育系既可以与任意恢复系父本杂交，用于杂交种子的生产。利用本发明构建的新型育性调控载体转化植物雄性不育植株，得到的转基因植物植株恢复育性，其花粉育性和种子的除草剂抗性均表现预期的结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市作物分子设计育种研究院

北京兴邦北作生物技术有限公司

<120> 植物新型保持系及不育系建立及其用途

<130>

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 519

<212> PRT

<213> 油菜(Brassica napus)

<400> 1

Met Ser Met Trp Ile Val Leu Ala Cys Met Leu Thr Ser Trp Ile Phe

1 5 10 15

Leu His Arg Trp Gly Gln Arg Asn Lys Arg Gly Pro Lys Thr Trp Pro

20 25 30

Leu Val Gly Ala Ala Ile Glu Gln Leu Thr Asn Phe Asp Arg Met His

35 40 45

Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ser Arg Thr Val Val Val Pro

50 55 60

Met Pro Phe Thr Thr Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Ile Asn Val Glu

65 70 75 80

His Val Leu Lys Thr Asn Phe Ser Asn Tyr Pro Lys Gly Glu Thr Tyr

85 90 95

His Ser Tyr Met Glu Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Ser Asp

100 105 110

Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser Phe Glu Phe Ala

115 120 125

Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val Val Phe Lys Glu Tyr Ser

130 135 140

Leu Lys Leu Phe Ser Ile Leu Cys Gln Ala Ser Phe Lys Asp Gln Gln

145 150 155 160

Val Asp Met Gln Glu Leu Leu Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys

165 170 175

Lys Val Gly Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ala Pro Asp Leu Pro

180 185 190

Glu Asn Arg Phe Ala Lys Ala Phe Asp Thr Ala Asn Ile Ile Val Thr

195 200 205

Leu Arg Phe Ile Asp Pro Leu Trp Lys Met Lys Lys Tyr Leu Asn Ile

210 215 220

Gly Ser Glu Ala Leu Leu Gly Lys Ser Ile Lys Val Val Asp Asp Phe

225 230 235 240

Thr Tyr Ser Met Ile Arg Arg Arg Lys Thr Glu Ile Leu Glu Ala Gln

245 250 255

Lys Ser Pro Ser Asn Asn Ile Lys Met Lys His Asp Ile Leu Ser Arg

260 265 270

Phe Ile Glu Ile Ser Asp Asp Pro Asp Ser Lys Ser Thr Glu Lys Ser

275 280 285

Leu Arg Asp Ile Val Leu Asn Phe Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr

290 295 300

Ala Thr Thr Leu Thr Trp Ala Ile Tyr Met Ile Met Met Asn Glu His

305 310 315 320

Val Ala Glu Lys Leu Cys Ser Glu Leu Gln Glu Leu Glu Arg Glu Lys

325 330 335

Ala Glu Glu Thr Asn Thr Pro Leu Arg Gln Tyr Asp Thr Glu Asp Phe

340 345 350

Lys Ser Phe Asn Glu Arg Val Thr Gln Phe Ala Gly Met Leu Ser Tyr

355 360 365

Asp Ser Leu Gly Lys Leu His Tyr Leu His Ala Val Val Thr Glu Thr

370 375 380

Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln Asp Pro Lys Gly Val Leu Glu

385 390 395 400

Asp Asp Ile Leu Pro Asn Gly Thr Lys Val Lys Ala Gly Gly Met Val

405 410 415

Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Ser

420 425 430

Asp Ala Ala Thr Phe Lys Pro Glu Arg Trp Leu Lys Asp Gly Met Phe

435 440 445

Gln Asn Ala Ser Pro Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg

450 455 460

Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Met

465 470 475 480

Ala Ile Leu Cys Arg Phe Tyr Lys Phe His Leu Val Pro Asn His Pro

485 490 495

Val Lys Tyr Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys

500 505 510

Val Thr Val Ser Arg Arg Ser

515

<210> 2

<211> 1560

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica napus)

<400> 2

atgtctatgt ggatcgttct agcttgcatg ctcacatcat ggatcttctt gcaccgatgg 60

ggacagagga acaagagagg tcccaagaca tggcctttgg tcggagcagc cattgagcag 120

ttgactaact ttgaccgaat gcacgactgg ctcgttgagt atctttacga ctcaagaacc 180

gtagtggttc ctatgccctt caccacttat acatacatag cagatcccat caatgtagaa 240

cacgtcctca aaaccaactt ctccaactac ccaaagggag agacgtacca ctcctatatg 300

gaagttttgt tgggagatgg gatcttcaat tcagatggag agctctggag gaaacagagg 360

aaaaccgcga gtttcgagtt tgcttccaag aatctcagag acttcagtac tgtagtgttt 420

aaagagtata gcctcaagct cttctccatc ctttgtcaag cttctttcaa agaccaacaa 480

gtagacatgc aggaactgtt gatgagaatg actctagact ccatatgtaa agtgggattt 540

ggtgtggaga taggaacatt ggctccagat ctaccagaga atcgctttgc taaggctttc 600

gataccgcaa atataatcgt aacacttcgt ttcatagacc ctctttggaa gatgaaaaag 660

taccttaaca taggatctga ggcattactt ggcaagagca taaaagtagt cgatgatttc 720

acatattcaa tgataagaag aaggaaaaca gagatattag aggcacaaaa atctccttcc 780

aacaacatta agatgaagca tgatatactc tcgaggttta ttgagatcag cgacgatcct 840

gatagcaaat caactgagaa aagcctaaga gatatagtcc tcaactttgt tattgctgga 900

agagatacaa cagcaacaac tctcacttgg gctatatata tgataatgat gaatgaacat 960

gtggccgaga agctttgctc agagctacaa gaactcgaaa gagaaaaggc cgaagagaca 1020

aacacaccgt tgcgtcaata cgatacagag gacttcaagt ccttcaacga gagggtaaca 1080

cagtttgcag gaatgttgag ttatgattct ttaggaaaat tacattactt acatgctgtg 1140

gtaacagaaa cacttcgtct ctacccagca gttcctcagg atccaaaagg agtgttagaa 1200

gatgatatat tgcctaatgg aacaaaagta aaagcaggag gtatggtaac atatgttcct 1260

tactcaatgg gtcgtatgga atacaactgg ggatcagatg cagccacgtt taaacccgag 1320

agatggctta aagatgggat gtttcagaac gcttccccat tcaagttcac agcatttcag 1380

gctggaccta ggatatgctt gggaaaggat tcagcttatc tacaaatgaa gatggcgatg 1440

gcaattcttt gcagatttta taagttccat ttggtaccaa atcatcctgt caagtaccgg 1500

atgatgacaa ttctatctat ggcgcatggt ttgaaagtta ctgtatccag acgttcatag 1560

<210> 3

<211> 1560

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica napus)

<400> 3

atgtctatgt ggatcgttct agcttgcatg ctcacatcat ggatcttctt gcaccgatgg 60

ggacagagga acaagagagg tcccaagaca tggcctttgg tcggagcagc cattgagcag 120

ttgactaact ttgaccgaat gcacgactgg ctcgttgagt atctttacga ctcgagaacc 180

gtagtggttc ccatgccctt caccacttac acatacatag cagatcctat caatgtggaa 240

cacgtcctca aaaccaactt ctccaactac ccaaagggag agacgtacca ctcctatatg 300

gaagttttgt tgggagatgg gatcttcaat tcagatggag agctctggag gaaacagagg 360

aaaaccgcga gtttcgagtt tgcttccaag aatctcagag acttcagtac tgtagtgttt 420

aaagagtata gcctcaagct cttctccatc ctttgtcaag cttctttcaa agaccaacaa 480

gtagacatgc aggaactgtt gatgagaatg actctagact ccatatgtaa agtgagattt 540

ggtgtggaga taggaacatt ggctccagat ctaccagaga atcgctttgc taaggctttc 600

gataccgcaa atataatcgt aacacttcgt ttcatagacc ctctttggaa gatgaaaaag 660

taccttaaca taggatctga ggcattactt ggcaagagca taaaagtagt cgatgatttc 720

acatattcaa tgataagaag aaggaaaaca gagatattag aggcacagaa atctccttcc 780

aacaacatta agatgaagca tgatatactc tcgaggttta ttgagatcag cgacgatcct 840

gatagcaaat caactgagaa aagcctaaga gatatagtcc tcaactttgc tattgctgga 900

agagatacaa cagcaacaac tctcacttgg gctatatata tgataatgat gaatgaacat 960

gtggccgaga agctttgctc agagctacaa gaactcgaaa gagaaaaggc cgaagagaca 1020

aacacaccgt tgcgtcaata cgatacagag gacttcaagt ccttcaacga gagggtaaca 1080

cagtttgcag gaatgttgag ttatgattct ttaggaaaat tacattactt acatgctgtg 1140

gtaacagaaa cacttcgtct ctacccagca gttcctcagg atccaaaagg agtgttagaa 1200

gatgatatat tgcctaatgg aacaaaagta aaagcaggag gtatggtaac atatgttcct 1260

tactcaatgg gtcgtatgga atacaactgg ggatcagatg cagccacgtt taaacccgag 1320

agatggctta aagatgggat gtttcagaac gcttccccat tcaagttcac agcatttcag 1380

gctggaccta ggatatgctt gggaaaggat tcagcttatc tacaaatgaa gatggcgatg 1440

gcaattcttt gcagatttta taagttccat ttggtaccaa atcatcctgt caagtaccgg 1500

atgatgacaa ttctatctat ggcgcatggt ttgaaagtta ctgtatccag acgttcatag 1560

<210> 4

<211> 1088

<212> DNA

<213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliaba)

<400> 4

cggatctgag aaatgagaga ttaccaatag aaggtgagat cgaaccggac aatttgaatc 60

ctccaaggtc tagacttgta actctttctt gtttccgacc acatgtaatc ccaatccaat 120

ggcaaagtgg aaaggagtga ttccatgaag ctaagacctc tctcttgttt tcagtaactt 180

gagacttgaa ctcaagcaaa gcttgcatat cagtctcatt tgaaaaccta gcttgagcaa 240

aaactaagat gcaaacttga agtaacatga gagcattgaa agcaaaaaaa agagagatct 300

tcatgtcgat tataagaagg ataaaagaaa ggttttgctt caatttaaaa tcccaaaaat 360

gaaaagacta acacgaattt agcttaatgg ttacaaaact ataagaaaat ggtcaccaag 420

aaagcaattt gcgtcgactt atgagatacg tcgtttgaat aacacgactt ctcatcagtc 480

aaacttatga ccgtgtcaga aaaaaaaaaa aaaacacaat ctcttgtatt gacaaatctt 540

ctttcaaaca tttgaatatt aacaacattg atgatagcaa ctttcgaaaa aaaaaacata 600

gcatatagtt ttgttcatac taatggaatc tttacttgtt agaaaagaaa gctttagaat 660

tgaagaatca aaaggatcac tcttcttata tacccttata cattcccgcc aaaactaacc 720

gctacaggta aagagagaaa ataagagtag agagagaaac ctaaatttaa agggaagctt 780

ggctaaattt caggagctcc aaaaatggaa ttgcatcgtt gttcatcgtt ttcttctatg 840

aatgaccatt atctctattc atgtaacaaa acccattttc tccaaaaaaa gttgaaattt 900

ttcggttttg tattacctcg cgacatcttc ttccttctcg ggttcccaat tccctcaatt 960

tgggaacctg aaaatctctt cctcaacttc atgatcaatt cttcaggtat ataaaccctt 1020

tgatgataag tttttttctt gtggtgtacg ttatctaacc taatgatatg ttttcttcct 1080

tcagaatg 1088

<210> 5

<211> 646

<212> DNA

<213> 豌豆(Pisum sativum Linn)

<400> 5

cagctttcgt tcgtatcatc ggtttcgaca acgttcgtca agttcaatgc atcagtttca 60

ttgcgcacac accagaatcc tactgagttc gagtattatg gcattgggaa acatgttttt 120

cttgtaccat ttgttgtgct tgtaatttac tgtgtttttt attcggtttt cgctatcgaa 180

ctgtgaaatg gaaatggatg gagaagagtt aatgaatgat atggtccttt tgttcattct 240

caaattaata ttatttgttt tttctcttat ttgttgtgtg ttgaatttga aaatataaga 300

gatatgcaaa cattttgttt tgagtaaaaa tgtgtcaaat cgtggcctct aatgaccgaa 360

gttaatatga ggagtaaaac acttgtagtt gtaccattat gcttattcac taggcaacaa 420

atatattttc agacctagaa aagctgcaaa tgttactgaa tacaagtatg tcctcttgtg 480

ttttagacat ttatgaactt tcctttatgt aattttccag aatccttgtc agattctaat 540

cattgcttta taattatagt tatactcatg gatttgtagt tgagtatgaa aatatttttt 600

aatgcatttt atgacttgcc aattgattga caacatgcat caatcg 646

<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln

20 25 30

Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro

35 40 45

Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu

50 55 60

Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr

65 70 75 80

Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu

85 90 95

Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg

100 105 110

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atggctcaag tgattaacac tttcgatgga gtggctgatt acctccaaac ttaccacaag 60

ctcccagaca actacatcac taagtctgag gctcaggctc ttggatgggt tgcttctaag 120

ggaaacctcg ctgatgttgc tcctggaaag tctattggag gtgatatctt ctctaacaga 180

gagggaaagc tccctggaaa gtctggtaga acttggagag aggctgacat caactacacc 240

tctggattca ggaactctga tagaatcctc tactcttctg attggcttat ctacaagact 300

actgatcact accagacttt cactaagatc agatga 336

<210> 8

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Met Lys Lys Ala Val Ile Asn Gly Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ser Asp

1 5 10 15

Leu His Gln Thr Leu Lys Lys Glu Leu Ala Leu Pro Glu Tyr Tyr Gly

20 25 30

Glu Asn Leu Asp Ala Leu Trp Asp Cys Leu Thr Gly Trp Val Glu Tyr

35 40 45

Pro Leu Val Leu Glu Trp Arg Gln Phe Glu Gln Ser Lys Gln Leu Thr

50 55 60

Glu Asn Gly Ala Glu Ser Val Leu Gln Val Phe Arg Glu Ala Lys Ala

65 70 75 80

Glu Gly Cys Asp Ile Thr Ile Ile Leu Ser

85 90

<210> 9

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atggtgtcta agggagagga ggataacatg gctatcatca aggagttcat gagattcaag 60

gtgcacatgg agggatctgt gaacggacac gagttcgaga tcgagggaga gggagaggga 120

agaccttacg agggaaccca gaccgctaag ctcaaggtga ccaagggtgg acctcttcct 180

ttcgcttggg acatcctttc tcctcagttc atgtacggat ctaaggctta cgtgaagcac 240

cctgctgaca tccctgacta cttgaagctc tctttccctg agggattcaa gtgggagaga 300

gtgatgaact tcgaggacgg aggagtggtg accgtgaccc aggactcttc ctttcaggac 360

ggagagttca tctacaaggt gaagctcaga ggaaccaact tcccctctga cggacctgta 420

atgcagaaga agactatggg atgggaggct tcttctgaga gaatgtaccc tgaggacggt 480

gctctgaagg gagagatcaa gcagagactt aagctcaagg acggaggaca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cctgtgcagc ttcctggagc ttacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctctcacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

agagccgagg gaagacactc taccggagga atggacgagc tttacaagta g 711

<210> 10

<211> 1138

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica napus)

<400> 10

tcttcatcgg tgattgattc ctttaaagac ttatgtttct tatcttgctt ctgaggcaag 60

tattcagtta ccagttacca cttatattct ggactttctg actgcatcct catttttcca 120

acattttaaa tttcactatt ggctgaatgc ttcttctttg aggaagaaac aattcagatg 180

gcagaaatgt atcaaccaat gcatatatac aaatgtacct cttgttctca aaacatctat 240

cggatggttc catttgcttt gtcatccaat tagtgactac tttatattat tcactcctct 300

ttattactat tttcatgcga ggttgccatg tacattatat ttgtaaggat tgacgctatt 360

gagcgttttt cttcaatttt ctttatttta gacatgggta tgaaatgtgt gttagagttg 420

ggttgaatga gatatacgtt caagcgaatg gcataccgtt ctcgagtaag gatgacctac 480

ccattcttga gacaaatgtt acattttagt atcagagtaa aatgtgtacc tataactcaa 540

attcgattga catgtatcca ttcaacataa aattaaacca gcctgcacct gcatccacat 600

ttcaagtatt ttcaaaccgt tcggctccta tccaccgggt gtaacaagac ggattccgaa 660

tttggaagat tttgactcaa attcccaatt tatattgacc gtgactaaat caactttaac 720

ttctataatt ctgattaagc tcccaattta tattcccaac ggcactacct ccaaaattta 780

tagactctca tcccctttta aaccaactta gtaaacgttt ttttttttaa ttttatgaag 840

ttaagttttt accttgtttt taaaaagaat cgttcataag atgccacgcc agaacattag 900

ctacatgtta cacatagcat gcagccgcgg agaattgttt ttcttcgcca cttgtcactc 960

ccttcaaaca cctaagagct tctctctcac agcacacaca tacaatcaca tgcgtgcatg 1020

cattattaca cgtgatcgcc atgcaaatct cctttatagc ctataaatta actcatccgc 1080

ttcactcttt actcaaacca aaactcatca atacaaacaa gattaaaaac atacacga 1138

<210> 11

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 60

attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 120

acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 180

atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 240

ttactagatc ggg 253

<210> 12

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

atgccatcga tgcttgttct cgtcggcaca atgccgtcct tggcttctct ggttagtcta 60

ggtggtgctt gtgcaagcgt ttctggaacg agttcttcgg atgcatcgta tgctttagtt 120

aagagggttt ctttgtcaag gagaagtgtt aaggggacta agaaatggct gtgtagatat 180

tctgtttcgt cttcaactac tactactact gctgacttca ttgctgaccc tgcagggttc 240

acgttttcct ccaccttatt gtttcagagt ttcaattggg agtcatggaa gaaagaagga 300

ggattctaca attctctcca caactccatt gacgacatag ccaacgctgg aatcactcat 360

ctttggcttc ctcctccttc tcaatccgtt gctcctgaag gttacttacc gggaaagcta 420

tacgatctaa acagctccaa atacggttca gaggcggaac tgaaatcgtt aatcaaagcg 480

ttgaatcaaa aaggaataaa agctttggct gatatagtga ttaaccacag aacagctgag 540

aggaaagacg ataaatgtgg atactgttat ttcgaaggtg ggacttccga tgatcgtctt 600

gattgggatc cttcctttgt ctgccgcaat gaccctaaat ttcccggtac cggaaacctc 660

gacaccggag gagattttga tggagcgccc gacatcgacc accttaaccc tagagttcag 720

aaagagttgt ccgaatggat gaattggctt aaaactgaaa tcggattcca tggttggaga 780

tttgattatg ttcgaggtta tgcatcttcc atcaccaaat tatacgttca gaatacatca 840

ccggattttg cggtgggtga gaaatgggac gatatgaagt acggaggaga cgggaaacta 900

gactatgatc agaacgagca tcggtcgggt ctcaaacagt ggatcgagga agcgggtggt 960

ggtgtgttga cagcttttga tttcaccacc aaagggatct tacagtctgc tgtcaaaggt 1020

gagctttgga gactaaagga ctcgcaggga aaaccgcctg gtatgatagg aatcatgccc 1080

ggaaacgctg tcacattcat agataaccat gatacattca gaacgtgggt tttcccttct 1140

gataaagtct tgcttggata cgtttatata cttactcatc caggaactcc ttgcattttt 1200

tataatcatt acatagaatg gggactaaaa gagagcatct caaagctggt ggctatcagg 1260

aacaaaaatg ggattggtag cacaagctct gtaacgataa aagcggcaga ggcggatctc 1320

tacttggcta tgattgatga taaagttatc atgaagattg gaccaaagca agatgtggga 1380

acacttgttc cttctaattt tgctttagct tattcaggcc ttgactttgc tgtctgggag 1440

aagaagtaa 1449

<210> 13

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

cccagattag ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt 60

acgcagcagg tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggaa atcaaatacc 120

ttcccaagaa ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag 180

agaaagatat atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc 240

ttcacaaacc aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat 300

caaaggccat ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg 360

gcgaacagtt catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca 420

tggtggagca cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc 480

aaagggcaat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt 540

gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat 600

gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca 660

aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 720

caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact 780

atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg 840

ggactctag 849

<210> 14

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tgcagcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 60

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 120

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 180

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 240

ctatgttact agatcgggct cgagaagct 269

<210> 15

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tcgacaggcc tcccagcttt cgtccgtatc atcggtttcg acaacgttcg tcaagttcaa 60

tgcatcagtt tcattgccca cacaccagaa tcctactaag tttgagtatt atggcattgg 120

aaaagctgtt ttcttctatc atttgttctg cttgtaattt actgtgttct ttcagttttt 180

gttttcggac atcaaaatgc aaatggatgg ataagagtta ataaatgata tggtcctttt 240

gttcattctc aaattattat tatctgttgt ttttacttta atgggttgaa tttaagtaag 300

aaaggaacta acagtgtgat attaaggtgc aatgttagac atataaaaca gtctttcacc 360

tctctttggt tatgtcttga attggtttgt ttcttcactt atctgtgtaa tcaagtttac 420

tatgagtcta tgatcaagta attatgcaat caagttaagt acagtatagg ctttttgtgt 480

cgaggggctg ca 492

<210> 16

<211> 288

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gatcatgagc ggagaattaa gggagtcacg ttatgacccc cgccgatgac gcgggacaag 60

ccgttttacg tttggaactg acagaaccgc aacgttgaag gagccactca gccgcgggtt 120

tctggagttt aatgagctaa gcacatacgt cagaaaccat tattgcgcgt tcaaaagtcg 180

cctaaggtca ctatcagcta gcaaatattt cttgtcaaaa atgctccact gacgttccat 240

aaattcccct cggtatccaa ttagagtctc atattcactc tcaatcca 288

<210> 17

<211> 1968

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa agactcctcc 120

cgtctccacc gtcctctcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

ccttcccctg aaaaaaccga caagaacaag actttcgtct cccgctacgc tcccgacgag 240

ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa gccctcgagc gtcaaggcgt cgaaaccgtc 300

tttgcttatc ccggaggtac ttccatggag atccaccaag ccttgactcg ctcctccacc 360

atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa ggaggagtct tcgccgccga gggttacgct 420

cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata gccacttcgg gtcccggagc taccaacctc 480

gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag 540

gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg 600

aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg atggatgttg atgacatacc taggatcgtt 660

caagaagctt tctttctagc tacttccggt agacccggac cggttttggt tgatgttcct 720

aaggatattc agcagcagct tgcgattcct aactgggatc aacctatgcg cttacctggc 780

tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg 840

atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa 900

gaactgggga gatttgtcga gcttactggg atccccgttg cgagtacttt gatggggctt 960

ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg 1020

tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat 1080

gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac 1140

attgattctg ctgagattgg gaagaataag acacctcacg tgtctgtgtg tggtgatgta 1200

aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt cttgagaacc gggcggagga gctcaagctt 1260

gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc gagcagaaac agaagttccc tttgagcttc 1320

aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag tacgcgattc agatcctcga cgagctaacc 1380

gaagggaagg caattatcag tactggtgtt ggacagcatc agatgtgggc ggcgcagttt 1440

tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg tcgtcatcag gcctcggagc tatgggtttt 1500

ggacttcctg ctgcgattgg agcgtctgtg gcgaaccctg atgcgattgt tgtggatatt 1560

gacggtgatg gaagcttcat aatgaacgtt caagagctgg ccacaatccg tgtagagaat 1620

cttcctgtga agatactctt gttaaacaac cagcatcttg ggatggtcat gcaatgggaa 1680

gatcggttct acaaagctaa cagagctcac acttatctcg gggacccggc aagggagaac 1740

gagatcttcc ctaacatgct gcagtttgca ggagcttgcg ggattccagc tgcgagagtg 1800

acgaagaaag aagaactccg agaagctatt cagacaatgc tggatacacc aggaccatac 1860

ctgttggatg tgatatgtcc gcaccaagaa catgtgttac cgatgatccc aagtggtggc 1920

actttcaaag atgtaataac agaaggggat ggtcgcacta agtactga 1968

<210> 18

<211> 586

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 18

Met Ala Ala Leu Gly Arg Ala Ser Ser Ser Ala Pro Val Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Val Leu Leu Ser Leu Cys Leu Ala Ala Leu Ser Glu Glu

20 25 30

Gln Glu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Phe Val Arg His Ala Gln Asp Ala

35 40 45

Pro Leu Val Ser Ser Tyr Asn Tyr Ile Val Ile Gly Gly Gly Thr Ala

50 55 60

Gly Cys Pro Leu Ala Ala Thr Leu Ser Glu His Ser Arg Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Glu Arg Gly Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Met Ser Ser Glu Gln His

85 90 95

Phe Thr Asp Ala Leu Ala Asp Thr Ser Pro Ala Ser Pro Ala Gln Arg

100 105 110

Phe Ile Ser Glu Asp Gly Val Val Asn Ala Arg Ala Arg Val Leu Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Cys Leu Asn Ala Gly Phe Tyr Thr Arg Ala Ser Asn Glu

130 135 140

Tyr Val Arg Ala Ser Gly Trp Asp Ala Arg Leu Val Asn Ser Ser Tyr

145 150 155 160

Arg Trp Val Glu Arg Ser Leu Val Phe Arg Pro Asp Val Pro Pro Trp

165 170 175

Gln Ala Ala Leu Arg Asp Ala Leu Leu Glu Val Gly Val Thr Pro Asp

180 185 190

Asn Gly Phe Thr Phe Asp His Val Thr Gly Thr Lys Ile Gly Gly Thr

195 200 205

Ile Phe Asp Asn Ser Gly Gln Arg His Thr Ala Ala Asp Phe Leu Arg

210 215 220

His Ala Arg Pro Arg Gly Leu Thr Val Leu Leu Tyr Ala Thr Val Ser

225 230 235 240

Arg Ile Leu Phe Lys Ser Gln Asp Gly Val Pro Tyr Pro Val Ala Tyr

245 250 255

Gly Val Val Phe Ser Asp Pro Leu Gly Val Gln His Arg Val Tyr Leu

260 265 270

Arg Asp Gly Asp Lys Asn Glu Val Ile Val Ser Ala Gly Thr Leu Gly

275 280 285

Ser Pro Gln Leu Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Gln Ala His Leu

290 295 300

Glu Ala His Gly Ile Glu Val Ile Val Asp Gln Pro Met Val Gly Gln

305 310 315 320

Gly Val Ala Asp Asn Pro Met Asn Ser Val Phe Ile Pro Ser Pro Val

325 330 335

Pro Val Glu Leu Ser Leu Val Gln Val Val Gly Ile Thr Arg Ser Gly

340 345 350

Ser Phe Ile Glu Gly Val Ser Gly Ser Glu Phe Gly Met Pro Val Ser

355 360 365

Asp Gly Ala Leu Arg Trp Ala Arg Ser Phe Gly Met Leu Ser Pro Gln

370 375 380

Thr Gly Gln Leu Gly Thr Leu Pro Pro Lys Gln Arg Thr Pro Glu Ala

385 390 395 400

Leu Gln Arg Ala Ala Glu Ala Met Met Arg Leu Asp Arg Arg Ala Phe

405 410 415

Arg Gly Gly Phe Ile Leu Glu Lys Ile Leu Gly Pro Val Ser Ser Gly

420 425 430

His Val Glu Leu Arg Thr Thr Asp Pro Arg Ala Asn Pro Ser Val Thr

435 440 445

Phe Asn Tyr Phe Arg Glu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Cys Val His Gly

450 455 460

Ile Glu Thr Ile Glu Arg Val Ile Gln Ser Arg Ala Phe Ser Asn Phe

465 470 475 480

Thr Tyr Ala Asn Ala Ser Val Glu Ser Ile Phe Thr Asp Ser Ala Asn

485 490 495

Phe Pro Val Asn Leu Leu Pro Arg His Val Asn Asp Ser Arg Ser Pro

500 505 510

Glu Gln Tyr Cys Met Asp Thr Val Met Thr Ile Trp His Tyr His Gly

515 520 525

Gly Cys His Val Gly Ala Val Val Asp Asp Asp Tyr Arg Val Phe Gly

530 535 540

Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Ser Ser Thr Phe Lys Tyr Ser Pro

545 550 555 560

Gly Thr Asn Pro Gln Ala Thr Val Met Met Leu Gly Arg Tyr Met Gly

565 570 575

Val Lys Ile Gln Ser Glu Arg Trp Lys Lys

580 585

<210> 19

<211> 5952

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 19

ttctgaccaa agaagggcgc cgtatccggg agtttgtttc gtcgtcgttt gcttcgtttg 60

acgatgatga accagaacca cacgtactgg aacagaggac gctgcgagtg gctactggct 120

agtaagtggc tagtagtgta gtggtagtag ttaggcaggc aaccttgcct ggtgtgtgtg 180

tgctttgttc attccgttat actagaggct agttgtcagt tggttacctg aagtgaactg 240

atgcagtggt tggtaaaaga aaaaactgag actgatgttt gttagatgcg taagcaagct 300

tgccgtaatt gtggcgtgtt gataaaagtg cggctaagaa atagttaagt gtaatatagt 360

taagctttca attgaagaat ttaccatttg tcactctacc aaaatactag tgctcaaatg 420

ccactctccc aaatattcat tcctaaatgt cacccggacc tcaccactta tgtttgaatg 480

aaaagtgagg ctgacatgtg cgttcggatg gcatttggga atgaaaattt aggagagtgg 540

tatttgagtg ctatcatttt ggtagttgca aatagtaaat tctcccccta ttttctatga 600

cactaaactc agcccaatac tataaattgg actaaaatat attttgaaac ggaggtagta 660

gtataacata tactatgtcc taaggctaaa aaggtgtggg ggcgaagcaa acatttacct 720

agaaaactac gccataatca aaatgtggca ttacaaagtg aagcaactaa ccaaataacc 780

ccaagtaata ttagtaagaa aatcccccac cagatttttc aaattctcaa tcgcaagatc 840

tgtcatctaa aatctacatt ttatctccac cctccaatac aaacaaatag tcaagcccta 900

gccaccactt ccacatcgct cctcctaacc tcaccctgtg ctacgctgaa ccaatcatgc 960

cctctgcacc accaccattt agcctcaatg gcatctccct caacgctggt gatgctcgcc 1020

gacaagcacc tccatcgcca tccctattgc catcatcctc cttgagatgg cttctcatgt 1080

gccatcacca tttcttatgt ccttacgctg ttgtcttcct cgtctctaat ggtcttgtcg 1140

ctgaattcat gaccaccacc acctaaccaa tctagcgagg tgcctgaccc tattctcatc 1200

ttccgtctcg agcaactcac catcacctaa ttacatgatc gggattctct cgccataacc 1260

actatccatt gtcctcgtag ctacgacggc gtcactgtca tctcgttgcc ttcccaatgc 1320

caccgtccac catcaggccg ctatctcctt agcctcactc taagcggagg aacctatgct 1380

ctctctaact ggtcagacca ctgtcaatgt ctctggacat aatcaacatt gttggagagg 1440

cagagagcag aaattgtgag gtagatataa aggttagata tttgtaagat tttcctctta 1500

attttcaatc gaatgtggtt tagggaaatg gatatttttt ttactagact ggcgtatagc 1560

aatccgaaga cgaagaaaga aggaggagga gtaaaacaca aaaaaagaaa ccaaccgtct 1620

taaaacttac aactttacca ttgggcaata caactgcaat gggccaagaa gttaatttaa 1680

agttaagagc aaattcattt ggaccacctt ttgttacaga tgcttcactt tggaccacat 1740

accacccatc tctcttctcg agcatgaaca atctcgatta cattggctcc tactcatcaa 1800

taaactctca catatatatg taaaaccatt catcggtata tgacaagtta tatatggata 1860

aaagagttga ggatgggtaa gaataataac cggtataaag tgagaacatt gataaacatc 1920

gctaataaaa gttcgtctat agtaaaattt actctaaaat taaatcacct aatattttaa 1980

tatttttttg tacaaatgga ccgtttcaat ggggctttat cagatttagt tgagatgcat 2040

acatggtaag caccgtcata atcttgccca agagctgacc caactcatta aaattacgct 2100

tcttttacga cttaataaat caagaagaaa ccattgaaat ccagcctgcc ccgactgtct 2160

cgtaacagaa aaataactca gcaacgacta aattatgatt ttaaaatggc aaaaatatca 2220

aagcacgttc gaaacaatcg caagattggc aagtaaactc tcctgcttgc ttgctcacaa 2280

ccacatcaga tcattgatca atgtttcatc agctcatcac ttctgcatgc atgttatatt 2340

cttctcaggg ctccacaatt tacaaagctg ctcgaagatc ttctttgcag tgcaaagcaa 2400

tgctctgcaa gattattcaa gacatctact cttgatctac cattgagcta actccggata 2460

tataaacaga ccgaacgttt cgtcccaggg gaatgtgaaa gttagcgaat ttgcccggcg 2520

aaaatggcag cacttggccg cgcgagctcg tcggcgccgg tgcttgccgc cgccgccgcc 2580

gtgctcctct cgctctgcct cgccgcgctc tcggaagagc aaggtgcgta aacgttgcgt 2640

tgtatctttg cgttgatgcg tgttgcgtcg tcgtcgtgtt catggcgtgc gatggcgttg 2700

tgcagagcaa ctggagaacc tgcggttcgt gcggcacgcg caggacgcgc cgctggtgtc 2760

gagctacaac tacatcgtca tcggcggcgg cacggcgggg tgcccgctgg cggcgacgct 2820

gtcggagcac tcgcgcgtgc tgctgctgga gcgcggcggc ctgccgtacg ccaacatgtc 2880

gagcgagcag cacttcacgg acgcgctggc cgacacgtcg ccggcgtcgc cggcgcagcg 2940

gttcatctcg gaggacggcg tggtgaacgc ccgggcgcgg gtgctcggcg gcgggagctg 3000

cctcaacgcc gggttctaca cgcgggcgag caacgagtac gtgcgcgcct ccgggtggga 3060

cgcgcggctg gtgaactcgt cgtaccggtg ggtggagcgc tcgctggtgt tccgccccga 3120

cgtgccgccg tggcaggcgg cgctccgcga cgcgctgctc gaggtcggcg tcacgcccga 3180

caacggcttc accttcgacc acgtcaccgg caccaagatc ggcggcacca tcttcgacaa 3240

ctccggccag cgccacaccg ccgccgactt cctccgccac gcccgccccc gcggcctcac 3300

cgtcctcctc tacgccaccg tctcccgtat cctcttcaaa agccaaggta cacagctacg 3360

atgaaaatgg aaaatgtgct gtgcgccgaa gaagcttgac ctcacgacgg cgagcttttg 3420

ccatggcgtg cagacggggt gccgtacccg gtggcgtacg gggtggtgtt ctcggacccg 3480

ctgggggtgc agcaccgggt gtacctccgc gacggcgaca agaacgaggt gatcgtgtcg 3540

gcggggacgc tggggagccc gcagctgctg atgctgagcg gcgtcgggcc gcaggcgcac 3600

ctggaggcgc acggcatcga ggtgatcgtg gaccaaccca tggtcgggca gggcgtcgcc 3660

gacaacccga tgaactcggt gttcatcccg tcgccggtgc cggtggagct ctccctggtg 3720

caggtcgtcg gcatcacccg ctccggcagc ttcatcgagg gggtgagcgg gtcggagttc 3780

ggcatgccgg tgtcggacgg cgcgctccgg tgggcgcgca gcttcgggat gctgtcgccg 3840

cagacggggc agctcggcac gctgccgccg aagcagagga cgccggaggc gctgcagcgg 3900

gcggcggagg cgatgatgcg gctggacagg agggcgttcc ggggaggctt catcctggag 3960

aagatcctcg ggccggtgtc ctccggccac gtcgagctgc gaaccaccga cccgagggcg 4020

aacccgtcgg tgacgttcaa ctacttccgc gaggcagagg atctggagcg gtgcgtccat 4080

ggcatcgaga cgatcgagcg ggtgatccag tcgcgggcct tctccaactt cacctacgcc 4140

aacgcctccg tcgagtccat cttcaccgat tccgccaact tccccgtcaa cctgctgccg 4200

cgccatgtca acgactcgcg ctcgccggag cagtactgca tggacaccgt catgaccatc 4260

tggcactacc acggcggctg ccatgtcggc gccgtcgtcg acgacgatta ccgggtgttc 4320

ggggtgcagg ggctcagggt gatcgacagc tccaccttca agtactcccc cggcaccaac 4380

cctcaggcca ccgtcatgat gctcggcagg taactggcat cattttagct catgaaagtg 4440

cattgccatg agtaacaaca cactaacagt atagttttca atatggacac tgggcaggta 4500

tatgggtgtg aagattcagt ccgagagatg gaagaaatga tgaacaaaag ataatttcgt 4560

ttcaggagca aaaaaatgca tgtaattcaa ggaaaagaaa atgttcaact gtctttagag 4620

tttagagtag attttatttg cacccactta atttttactc ttctctagac ataggttcag 4680

tatctgcttg ttgattatgt aaccttgaag aagcattgca aaaacaaagc ggaaacttat 4740

gttaccaagg gcatgacgaa gaaataaatg gattagattt cattgacact tagaaaatgg 4800

aaccagcaaa tcaaggctga aaataattac actagaaact tattttaatg gctttacatg 4860

tcgctacata cttaaatcaa tcaaagttgc taccaaagcc atgttcccta aacagagggt 4920

tccgggcttt caaacattct taatcttcta tacattgata aaaagtatac ataaaaagaa 4980

aacctattaa gatggaaatg ttgaattctc ttaagaaagg cataaaaaat gcagggtaat 5040

aaccttttct tgtcatgtcc tacttggttt caacctatat tgctagcaaa attttcacgc 5100

tatctataac ctcaggaagc agaatagctc agaatcacta gcaattgtat acttacagat 5160

aatcgaaatt catattgtga ggttttcttg gatggctcgg aatgatccac agatgttacc 5220

acccatgtct gggaatgacg tacatcctgg caagggtttc accttgccct tacggtcaac 5280

acttacaggg tacttcatta ggtggcctct catctcagtc acctcattat caacaaatcg 5340

ttcccagttc tgttcaccga tttggcgaac tcgtctcatg cattccatgg tctctggata 5400

gttgaagcct tcctcaacca ctccaatatg ctccgcccaa agagacattc tgtacccata 5460

aatctacaca tgaaatcagc agatttgaat tagagtgtgg ttctagaaat atcagtcatc 5520

ctaaaatagg tatatccctc aaaccaagag acaactagtc gagattcctt cacagttgta 5580

cagggctatt tgaaatatga ctgtacttga tatgcaactt tttctctatt tctacaaata 5640

catttgtatt ttccatacat ttgtagctac aatctggtcc caccatgatg gatggtgtag 5700

atagctctct ttttcttcaa ttaacatatt cttgagaatg aatggtagct tctctttttt 5760

tcttccaatt aacatattct taagagtgag tggtagcttt ttttagcctt atctaaaaaa 5820

atatgattga tagggtacga atttcccttt aggttactct gccaaaacaa aagataattg 5880

caacaaatat atatggctgg attgatgcag tagtgctgaa caacagacaa taacagtgta 5940

aagcaaacga gt 5952

<210> 20

<211> 2520

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 20

ttctgaccaa agaagggcgc cgtatccggg agtttgtttc gtcgtcgttt gcttcgtttg 60

acgatgatga accagaacca cacgtactgg aacagaggac gctgcgagtg gctactggct 120

agtaagtggc tagtagtgta gtggtagtag ttaggcaggc aaccttgcct ggtgtgtgtg 180

tgctttgttc attccgttat actagaggct agttgtcagt tggttacctg aagtgaactg 240

atgcagtggt tggtaaaaga aaaaactgag actgatgttt gttagatgcg taagcaagct 300

tgccgtaatt gtggcgtgtt gataaaagtg cggctaagaa atagttaagt gtaatatagt 360

taagctttca attgaagaat ttaccatttg tcactctacc aaaatactag tgctcaaatg 420

ccactctccc aaatattcat tcctaaatgt cacccggacc tcaccactta tgtttgaatg 480

aaaagtgagg ctgacatgtg cgttcggatg gcatttggga atgaaaattt aggagagtgg 540

tatttgagtg ctatcatttt ggtagttgca aatagtaaat tctcccccta ttttctatga 600

cactaaactc agcccaatac tataaattgg actaaaatat attttgaaac ggaggtagta 660

gtataacata tactatgtcc taaggctaaa aaggtgtggg ggcgaagcaa acatttacct 720

agaaaactac gccataatca aaatgtggca ttacaaagtg aagcaactaa ccaaataacc 780

ccaagtaata ttagtaagaa aatcccccac cagatttttc aaattctcaa tcgcaagatc 840

tgtcatctaa aatctacatt ttatctccac cctccaatac aaacaaatag tcaagcccta 900

gccaccactt ccacatcgct cctcctaacc tcaccctgtg ctacgctgaa ccaatcatgc 960

cctctgcacc accaccattt agcctcaatg gcatctccct caacgctggt gatgctcgcc 1020

gacaagcacc tccatcgcca tccctattgc catcatcctc cttgagatgg cttctcatgt 1080

gccatcacca tttcttatgt ccttacgctg ttgtcttcct cgtctctaat ggtcttgtcg 1140

ctgaattcat gaccaccacc acctaaccaa tctagcgagg tgcctgaccc tattctcatc 1200

ttccgtctcg agcaactcac catcacctaa ttacatgatc gggattctct cgccataacc 1260

actatccatt gtcctcgtag ctacgacggc gtcactgtca tctcgttgcc ttcccaatgc 1320

caccgtccac catcaggccg ctatctcctt agcctcactc taagcggagg aacctatgct 1380

ctctctaact ggtcagacca ctgtcaatgt ctctggacat aatcaacatt gttggagagg 1440

cagagagcag aaattgtgag gtagatataa aggttagata tttgtaagat tttcctctta 1500

attttcaatc gaatgtggtt tagggaaatg gatatttttt ttactagact ggcgtatagc 1560

aatccgaaga cgaagaaaga aggaggagga gtaaaacaca aaaaaagaaa ccaaccgtct 1620

taaaacttac aactttacca ttgggcaata caactgcaat gggccaagaa gttaatttaa 1680

agttaagagc aaattcattt ggaccacctt ttgttacaga tgcttcactt tggaccacat 1740

accacccatc tctcttctcg agcatgaaca atctcgatta cattggctcc tactcatcaa 1800

taaactctca catatatatg taaaaccatt catcggtata tgacaagtta tatatggata 1860

aaagagttga ggatgggtaa gaataataac cggtataaag tgagaacatt gataaacatc 1920

gctaataaaa gttcgtctat agtaaaattt actctaaaat taaatcacct aatattttaa 1980

tatttttttg tacaaatgga ccgtttcaat ggggctttat cagatttagt tgagatgcat 2040

acatggtaag caccgtcata atcttgccca agagctgacc caactcatta aaattacgct 2100

tcttttacga cttaataaat caagaagaaa ccattgaaat ccagcctgcc ccgactgtct 2160

cgtaacagaa aaataactca gcaacgacta aattatgatt ttaaaatggc aaaaatatca 2220

aagcacgttc gaaacaatcg caagattggc aagtaaactc tcctgcttgc ttgctcacaa 2280

ccacatcaga tcattgatca atgtttcatc agctcatcac ttctgcatgc atgttatatt 2340

cttctcaggg ctccacaatt tacaaagctg ctcgaagatc ttctttgcag tgcaaagcaa 2400

tgctctgcaa gattattcaa gacatctact cttgatctac cattgagcta actccggata 2460

tataaacaga ccgaacgttt cgtcccaggg gaatgtgaaa gttagcgaat ttgcccggcg 2520

<210> 21

<211> 1380

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 21

tgaacaaaag ataatttcgt ttcaggagca aaaaaatgca tgtaattcaa ggaaaagaaa 60

atgttcaact gtctttagag tttagagtag attttatttg cacccactta atttttactc 120

ttctctagac ataggttcag tatctgcttg ttgattatgt aaccttgaag aagcattgca 180

aaaacaaagc ggaaacttat gttaccaagg gcatgacgaa gaaataaatg gattagattt 240

cattgacact tagaaaatgg aaccagcaaa tcaaggctga aaataattac actagaaact 300

tattttaatg gctttacatg tcgctacata cttaaatcaa tcaaagttgc taccaaagcc 360

atgttcccta aacagagggt tccgggcttt caaacattct taatcttcta tacattgata 420

aaaagtatac ataaaaagaa aacctattaa gatggaaatg ttgaattctc ttaagaaagg 480

cataaaaaat gcagggtaat aaccttttct tgtcatgtcc tacttggttt caacctatat 540

tgctagcaaa attttcacgc tatctataac ctcaggaagc agaatagctc agaatcacta 600

gcaattgtat acttacagat aatcgaaatt catattgtga ggttttcttg gatggctcgg 660

aatgatccac agatgttacc acccatgtct gggaatgacg tacatcctgg caagggtttc 720

accttgccct tacggtcaac acttacaggg tacttcatta ggtggcctct catctcagtc 780

acctcattat caacaaatcg ttcccagttc tgttcaccga tttggcgaac tcgtctcatg 840

cattccatgg tctctggata gttgaagcct tcctcaacca ctccaatatg ctccgcccaa 900

agagacattc tgtacccata aatctacaca tgaaatcagc agatttgaat tagagtgtgg 960

ttctagaaat atcagtcatc ctaaaatagg tatatccctc aaaccaagag acaactagtc 1020

gagattcctt cacagttgta cagggctatt tgaaatatga ctgtacttga tatgcaactt 1080

tttctctatt tctacaaata catttgtatt ttccatacat ttgtagctac aatctggtcc 1140

caccatgatg gatggtgtag atagctctct ttttcttcaa ttaacatatt cttgagaatg 1200

aatggtagct tctctttttt tcttccaatt aacatattct taagagtgag tggtagcttt 1260

ttttagcctt atctaaaaaa atatgattga tagggtacga atttcccttt aggttactct 1320

gccaaaacaa aagataattg caacaaatat atatggctgg attgatgcag tagtgctgaa 1380

<210> 22

<211> 495

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 22

Met Ala Ala Thr Met Ala Val Thr Thr Met Val Thr Arg Ser Lys Glu

1 5 10 15

Ser Trp Ser Ser Leu Gln Val Pro Ala Val Ala Phe Pro Trp Lys Pro

20 25 30

Arg Gly Gly Lys Thr Gly Gly Leu Glu Phe Pro Arg Arg Ala Met Phe

35 40 45

Ala Ser Val Gly Leu Asn Val Cys Pro Gly Val Pro Ala Gly Arg Asp

50 55 60

Pro Arg Glu Pro Asp Pro Lys Val Val Arg Ala Ala Cys Gly Leu Val

65 70 75 80

Gln Ala Gln Val Leu Phe Gln Gly Phe Asn Trp Glu Ser Cys Lys Gln

85 90 95

Gln Gly Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Lys Ala Gln Val Asp Asp Ile Ala

100 105 110

Lys Ala Gly Val Thr His Val Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val

115 120 125

Ser Pro Gln Gly Tyr Met Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser

130 135 140

Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ile Ala Ala Phe His

145 150 155 160

Gly Arg Gly Val Gln Cys Val Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Cys

165 170 175

Ala Glu Lys Lys Asp Ala Arg Gly Val Tyr Cys Ile Phe Glu Gly Gly

180 185 190

Thr Pro Asp Asp Arg Leu Asp Trp Gly Pro Gly Met Ile Cys Ser Asp

195 200 205

Asp Thr Gln Tyr Ser Asp Gly Thr Gly His Arg Asp Thr Gly Glu Gly

210 215 220

Phe Ala Ala Ala Pro Asp Ile Asp His Leu Asn Pro Arg Val Gln Arg

225 230 235 240

Glu Leu Ser Ala Trp Leu Asn Trp Leu Arg Ser Asp Ala Val Gly Phe

245 250 255

Asp Gly Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Pro Ala Val Ala

260 265 270

Arg Met Tyr Val Glu Ser Thr Gly Pro Pro Ser Phe Val Val Ala Glu

275 280 285

Ile Trp Asn Ser Leu Ser Tyr Ser Gly Asp Gly Lys Pro Ala Pro Asn

290 295 300

Gln Asp Gln Cys Arg Gln Glu Leu Leu Asp Trp Thr Arg Ala Val Gly

305 310 315 320

Gly Pro Ala Met Ala Phe Asp Phe Pro Thr Lys Gly Leu Leu Gln Ala

325 330 335

Gly Val Gln Gly Glu Leu Trp Arg Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asn Ala

340 345 350

Ala Gly Leu Ile Gly Trp Ala Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Val Asp

355 360 365

Asn His Asp Thr Gly Ser Thr Gln Lys Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp

370 375 380

Lys Val Met Gln Gly Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Val Pro

385 390 395 400

Cys Ile Phe Tyr Asp His Met Phe Asp Trp Asn Leu Lys Gln Glu Ile

405 410 415

Ser Thr Leu Ser Ala Ile Arg Ala Arg Asn Gly Ile Arg Ala Gly Ser

420 425 430

Lys Leu Arg Ile Leu Val Ala Asp Ala Asp Ala Tyr Val Ala Val Val

435 440 445

Asp Glu Lys Val Met Val Lys Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Val Ser Ser

450 455 460

Val Val Pro Ser Asp Phe His Pro Ala Ala His Gly Lys Asp Tyr Cys

465 470 475 480

Val Trp Glu Lys Ala Ser Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg His Leu

485 490 495

<210> 23

<211> 1488

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 23

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240

caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300

tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360

ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420

ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480

ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540

gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cctggactgg 600

ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660

acgggcgagg ggttcgcggc ggcgcccgac atcgaccacc tcaacccgcg cgtgcagcgg 720

gagctctccg cctggctcaa ctggctcagg tccgacgccg tggggttcga cggctggcgc 780

ctcgacttcg ccaagggcta ctcgccggcc gtcgccagaa tgtacgtgga gagcacgggg 840

ccgccgagct tcgtcgtcgc ggagatatgg aactcgctga gctacagcgg ggacggcaag 900

ccggcgccca accaggacca gtgccggcag gagctgctgg actggacgcg ggccgtcggc 960

gggcccgcca tggcgttcga cttccccacc aagggcctgc tgcaggcggg cgtgcagggg 1020

gagctgtggc ggctgcgcga cagctccggc aacgcggccg gcctgatcgg gtgggcgccc 1080

gagaaggccg tcaccttcgt cgacaaccat gacaccgggt cgacgcagaa gctctggccg 1140

ttcccatccg acaaggtcat gcagggctac gcctacatcc tcacccatcc aggagtcccc 1200

tgcattttct acgaccacat gttcgactgg aacctgaagc aggagatatc cacgctgtct 1260

gccatcaggg cgcggaacgg catccgcgcc gggagcaagc tgcggatcct cgtggcggac 1320

gcggacgcgt acgtggccgt cgtcgacgag aaggtcatgg tgaagatcgg gacaaggtac 1380

ggcgtgagca gcgtggtccc gtcggatttc cacccggcgg cgcacggcaa ggactactgc 1440

gtctgggaga aagcgagcct ccgcgtcccg gcggggcgcc acctctag 1488

<210> 24

<211> 225

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 24

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcg 225

<210> 25

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca 60

ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg 120

cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag 180

tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa 240

aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg 300

ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac 360

atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt 420

tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa 480

taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa 540

gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta 600

aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca 660

agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc 720

tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg 780

tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc acggcagcta cgggggattc 840

ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc 900

cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc 960

cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc 1020

cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt 1080

ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca 1140

cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg 1200

ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt 1260

ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt 1320

ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg 1380

gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt 1440

tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa 1500

atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat 1560

gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta 1620

<210> 26

<211> 1902

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica napus)

<400> 26

attgacaaca tgcatcaatc gaattaattc atttaaacca caatgtacca accaataaga 60

atcaagtgac gcacactaaa cgacagaaag ctcaagaata taaaccccaa ccttctcggc 120

tttctaacat ttcataaacc ttgaaaacac cacacactaa accaacccca gaaccatgga 180

catgaatccc aacactacac ttcctccagg cttccggttt catcctaccg atgaagaact 240

catcgtttac tacctcaaaa accaaaccat gtctagacca tgccctgtct cgatcatacc 300

agaagtcgat atctacaagt tcgacccatg gcagttaccc ggttcgatcc gcttattcat 360

ttctcatgtt aatattatgg ggtttgccgt tgatgttaac tttcttactt gctttccgtt 420

gtaaaacaga gaaaacagag tttggagaaa atgagtggta tttcttcagc ccgagagacc 480

gaaagtatcc aaacggagtc cgtccgaacc gggcagctgt ttccggttat tggaaagcga 540

ccggtacaga caaagccatt tacagcggtt caagtaacgt aggcgtcaag aaagctctcg 600

tcttctacaa aggccgacct cccaagggga tcaaaactga ctggatcatg cacgagtacc 660

gtctcaacga ttcacgtaaa gcatcaacca aacgtaccgg ttcgatgagg gtaagcagag 720

aaaataaaat catgtgttta ttttataaga taatttgtta aaaaaatgtt ttattatgtt 780

tttgtgcagt tggatgaatg ggtactatgt aggatataca agaagagagg agcagggaag 840

cttctagatg agaaagaagg ttacatggat gaagtacaaa tcgatgagac gttaacagtt 900

gttacgaacg aagcaaagcc aagaaatgag gaagagataa cgatgatgac gtcgacgaaa 960

cttccgagga cgtgttcgct cgctcatttg ctagaaatgg attacatggg acccatcgca 1020

cacattttaa caccgttcga tcttcatagt cctgatccaa acattgtgaa cgagtccggt 1080

tggttcggtg atctacagat tagccaagac gagatcatga accatcatcg tcaggctagt 1140

atgtttcagt tttagtgatg gattggaata aagaagaaag aaatgaacat ggaagattgt 1200

aaaatattaa ctagtaaaga accaaattgt gattctttat attttcttgc gtatgaatgt 1260

gaaacgaaaa gatatgttta attaatatta agctgctcag catgttcaaa cgtagtcatg 1320

gagtttattt acgttatact aaccaacaaa caaataatct ttgtgtactg tatggttatt 1380

ttttttaaga aagataacaa aatagagatt gggatgacgt taatttggga tgaaaaagtc 1440

gatggcgtgt ggtggaagga atcaacgcca gatgcaatgc atttatgata cacacttatc 1500

tttgtcgttt atgtagataa cgaatgttac aattgtcatc atcgtacttt aaacctcatt 1560

ttgattcggt ctacgcaaga ctcaaaaaca taatggaacg aaagcaactt atcacaagta 1620

agattacaaa attgtgggcc tttcatgcta tttcagtatt tctgaccggt attggtctac 1680

ctaaaaacgg tttacaaaaa ccaagaggat cagactggtt ttagaaagaa aaaaaaaaca 1740

caccaaagaa gtgaattatt tctacaaaga aggcagcaaa aaaaagatca gtagctacgt 1800

agtagattgc tcacatgctt tggctgacca ccaaacaaac aagatagaga tataaaaact 1860

ctttagtcct taattttcag attgaaagag gcgaacaaaa aa 1902

<210> 27

<211> 1935

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc accttgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60

ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120

gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt ccccggcgcc gccggccacg 180

ccgctccggc cgtgggggac ggccgagccc cgcaagggcg cggacatcct cgtggaggcg 240

ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccgg gcggcgcgtc catggagatc 300

caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360

gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420

acctccggcc ccggggcaac caacctcgtg tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480

gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca tgatcggcac cgacgccttc 540

caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca agcacaatta ccttgtcctt 600

gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct tcctcgcgtc ctcgggccgt 660

cctggcccgg tgctggtcga catccccaag gacatccagc agcagatggc tgtgccagtc 720

tgggacacct cgatgaatct accggggtac attgcacgcc tgcccaagcc acccgcgaca 780

gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac ggcgcccgat tctctatgtc 840

ggtggtggct gctctgcatc tggtgatgaa ttgcgccggt ttgttgagct gaccggcatc 900

ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca gtgatgatcc gttgtccctg 960

cgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg cggtggataa ggctgacctg 1020

ttgcttgcat ttggcgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag ggaaaattga ggcttttgca 1080

agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcgg agattggaaa gaacaagcaa 1140

ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag cttgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200

gaccagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat ggcacaatga gttggaccag 1260

cagaagaggg agtttcctct ggggtacaag acttttggtg aagagatccc accgcaatat 1320

gctattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggggaggcaa tcatcgctac tggtgttgga 1380

cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440

tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgctg cagctggtgc ttctgtggct 1500

aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta gcttcctcat gaacattcag 1560

gagttggcat tgatccgcat tgagaacctc ccggtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620

catttgggta tggttgtgca aatggaggat aggttttaca aggcaaatag ggcgcataca 1680

tacttgggca acccagaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac tattgctaaa 1740

gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc cgccatcaag 1800

aagatgctcg agaccccagg gccatacttg ttggatatca tcgtcccaca ccaggagcat 1860

gtgctgccta tgatcccaag tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga tggtgatggc 1920

aggactatgt attaa 1935

<210> 28

<211> 2737

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 28

tgcaccggac actgtctggt ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct 60

tcggttcctt tgctcctttg cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg 120

aacctttatg cacctgtgga atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt 180

gttgggcatt caaccaccaa aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca 240

atctccccct ttttggtgat tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa 300

ttgaactagt ttgcataagg taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt 360

ttacttgata tgcatggttg ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac 420

ttgttttgtt ttttgcaaat ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc 480

aaaggtatat gaataagatt gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt 540

tcaaatgctt ttcctttgac taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt 600

tcaagagggt tttaaataga tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata 660

taccaattga aaatcaacat accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa 720

aaagtggtgg tgcggtcctt ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaatc 780

gccaaaaacg gagactttgt gagccattta tactttctcc ccattggtaa atgaaatatg 840

agtgaaagat tataccaaat ttggacagtg atgcggagtg acggcgaagg ataaacgata 900

ccgttagagt ggagtggaag ccttgtcttc gccgaagact ccatttccct ttcaatctac 960

gacttagcat agaaatacac ttgaaaacac attagtcgta gccacgaaag agatatgatc 1020

aaaggtatac aaatgagcta tgtgtgtaat gtttcaatca aagtttcgag aatcaagaat 1080

atttagctca ttcctaagtt tgctaaaggt tttatcatct aatggtttgg taaagatatc 1140

gactaattgt tctttggtgc taacataagc aatctcgata tcaccccttt gttggtgatc 1200

cctcaaaaag tgataccgaa tgtctatgtg cttagtgcgg ctgtgttcaa cgggattatc 1260

cgccatgcag atagcactct cattgtcaca taggagaggg actttgctca atttgtagcc 1320

atagtcccta aggttttgcc tcatccaaag taattgcaca caacaatgtc ctgcggcaat 1380

atacttggct tcggcggtag aaagagctat tgagttttgt ttctttgaag tccaagacac 1440

cagggatctc cctagaaact gacaagtccc tgatgtgctc ttcctatcaa ttttacaccc 1500

tgcccaatcg gcatctgaat atcctattaa atcaaaggtg gatcccttgg ggtaccaaag 1560

accaaattta ggagtgtaaa ctaaatatct catgattctt ttcacggccc taaggtgaac 1620

ttccttagga tcggcttgga atcttgcaca catgcatata gaaagcatac tatctggtcg 1680

agatgcacat aaatagagta aagatcctat catcgaccgg tatacctttt ggtctacgga 1740

tttacctccc gtgtcgaggt cgagatgccc attagttccc atgggtgtcc tgatgggctt 1800

ggcatccttc attccaaact tgttgagtat gtcttgaatg tactttgttt ggctgatgaa 1860

ggtgccatct tggagttgct tgacttgaaa tcctagaaaa tatttcaact tccccatcat 1920

agacatctcg aatttcggaa tcatgatcct actaaactct tcacaagtag atttgttagt 1980

agacccaaat ataatatcat caacataaat ttggcataca aacaaaactt ttgaaatggt 2040

tttagtaaag agagtaggat cggctttact gactctgaag ccattagtga taagaaaatc 2100

tcttaggcat tcataccatg ctgttggggc ttgcttgagc ccataaagcg cctttgagag 2160

tttataaaca tggttagggt actcactatc ttcaaagccg agaggttgct caacatagac 2220

ctattcaccc catttgatca cttttttggt ccttcaggat ctaatagtta tgtataattt 2280

agagtctctt gtttaatggc cagatatttc taattaatct aagaatttat gatatttttt 2340

aattttttat catgtctgat gagaattaac ataaaggctc aattgggtcc tgaattaata 2400

atagagtgaa aattaatcca gaggctctat tagaaccttc aattagtaat accaagatat 2460

atataagata gtagagtata gtttaaatgt tggcattgtt cattctttct tttgttattt 2520

aatttatgct ttccacggtg gttagtggtt acttctgaag ggtccaaata atgcatgaag 2580

agtttgagga caagaagtct gccctaaaaa tagcgatgca aaggcatggt gtccaagcca 2640

tacatatagc gcactaattt tatcagcaga acaatggtat ttataggtcc tagtgcccag 2700

gcaacaagag acacgaataa agcatcgatc acgacac 2737

<210> 29

<211> 1488

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 29

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240

caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300

tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360

ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420

ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480

ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540

gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cctggactgg 600

ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660

acgggcgagg ggttcgcggc ggcgcccgac atcgaccacc tcaacccgcg cgtgcagcgg 720

gagctctccg cctggctcaa ctggctcagg tccgacgccg tggggttcga cggctggcgc 780

ctcgacttcg ccaagggcta ctcgccggcc gtcgccagaa tgtacgtgga gagcacgggg 840

ccgccgagct tcgtcgtcgc ggagatatgg aactcgctga gctacagcgg ggacggcaag 900

ccggcgccca accaggacca gtgccggcag gagctgctgg actggacgcg ggccgtcggc 960

gggcccgcca tggcgttcga cttccccacc aagggcctgc tgcaggcggg cgtgcagggg 1020

gagctgtggc ggctgcgcga cagctccggc aacgcggccg gcctgatcgg gtgggcgccc 1080

gagaaggccg tcaccttcgt cgacaaccat gacaccgggt cgacgcagaa gctctggccg 1140

ttcccatccg acaaggtcat gcagggctac gcctacatcc tcacccatcc aggagtcccc 1200

tgcattttct acgaccacat gttcgactgg aacctgaagc aggagatatc cacgctgtct 1260

gccatcaggg cgcggaacgg catccgcgcc gggagcaagc tgcggatcct cgtggcggac 1320

gcggacgcgt acgtggccgt cgtcgacgag aaggtcatgg tgaagatcgg gacaaggtac 1380

ggcgtgagca gcgtggtccc gtcggatttc cacccggcgg cgcacggcaa ggactactgc 1440

gtctgggaga aagcgagcct ccgcgtcccg gcggggcgcc acctctag 1488

<210> 30

<211> 348

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 30

gatctgacaa agcagcatta gtccgttgat cggtggaaga ccactcgtca gtgttgagtt 60

gaatgtttga tcaataaaat acggcaatgc tgtaagggtt gttttttatg ccattgataa 120

tacactgtac tgttcagttg ttgaactcta tttcttagcc atgccaagtg cttttcttat 180

tttgaataac attacagcaa aaagttgaaa gacaaaaaaa aaaacccccg aacagagtgc 240

tttgggtccc aagctacttt agactgtgtt cggcgttccc cctaaatttc tccccctata 300

tctcactcac ttgtcacatc agcgttctct ttcccctata tctccacg 348

<210> 31

<211> 2520

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 31

ttctgaccaa agaagggcgc cgtatccggg agtttgtttc gtcgtcgttt gcttcgtttg 60

acgatgatga accagaacca cacgtactgg aacagaggac gctgcgagtg gctactggct 120

agtaagtggc tagtagtgta gtggtagtag ttaggcaggc aaccttgcct ggtgtgtgtg 180

tgctttgttc attccgttat actagaggct agttgtcagt tggttacctg aagtgaactg 240

atgcagtggt tggtaaaaga aaaaactgag actgatgttt gttagatgcg taagcaagct 300

tgccgtaatt gtggcgtgtt gataaaagtg cggctaagaa atagttaagt gtaatatagt 360

taagctttca attgaagaat ttaccatttg tcactctacc aaaatactag tgctcaaatg 420

ccactctccc aaatattcat tcctaaatgt cacccggacc tcaccactta tgtttgaatg 480

aaaagtgagg ctgacatgtg cgttcggatg gcatttggga atgaaaattt aggagagtgg 540

tatttgagtg ctatcatttt ggtagttgca aatagtaaat tctcccccta ttttctatga 600

cactaaactc agcccaatac tataaattgg actaaaatat attttgaaac ggaggtagta 660

gtataacata tactatgtcc taaggctaaa aaggtgtggg ggcgaagcaa acatttacct 720

agaaaactac gccataatca aaatgtggca ttacaaagtg aagcaactaa ccaaataacc 780

ccaagtaata ttagtaagaa aatcccccac cagatttttc aaattctcaa tcgcaagatc 840

tgtcatctaa aatctacatt ttatctccac cctccaatac aaacaaatag tcaagcccta 900

gccaccactt ccacatcgct cctcctaacc tcaccctgtg ctacgctgaa ccaatcatgc 960

cctctgcacc accaccattt agcctcaatg gcatctccct caacgctggt gatgctcgcc 1020

gacaagcacc tccatcgcca tccctattgc catcatcctc cttgagatgg cttctcatgt 1080

gccatcacca tttcttatgt ccttacgctg ttgtcttcct cgtctctaat ggtcttgtcg 1140

ctgaattcat gaccaccacc acctaaccaa tctagcgagg tgcctgaccc tattctcatc 1200

ttccgtctcg agcaactcac catcacctaa ttacatgatc gggattctct cgccataacc 1260

actatccatt gtcctcgtag ctacgacggc gtcactgtca tctcgttgcc ttcccaatgc 1320

caccgtccac catcaggccg ctatctcctt agcctcactc taagcggagg aacctatgct 1380

ctctctaact ggtcagacca ctgtcaatgt ctctggacat aatcaacatt gttggagagg 1440

cagagagcag aaattgtgag gtagatataa aggttagata tttgtaagat tttcctctta 1500

attttcaatc gaatgtggtt tagggaaatg gatatttttt ttactagact ggcgtatagc 1560

aatccgaaga cgaagaaaga aggaggagga gtaaaacaca aaaaaagaaa ccaaccgtct 1620

taaaacttac aactttacca ttgggcaata caactgcaat gggccaagaa gttaatttaa 1680

agttaagagc aaattcattt ggaccacctt ttgttacaga tgcttcactt tggaccacat 1740

accacccatc tctcttctcg agcatgaaca atctcgatta cattggctcc tactcatcaa 1800

taaactctca catatatatg taaaaccatt catcggtata tgacaagtta tatatggata 1860

aaagagttga ggatgggtaa gaataataac cggtataaag tgagaacatt gataaacatc 1920

gctaataaaa gttcgtctat agtaaaattt actctaaaat taaatcacct aatattttaa 1980

tatttttttg tacaaatgga ccgtttcaat ggggctttat cagatttagt tgagatgcat 2040

acatggtaag caccgtcata atcttgccca agagctgacc caactcatta aaattacgct 2100

tcttttacga cttaataaat caagaagaaa ccattgaaat ccagcctgcc ccgactgtct 2160

cgtaacagaa aaataactca gcaacgacta aattatgatt ttaaaatggc aaaaatatca 2220

aagcacgttc gaaacaatcg caagattggc aagtaaactc tcctgcttgc ttgctcacaa 2280

ccacatcaga tcattgatca atgtttcatc agctcatcac ttctgcatgc atgttatatt 2340

cttctcaggg ctccacaatt tacaaagctg ctcgaagatc ttctttgcag tgcaaagcaa 2400

tctgcaagat tattcaagac atctactctt gatctaccat tgagctaact ccggatatat 2460

aaacagaccg aacgtttcgt cccaggggaa tgtgaaagtt agcgaatttg cccggcgaaa 2520

<210> 32

<211> 2017

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 32

atggcagcac ttggccgcgc gagctcgtcg gcgccggtgc ttgccgccgc cgccgccgtg 60

ctcctctcgc tctgcctcgc cgcgctctcg gaagagcaag gtgcgtaaac gttgcgttgt 120

atctttgcgt tgatgcgtgt tgcgtcgtcg tcgtgttcat ggcgtgcgat ggcgttgtgc 180

agagcaactg gagaacctgc ggttcgtgcg gcacgcgcag gacgcgccgc tggtgtcgag 240

ctacaactac atcgtcatcg gcggcggcac ggcggggtgc ccgctggcgg cgacgctgtc 300

ggagcactcg cgcgtgctgc tgctggagcg cggcggcctg ccgtacgcca acatgtcgag 360

cgagcagcac ttcacggacg cgctggccga cacgtcgccg gcgtcgccgg cgcagcggtt 420

catctcggag gacggcgtgg tgaacgcccg ggcgcgggtg ctcggcggcg ggagctgcct 480

caacgccggg ttctacacgc gggcgagcaa cgagtacgtg cgcgcctccg ggtgggacgc 540

gcggctggtg aactcgtcgt accggtgggt ggagcgctcg ctggtgttcc gccccgacgt 600

gccgccgtgg caggcggcgc tccgcgacgc gctgctcgag gtcggcgtca cgcccgacaa 660

cggcttcacc ttcgaccacg tcaccggcac caagatcggc ggcaccatct tcgacaactc 720

cggccagcgc cacaccgccg ccgacttcct ccgccacgcc cgcccccgcg gcctcaccgt 780

cctcctctac gccaccgtct cccgtatcct cttcaaaagc caaggtacac agctacgatg 840

aaaatggaaa atgtgctgtg cgccgaagaa gcttgacctc acgacggcga gcttttgcca 900

tggcgtgcag acggggtgcc gtacccggtg gcgtacgggg tggtgttctc ggacccgctg 960

ggggtgcagc accgggtgta cctccgcgac ggcgacaaga acgaggtgat cgtgtcggcg 1020

gggacgctgg ggagcccgca gctgctgatg ctgagcggcg tcgggccgca ggcgcacctg 1080

gaggcgcacg gcatcgaggt gatcgtggac caacccatgg tcgggcaggg cgtcgccgac 1140

aacccgatga actcggtgtt catcccgtcg ccggtgccgg tggagctctc cctggtgcag 1200

gtcgtcggca tcacccgctc cggcagcttc atcgaggggg tgagcgggtc ggagttcggc 1260

atgccggtgt cggacggcgc gctccggtgg gcgcgcagct tcgggatgct gtcgccgcag 1320

acggggcagc tcggcacgct gccgccgaag cagaggacgc cggaggcgct gcagcgggcg 1380

gcggaggcga tgatgcggct ggacaggagg gcgttccggg gaggcttcat cctggagaag 1440

atcctcgggc cggtgtcctc cggccacgtc gagctgcgaa ccaccgaccc gagggcgaac 1500

ccgtcggtga cgttcaacta cttccgcgag gcagaggatc tggagcggtg cgtccatggc 1560

atcgagacga tcgagcgggt gatccagtcg cgggccttct ccaacttcac ctacgccaac 1620

gcctccgtcg agtccatctt caccgattcc gccaacttcc ccgtcaacct gctgccgcgc 1680

catgtcaacg actcgcgctc gccggagcag tactgcatgg acaccgtcat gaccatctgg 1740

cactaccacg gcggctgcca tgtcggcgcc gtcgtcgacg acgattaccg ggtgttcggg 1800

gtgcaggggc tcagggtgat cgacagctcc accttcaagt actcccccgg caccaaccct 1860

caggccaccg tcatgatgct cggcaggtaa ctggcatcat tttagctcat gaaagtgcat 1920

tgccatgagt aacaacacac taacagtata gttttcaata tggacactgg gcaggtatat 1980

gggtgtgaag attcagtccg agagatggaa gaaatga 2017

<210> 33

<211> 1412

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 33

tgaacaaaag ataatttcgt ttcaggagca aaaaaatgca tgtaattcaa ggaaaagaaa 60

atgttcaact gtctttagag tttagagtag attttatttg cacccactta atttttactc 120

ttctctagac ataggttcag tatctgcttg ttgattatgt aaccttgaag aagcattgca 180

aaaacaaagc ggaaacttat gttaccaagg gcatgacgaa gaaataaatg gattagattt 240

cattgacact tagaaaatgg aaccagcaaa tcaaggctga aaataattac actagaaact 300

tattttaatg gctttacatg tcgctacata cttaaatcaa tcaaagttgc taccaaagcc 360

atgttcccta aacagagggt tccgggcttt caaacattct taatcttcta tacattgata 420

aaaagtatac ataaaaagaa aacctattaa gatggaaatg ttgaattctc ttaagaaagg 480

cataaaaaat gcagggtaat aaccttttct tgtcatgtcc tacttggttt caacctatat 540

tgctagcaaa attttcacgc tatctataac ctcaggaagc agaatagctc agaatcacta 600

gcaattgtat acttacagat aatcgaaatt catattgtga ggttttcttg gatggctcgg 660

aatgatccac agatgttacc acccatgtct gggaatgacg tacatcctgg caagggtttc 720

accttgccct tacggtcaac acttacaggg tacttcatta ggtggcctct catctcagtc 780

acctcattat caacaaatcg ttcccagttc tgttcaccga tttggcgaac tcgtctcatg 840

cattccatgg tctctggata gttgaagcct tcctcaacca ctccaatatg ctccgcccaa 900

agagacattc tgtacccata aatctacaca tgaaatcagc agatttgaat tagagtgtgg 960

ttctagaaat atcagtcatc ctaaaatagg tatatccctc aaaccaagag acaactagtc 1020

gagattcctt cacagttgta cagggctatt tgaaatatga ctgtacttga tatgcaactt 1080

tttctctatt tctacaaata catttgtatt ttccatacat ttgtagctac aatctggtcc 1140

caccatgatg gatggtgtag atagctctct ttttcttcaa ttaacatatt cttgagaatg 1200

aatggtagct tctctttttt tcttccaatt aacatattct taagagtgag tggtagcttt 1260

ttttagcctt atctaaaaaa atatgattga tagggtacga atttcccttt aggttactct 1320

gccaaaacaa aagataattg caacaaatat atatggctgg attgatgcag tagtgctgaa 1380

caacagacaa taacagtgta aagcaaacga gt 1412

Claims (32)

1.一种繁殖不育系的方法，所述方法包括：

（a）提供第一植株，所述第一植株为不育系，所述不育系含有一个纯合隐性的等位不育基因；

（b）向第二植株中引入下述构建体，所述第二植株含有一个纯合隐性的等位不育基因，所述构建体包含：

（i）第一核苷酸序列，当其在所述第一或第二植株中表达时，能功能性互补所述植株的纯合隐性植物不育性状；

（ii）第二核苷酸序列，其表达抑制所述第二植株中雄性配子的形成或功能，从而使得在含有所述隐性等位基因的所述第二植株中产生的雄配子不含所述构建体；

（iii）第三核苷酸序列，该序列编码产物的表达能用于选择具有所述构建体的植物细胞；以及

（c）用所述第二植株的所述雄性配子使所述第一植株受精，以繁殖保持了所述第一植株纯合隐性等位状态的后代；

其特征在于所述的第二核苷酸序列包含barnase和barstar基因，所述barnase基因由序列如SEQ ID NO:4所示的启动子驱动表达。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的barnase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，barstar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一核苷酸序列为育性恢复基因，选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA或AID1构成的组。

4.权利要求3所述的方法，其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

5.权利要求4所述的方法，其中所述的第四核苷酸序列仅在存在诱导物质或诱导条件时才具有功能。

6.权利要求4所述的方法，其中所述的第四核苷酸序列选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA、AID1、5126、Ms26、Ms22或Ms45的雄性组织调控序列构成的组。

7.权利要求1或2所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列具体为具有除草剂抗性的ALS基因突变体。

8.权利要求7所述的方法，其中所述的ALS基因突变体在水稻中的突变为Trp548、Ala96和/或Ser627突变，优选带有Trp548Cys、Trp548Met、Ala96Val、Ala96Thr和/或Ser627Asn突变。

9.权利要求7所述的方法，其中所述的ALS基因突变体在油菜中的突变为Ala107、Ala190、Trp559和/或Ser638突变。

10.权利要求7所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作地连接，所述第六核苷酸序列为组成型表达启动子。

11.权利要求10所述的方法，其中所述的第六核苷酸序列为35s启动子。

12.一种方法，用于从具有雌性配子和雄性配子的植株产生种子,所述方法包括：

（a）向第一植株中引入下述构建体，所述第一植株含有一个纯合隐性的等位不育基因，所述构建体包含：

（i）第一核苷酸序列，当其在所述第一植株中表达时，能功能性互补所述植株的纯合隐性植物不育性状；

（ii）第二核苷酸序列，其表达抑制所述第一植株中雄性配子的形成或功能，从而使得在含有所述隐性等位基因的所述第一植株中产生的雄配子不含所述构建体；

（iii）第三核苷酸序列，该序列编码产物的表达能用于选择具有所述构建体的植物细胞；

（b）使所述植株自体受精；以及

（c）产生含有所述构建体的种子；

其特征在于所述的第二核苷酸序列包含barnase和barstar基因，所述barnase基因由序列如SEQ ID NO:4所示的启动子驱动表达。

13.权利要求12所述的方法，其中所述第一核苷酸序列为育性恢复基因，选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA或AID1构成的组。

14.权利要求13所述的方法，其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

15.权利要求14所述的方法，其中所述的第四核苷酸序列仅在存在诱导物质或诱导条件时才具有功能。

16.权利要求14所述的方法，其中所述的第四核苷酸序列选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA、AID1、5126、Ms26、Ms22或Ms45的雄性组织调控序列构成的组。

17.权利要求12所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列具体为具有除草剂抗性的ALS基因突变体。

18.权利要求17所述的方法，其中所述的ALS基因突变体在水稻中的突变为Trp548、Ala96和/或Ser627突变，优选带有Trp548Cys、Trp548Met、Ala96Val、Ala96Thr和/或Ser627Asn突变。

19.权利要求17所述的方法，其中所述的ALS基因突变体在油菜中的突变为Ala107、Ala190、Trp559和/或Ser638突变。

20.权利要求17所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作地连接，所述第六核苷酸序列为组成型表达启动子。

21.权利要求20所述的方法，其中所述的第六核苷酸序列为35s启动子。

22.一种繁殖不育系的方法，所述方法包括：

（a）提供第一植株，所述第一植株为不育系，所述不育系含有一个纯合隐性的等位不育基因，在第一植株中引入下述构建体，所述构建体包含：

（i）第一核苷酸序列，能功能性互补所述植株的纯合隐性植物不育性状；

（ii）第二核苷酸序列，其表达抑制雄性配子的形成或功能；

（iii）第三核苷酸序列，该序列编码产物的表达能用于选择具有所述构建体的植物细胞；以及

（b）使引入构建体后的植株自我繁殖，同时产生不含构建体的保持了所述第一植株纯合隐性等位状态的种子和包含所述构建体的种子；

其特征在于所述的第二核苷酸序列包含barnase和barstar基因，所述barnase基因由序列如SEQ ID NO:4所示的启动子驱动表达。

23.权利要求22所述的方法，其中所述的barnase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，barstar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

24.权利要求22或23所述的方法，其中所述第一核苷酸序列为育性恢复基因，选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA或AID1构成的组。

25.权利要求24所述的方法，其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作地相连，所述第四核苷酸序列指导偏好于雄性植物细胞的表达。

26.权利要求25所述的方法，其中所述的第四核苷酸序列仅在存在诱导物质或诱导条件时才具有功能。

27.权利要求25所述的方法，其中所述的第四核苷酸序列选自OsFG2、BrMS2、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA、AID1、5126、Ms26、Ms22或Ms45的雄性组织调控序列构成的组。

28.权利要求22或23所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列具体为具有除草剂抗性的ALS基因突变体。

29.权利要求28所述的方法，其中所述的ALS基因突变体在水稻中的突变为Trp548、Ala96和/或Ser627突变，优选带有Trp548Cys、Trp548Met、Ala96Val、Ala96Thr和/或Ser627Asn突变。

30.权利要求28所述的方法，其中所述的ALS基因突变体在油菜中的突变为Ala107、Ala190、Trp559和/或Ser638突变。

31.权利要求28所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作地连接，所述第六核苷酸序列为组成型表达启动子。

32.权利要求31所述的方法，其中所述的第六核苷酸序列为35s启动子。