CN109566402B - 一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法 - Google Patents

一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种成本低、周期短、重复性好、操作简单、转化效率高的同步获得乌菜雄性不育系与保持系转基因植株的方法。其特征包括以下步骤：(1)盛花期去除不育系与保持系植株已开放的花，用纸袋套住花序并密封。(2)剥除保持系3～5mm大小花蕾的萼片与花瓣。(3)侵染液悬浮农杆菌菌体至OD600＝0.2。(4)侵染液滴至保持系花药上并暗处理2天。(5)采用授粉工具对保持系与不育系花朵柱头进行人工授粉。(6)重复上述操作3次。(7)分别采收不育系和保持系种子。(8)采收的种子进行Kan抗性及GUS染色鉴定，即可获得转基因植株。本方法直接在大田操作，不需要通过组织培养，即可获得转基因乌菜雄性不育系植株。

Description

一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，特别提供了一种成本低、周期短、重复性好、操作简单、效率高的同步获得乌菜雄性不育系与保持系转基因植株的方法。
背景技术
乌菜，原产我国，为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是江淮地区种植面积最大的蔬菜之一。长期以来，乌菜品种改良主要通过品种杂交、远缘杂交等，存在育种年限长、成本高、亲本自交多代易退化、雄性不育转育困难等诸多弊端，并且至今尚无成熟的再生系统。目前，农杆菌介导法、基因枪法、超声波辅助转化法等等均需要再生体系；注射法需要较大的花器；花粉管通道法需要对柱头进行切口，且转化效率很低，这些遗传转化技术限制了乌菜基因工程的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，以解决现有技术中乌菜改良品种成本高、操作复杂等问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种快速同步获得乌菜雄性不育与保持系转基因植株方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、在乌菜盛花期，去除雄性不育系与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系主花序3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药；
步骤2、将含有植物表达载体的农杆菌培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2；
步骤3、利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；
步骤4、2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉；
步骤5、授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；
步骤6、在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；
步骤7、一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；
步骤8、将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株。
进一步，所述步骤2中侵染液各成分为每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES0.5g、乙酰丁香酮0.2mg和L-半胱氨酸0.12g，pH为5.8。
进一步，所述步骤8中筛选培养基由MS、蔗糖、Kan和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、Kan 500mg、琼脂15mg，pH为5.8。
进一步，将步骤4替换为2天后，花蕾开放，利用干净毛笔，轻轻蘸取保持系花药上的花粉，对雄性不育系及保持系花的柱头进行辅助授粉。
本发明的有益效果是：
(1)本发明以大田栽植的乌菜花蕾为侵染对象，较传统采用组织培养进行遗传转化，该方法无需无菌苗及外植体，不经过组织再生即可获得转基因植株，取材方便，方法简便，节约时间。
(2)本发明利用农杆菌侵染未开放花蕾的花药，一个花蕾的花药数量巨大，只需侵染少量花蕾，便可为多个柱头进行授粉，该方法操作简单、工作量小。
(3)本发明将侵染的花药授予雄性不育系与保持系花的柱头上，可获得大量的种子，且遗传转化具有针对性，转化效率高。
(4)本发明利用侵染液，将农杆菌悬浮，室温静置30min后，再侵染花药，该侵染液成分可提高瞬时表达率，为高转化效率奠定了基础。
(5)本发明以侵染未开放花蕾的花药，再进行人工授粉，获得转基因植株，该方法相较现有的农杆菌介导外植体、基因枪、花粉管通道法、花序浸染法等遗传转化方法，农杆菌侵染的花药，与卵细胞完成受精作用，再发育成种子，可避免因组织培养而产生的嵌合体等问题。
(6)本发明将侵染雄性不育保持系花的花粉，授予保持系与雄性不育系植株的柱头上，可同时获得保持系与不育系的转基因植株，不需要先获得保持系转基因植株，再经过杂交等方法，将目的基因转移至雄性不育系植株中，该方法可缩短2～3年的育种时间(杂交选育最少需要2～3年)。
说明书附图
图1为乌菜雄性不育系花(花药败育，无花粉)。
图2为乌菜保持系3～5mm大小的花蕾及完全开放的花。
图3为转基因植株部分叶片(右)与未转基因植株部分叶片(左)的GUS染色结果。
图4为乌菜保持系花药农杆菌侵染前(右)与侵染后(左)的GUS染色结果。
图5为花蕾不同处理方式的GUS染色结果。
图6为不同侵染方式的GUS染色结果。
图7为转基因种子(右)与未转基因种子(左)的GUS染色结果。
图8为乌菜保持系与不育系采用其他方法获得荚果，右侧雄性不育系未获得种子。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出的详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
1)在乌菜盛花期，去除雄性不育系(图1，花药上无花粉)与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药(图2)；
2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min后备用；
3)利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；
4)2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉，或利用干净毛笔，轻轻蘸取保持系花药上的花粉，对雄性不育系及保持系花的柱头进行辅助授粉；
5)授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；
6)在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；
7)最后操作一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；
8)将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株(图3)；
步骤2)中的侵染液由MS、蔗糖、Silwet、MES、As和L-Cys组成，其中每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES 0.5g、乙酰丁香酮(As)0.2mg和L-半胱氨酸(L-Cys)0.12g，pH为5.8；
步骤8)中筛选培养基由MS、蔗糖、Kan和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、Kan500mg、琼脂15mg，pH为5.8。
实验1：
1)在乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18、‘徽乌12’品种的保持系W07-16与雄性不育系Wb11-18盛花期时，去各自主花序上已开放的花；保持系植株主花序上选取约4mm大小的花蕾，利用尖头镊子完全剥离萼片与花瓣，露出花药与柱头；
2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用含有不同As/L-Cys配比(表1)的基本侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min；
3)利用注射器等工具将不同的侵染液滴至保持系W11-07-2与W07-16的花药上，静置30min、避光处理2天后，对花蕾进行GUS染色(图4)，每个处理30～35个花蕾，重复三次，统计瞬时表达率。
表1 不同As/L-Cys配比的侵染液对花药GUS瞬时表达率的影响
Figure BDA0001944306780000041
基本侵染液为MS+50mg/L蔗糖+0.03％Silwet+0.5g/L MES，pH为5.8。
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性花蕾数/农杆菌侵染花蕾总数×100％。
从表1中可知，侵染液中存在As与L-Cys时，可提高瞬时表达率，基本侵染液中添加0.2mg/L的As和0.12g/L的L-Cys时，W11-07-2与W07-16的GUS瞬时表达率最高，分别达到96.12％和90.44％，显著高于其它组合。因此，将该侵染液定位本发明后续实验中的侵染液。
实验2：
1)在乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18、‘徽乌12’品种的保持系W07-16与雄性不育系Wb11-18盛花期时，去各自主花序上已开放的花；保持系植株主花序上选取约4mm大小的花蕾，利用尖头镊子完全剥离萼片与花瓣，露出花药与柱头；
2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，侵染液悬浮菌体至不同OD600值(表2)，室温静置30min；
3)利用注射器等工具将不同浓度的农杆菌侵染液滴至保持系W11-07-2与W07-16的花药上，静置30min、避光处理2天后，对花蕾进行GUS染色，每个处理30～35个花蕾，重复三次，统计瞬时表达率。
步骤2)中的侵染液由MS、蔗糖、Silwet、MES、As和L-Cys组成，其中每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES 0.5g、乙酰丁香酮(As)0.2mg和L-半胱氨酸(L-Cys)0.12g，pH为5.8；
表2 不同农杆菌侵染浓度对花药GUS瞬时表达率的影响
Figure BDA0001944306780000051
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性花蕾数/农杆菌侵染花蕾总数×100％。
从表2中可知，农杆菌侵染浓度OD600＝0.2～0.3时，瞬时表达率最高，W11-07-2与W-07-16分别达到96.12％和90.44％，显著高于其它浓度。因此，将该农杆菌浓度定位本发明后续实验中的农杆菌侵染浓度。
实验3：
1)在乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18、‘徽乌12’品种的保持系W07-16与雄性不育系Wb11-18盛花期时，去各自主花序上已开放的花；保持系植株主花序上选取不同大小的花蕾(表3)，利用尖头镊子完全剥离萼片与花瓣，露出花药与柱头；
2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min；
3)利用注射器等工具将侵染液滴至保持系W11-07-2与W07-16的不同大小的花蕾上，静置30min、避光处理2天后，对花蕾进行GUS染色，每个处理30～35个花蕾，重复三次，统计瞬时表达率。
步骤2)中的侵染液由MS、蔗糖、Silwet、MES、As和L-Cys组成，其中每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES 0.5g、乙酰丁香酮(As)0.2mg和L-半胱氨酸(L-Cys)0.12g，pH为5.8；
表3 不同花蕾大小对花药GUS瞬时表达率的影响
Figure BDA0001944306780000052
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性花蕾数/农杆菌侵染花蕾总数×100％。
从表3中可知，花蕾大小对花药GUS瞬时表达率影响较大，0.1～0.2mm花蕾中的花药尚未发育完全，瞬时表达率较低；而完全开放花的花粉已成熟，侵染效果最差；0.3～0.5mm大小的花蕾，小孢子发育完全，但尚未开放，侵染效率最高。因此，将该大小的花蕾定位本发明后续实验中的农杆菌侵染对象。
实验4：
1)在乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18、‘徽乌12’品种的保持系W07-16与雄性不育系Wb11-18盛花期时，去各自主花序上已开放的花；保持系植株主花序上选取0.3～0.5mm的花蕾，利用尖头镊子对花蕾做不同处理(表4)；
2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min；
3)利用注射器等工具将侵染液滴至保持系W11-07-2与W07-16的不同处理的花蕾上，静置30min、避光处理2天后，对花蕾进行GUS染色，每个处理30～35个花蕾，重复三次，统计瞬时表达率。
步骤2)中的侵染液由MS、蔗糖、Silwet、MES、As和L-Cys组成，其中每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES 0.5g、乙酰丁香酮(As)0.2mg和L-半胱氨酸(L-Cys)0.12g，pH为5.8；
表4 不同花蕾处理方式对花药GUS瞬时表达率的影响
Figure BDA0001944306780000061
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性花蕾数/农杆菌侵染花蕾总数×100％。
从表4及图5中可知，对花蕾未作处理及仅剥开小口处理的瞬时表达率显著低于完全剥离萼片与花瓣的处理，这是因为未做处理及仅剥开小口处理的花蕾，农杆菌无法或很少量的进入花蕾内部。因此，将完全剥离萼片与花瓣的花蕾定位本发明后续实验中的农杆菌侵染对象。
实验5：
1)在乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18、‘徽乌12’品种的保持系W07-16与雄性不育系Wb11-18盛花期时，去各自主花序上已开放的花；保持系植株主花序上选取0.3～0.5mm的花蕾，利用尖头镊子完全剥离萼片与花瓣，露出花药与柱头；
2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min；
3)将侵染液采取不同方式(表5)侵染保持系W11-07-2与W07-16的花蕾上，静置30min、避光处理2天后，对花蕾进行GUS染色，每个处理30～35个花蕾，重复三次，统计瞬时表达率。
步骤2)中的侵染液由MS、蔗糖、Silwet、MES、As和L-Cys组成，其中每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES 0.5g、乙酰丁香酮(As)0.2mg和L-半胱氨酸(L-Cys)0.12g，pH为5.8；
表5 不同侵染方式对花药GUS瞬时表达率的影响
Figure BDA0001944306780000071
涂抹方式需农杆菌约10μL；滴液方式需农杆菌约50μL；浸泡方式，每花蕾蘸有农杆菌大于100μL。
GUS瞬时表达率(％)＝GUS颜色阳性花蕾数/农杆菌侵染花蕾总数×100％。
从表5及图6中可知，不同侵染方式对GUS瞬时表达率影响较大，涂抹与浸泡两种方式的瞬时表达率较低，原因为涂抹方式的菌量较少，不足以侵染完花药；而浸泡方式菌量过多，对花蕾造成了较大的伤害。
实验6：
1)在乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18、‘徽乌12’品种的保持系W07-16与雄性不育系Wb11-18盛花期时，去除雄性不育系与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系3～5mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药；
2)农杆菌EHA105(含有植物表达载体pBI121)培养至OD600＝0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600＝0.2，室温静置30min后备用；
3)利用注射器等工具将侵染液滴至花药上，静置30min后，避光处理2天；处理花蕾数量30个，三次重复；
4)2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉，或利用干净毛笔，轻轻蘸取保持系花药上的花粉，对雄性不育系及保持系花的柱头进行辅助授粉；保持系柱头授粉的花蕾为农杆菌侵染的花蕾，数量为30个；雄性不育系侵染花蕾数量同样为30个；共三次重复；
5)授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止蜜蜂、昆虫等进入；
6)在同一花序上对长至3～5mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；
7)最后操作一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系植株上的种子；
8)将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株；
步骤2)中的侵染液由MS、蔗糖、Silwet、MES、As和L-Cys组成，其中每升MS中加入蔗糖50g、Silwet 300μL、MES 0.5g、乙酰丁香酮(As)0.2mg和L-半胱氨酸(L-Cys)0.12g，pH为5.8；
步骤8)中筛选培养基由MS、蔗糖、Kan和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30g、Kan50mg、琼脂15mg，pH为5.8。
表6 ‘徽乌11’保持系与雄性不育系转化效率
Figure BDA0001944306780000081
转化效率(％)＝阳性植株数/获得种子总数×100％。
表7 ‘徽乌12’保持系与雄性不育系转化效率
Figure BDA0001944306780000082
转化效率(％)＝阳性植株数/获得种子总数×100％。
由表6、7可知，乌菜‘徽乌11’保持系与雄性不育系平均转化效率分别为1.50％、0.80％；‘徽乌12’保持系与雄性不育系平均转化效率分别1.35％、0.97％。
实验7：
采用“一种新的农杆菌介导的大白菜原位转基因方法”(申请号201510462294.4)及Naeem(Optimization of an efficient non-tissue culture transformation methodfor Brassica juncea.Pak J Bot,2016,48:319-324)等方法，利用农杆菌侵染乌菜‘徽乌11’品种的保持系W11-07-2与雄性不育系Wb11-18的花序，统计结果如表8。

Claims (5)

1.一种快速同步获得乌菜雄性不育系与保持系转基因植株方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、在乌菜盛花期，去除雄性不育系与其保持系主花序上已开放的花，选取保持系主花序3~5 mm大小的花蕾，完全剥离萼片与花瓣，使其露出花药；
步骤2、将含有植物表达载体的农杆菌培养至OD600=0.5时，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体至OD600=0.2，室温静置30 min后备用；
步骤3、利用注射器等工具将步骤2所得产物滴至花药上，静置30 min后，避光处理2天；
步骤4、2天后，花蕾开放，利用尖头镊子将保持系的花药取下，对雄性不育系与其保持系花的柱头进行人工授粉；
步骤5、授粉完成后，用纸袋将花序套住并密封，防止昆虫进入；
步骤6、在同一花序上对长至3~5 mm的花蕾重复上述操作3次，用镊子将尚未开放的花蕾去除，对花序进行封顶；
步骤7、一周时间后，去除纸袋，正常田间管理，待种子成熟后，分别收取雄性不育系与其保持系的种子；
步骤8、将收获的种子播种于含有Kan的筛选培养基上，筛选萌发正常、子叶与真叶为绿色的幼苗，取其部分叶片进行GUS染色，GUS染色呈蓝色的即为转基因阳性植株；
所述侵染液成分为每升MS中加入蔗糖50 g、Silwet 300 µL、MES 0.5 g、乙酰丁香酮0.2 mg和L-半胱氨酸0.12 g，pH为5.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤8中筛选培养基由MS、蔗糖、Kan和琼脂组成，其中每升MS中加入蔗糖30 g、Kan 500 mg、琼脂15 mg，pH为5.8。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中所述农杆菌具体为农杆菌EHA105。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中所述植物表达载体具体为pBI121。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，将步骤4替换为2天后，花蕾开放，利用干净毛笔，轻轻蘸取保持系花药上的花粉，对雄性不育系及保持系花的柱头进行辅助授粉。
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